新型H3N8亞型禽流感病毒分離鑒定與雞致病性研究

孫洪磊 佟 琪 李 涵 韓琪祺 劉激雨 李佳琪 楊吉喆 劉金華

(中國農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，北京 100193)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，根據(jù)表糖蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性劃分為16種HA亞型、9種NA亞型。野生水禽是流感病毒的自然宿主，通常攜帶病毒但一般情況不引起發(fā)病。當野禽與家禽接觸時，可能將自然攜帶的病毒傳播給家禽，部分病毒對雞等陸生家禽逐步適應，形成穩(wěn)定流行，并引起家禽發(fā)病。目前，家禽禽流感已經(jīng)成為危害家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展最為重要的傳染病。臨床上，根據(jù)病毒對雞的致病性，分為高致病性禽流感和低致病性禽流感。其中H5NX和H7N9亞型高致病性禽流感在我國家禽中時有發(fā)生，H9N2亞型是最為常見的低致病性禽流感，在肉雞群、產(chǎn)蛋雞群多發(fā)。雖然低致病性禽流感不會直接造成雞群高死亡率，但發(fā)病禽飼養(yǎng)周期延長、料肉比升高，特別是因病毒感染而造成抵抗力下降，容易發(fā)生細菌繼發(fā)感染而造成死亡，進而導致嚴重的經(jīng)濟損失。

本實驗室臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，自2021年12月，我國廣東、福建、江蘇、安徽、河南等地區(qū)雞群中出現(xiàn)一種以眼瞼急性腫脹、出血、伴有呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋雞急性產(chǎn)蛋下降為特征的傳染性疾病。為確定引起臨床雞群發(fā)病的病原，通過對發(fā)病雞群流行病學調(diào)查、病原分離鑒定，診斷為一種新基因型H3N8亞型禽流感病毒。將分離毒株進行了SPF雞回歸試驗，評價了該新型H3N8病毒對雞的感染性和致病性，以期為該病的科學防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒分離與鑒定

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病料采集與處理

2021—2022年對廣東、福建、江西、安徽、浙江、安徽、河南、河北、山東和遼寧等家禽養(yǎng)殖大省開展禽流感病毒監(jiān)測。對臨床表現(xiàn)呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋下降等典型流感發(fā)病特征的發(fā)病雞采集口咽拭子，死亡雞剖檢取氣管、肺臟等組織樣品，置于含1 mL無菌PBS(含抗生素)的離心管中，低溫運送至中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室進行病毒分離與鑒定。拭子樣品渦旋震蕩混勻，組織樣品加入無菌鋼珠研磨混勻，低速離心取上清備用。

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病原核酸鑒定

取口咽拭子重懸液或組織樣品研磨液200 μL，RNA提取試劑盒提取核酸，隨機引物oligo反轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量RT-PCR方法分別檢測新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、A型流感病毒以及H5NX、H7N9、H9N2亞型禽流感病毒。

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禽流感病毒分離鑒定

實時熒光定量RT-PCR檢測流感病毒陽性樣品接種9日齡SPF雞胚，35 ℃孵育48 h，4 ℃過夜后收取尿囊液，通過血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗檢測流感病毒的HA亞型；一步法提取尿囊液RNA，以流感病毒通用引物unit12反轉(zhuǎn)錄為cDNA，霍夫曼引物進行病毒全基因組測序。

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基因遺傳進化分析

將毒株全基因序列在GISAID數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對，將各基因片段參考相關(guān)序列，使用MEGA11軟件繪制鄰近法基因進化樹，設(shè)置1 000次bootstrap重復。

1.2 SPF雞回歸實驗

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試驗設(shè)計

將病毒以10EID/0.2 mL的劑量滴鼻攻毒8只雞，24 h后將5只同居雞放入隔離器中共同飼養(yǎng)，每日觀察臨床癥狀。攻毒后4 d剖檢3只攻毒雞，觀察病理變化，取臟器進行病理組織學檢測和病毒滴度測定。攻毒、同居雞于攻毒后2、4、6、8、10、12和14 d采集口咽拭子和泄殖腔拭子，進行病毒滴度測定。第14天采集雞血，HI試驗檢測血清轉(zhuǎn)陽情況。

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組織病理切片及免疫組化

剖檢雞取鼻甲、氣管、肺臟、哈德氏腺等組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，制作石蠟切片，進行HE染色、免疫組化染色。免疫組化一抗為禽流感病毒NP抗體。

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掃描電鏡樣本處理及觀察

取氣管組織，加入1%的鋨酸固定1 h，棄固定液，緩沖液反復漂洗5次，每次15 min。梯度乙醇脫水(50%、70%、90%和100%)3次，每次15 min，乙酸異戊酯置換2次。將置換后的組織取出放于濾紙上，待部分液體吸收，剪取適當大小濾紙放于樣品干燥籠內(nèi)，并進行標記。光學顯微鏡下將大塊組織分離成不規(guī)則斷面的組織小塊，選取需要觀察的斷面，用導電膠粘合于樣本觀察板上，真空噴鍍金膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

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病毒載量測定

口咽拭子、泄殖腔拭子加入1 mL含抗生素的無菌PBS，渦旋振蕩后低速離心，取上清液進行10倍梯度稀釋備用。取鼻甲、氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、十二指腸、胸腺、法氏囊和哈德氏腺，按照0.1 g/mL加入無菌PBS(含抗生素)，組織勻漿機中充分研磨，低速離心，取上清液進行10倍梯度倍比稀釋，將原液和不同稀釋度樣品以0.2 mL/胚接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種3枚雞胚，接種后于35 ℃孵育48 h，4 ℃過夜后收取雞胚尿囊液測定血凝效價，按Reed-Muench法計算病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學調(diào)查

自2021年12月首先在廣東省某三黃雞群發(fā)生一種以眼瞼腫脹出血、呼吸道癥狀為典型發(fā)病特征的傳染性疾病，隨后陸續(xù)在福建、安徽、江蘇、河南等多個省份三黃雞、麻雞等有色羽肉雞群中發(fā)生類似疫病，發(fā)病雞群多為30日齡以上的三黃雞或麻雞等有色羽肉雞。2022年3月之后，在河北、河南等地區(qū)蛋雞群出現(xiàn)眼瞼腫脹，急性產(chǎn)蛋下降為特征的疫病。該病傳播迅速，同一養(yǎng)殖場內(nèi)雞群一周以內(nèi)均出現(xiàn)發(fā)病癥狀。發(fā)病雞典型癥狀為眼結(jié)膜腫脹、出血，張口呼吸，有呼吸啰音(圖1(a)～(c))；產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率由90%以上急劇下降到30%以下，且蛋殼質(zhì)量差(圖1(d))。剖檢可見氣管黏膜出血，有黏液或干酪樣滲出物(圖1(e))，肺臟淤血實變(圖1(f))，哈德氏腺腫脹出血，部分雞出現(xiàn)心包炎、肝周炎等細菌繼發(fā)感染癥狀。雞群死亡率1%～10%，與飼養(yǎng)管理及繼發(fā)感染密切相關(guān)。多數(shù)發(fā)病雞群前期曾進行高致病性禽流感病毒(H5+H7)三價滅活疫苗(H5N6 H5-Re13株+H5N8 H5-Re14株+H7N9 H7-Re4株)以及H9N2滅活疫苗免疫，且雞群抗體水平>6 log2，表明常規(guī)禽流感疫苗免疫達標。

(a)(b)(c)雞眼瞼腫脹；(d)軟殼蛋；(e)氣管內(nèi)大量黏液；(f)肺臟淤血(a) (b) (c) Eyelid swelling； (d) Soft-shelled eggs; (e) Mucus attached to trachea; (f) Pulmonary congestion 圖1 臨床發(fā)病雞典型表現(xiàn)及剖檢病變Fig.1 Typical clinical and pathological changes of diseased chickens

2.2 新型H3N8病毒分離及鑒定

對收集到的典型發(fā)病雞場送檢樣品進行RT-PCR鑒定，檢測樣品中有15份為A型流感病毒通用引物檢測陽性，而NDV、IBV、H5NX、H7N9和H9N2引物檢測結(jié)果均為陰性。陽性樣品接種SPF雞胚收獲的尿囊液進行血凝試驗，血凝效價均達到1∶64及以上，HI結(jié)果顯示該血凝特性可以被H3亞型AIV血清抑制，不能被H5、H7、H9亞型AIV和NDV血清抑制。將全基因測序結(jié)果進行Blast分析，15株病毒均為H3N8亞型?；蛐蛄猩蟼髦罣ISAID，序列號：EPI_ISL_12951098、12950567、12950247、12949914、12949277、12947104、12946882、12946278、12945954、12945655、12945224、12944913、12944402、12943865和12935439。

2.3 基因遺傳進化分析

對分離的H3N8病毒基因進化分析顯示，病毒

HA

和

NA

基因均形成獨立進化分支，

HA

基因?qū)儆跉W亞禽分支，與2018年分離自廣東的鴨源H3N8病毒A/duck/Guangdong/F1172/2018(H3N2)相似性為96%(圖2)；

NA

屬于北美禽分支，與2020年分離自俄羅斯庫頁島野鳥中的病毒A/common teal/Sakhalin/66c/2020(H3N8)相似性為97%(圖2)。6個內(nèi)部基因均來源于中國雞群中優(yōu)勢流行的G57基因型H9N2亞型病毒，值得注意的是H3N8病毒的內(nèi)部基因分屬于不同進化分支(圖2)，表明病毒在流行過程中可能存在動態(tài)重排。

本研究分離毒株為藍色，用于雞致病性試驗的毒株標記星號，人源H3N8毒株為斜體標記。The H3N8 viruses isolated in the present study are indicated in blue. The viruses used in chicken experiment are marked with asterisk. The human H3N8 viruses are marked as italic.圖2 H3N8亞型禽流感病毒基因進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of H3N8 AIVs

所有H3N8病毒的

HA

裂解位點均為PEKQTR/GLF，無多堿性裂解位點插入。

2.4 新型H3N8病毒對SPF雞致病性

選擇A/chicken/Guangdong/F0103/2022(GD/F0103)、A/chicken/Henan/F0316/2022(HN/F0316)和A/chcken/Anhui/FE12/2022(AH/FE12)三株H3N8病毒進行SPF雞致病性試驗。14 d觀察期內(nèi)所有3株病毒的攻毒雞及同居雞均未出現(xiàn)死亡。感染后3 d，部分攻毒雞、同居雞表現(xiàn)出張口呼吸、炸毛、縮頸、采食量下降等癥狀，攻毒10 d后雞只精神狀態(tài)轉(zhuǎn)為正常。部分攻毒雞及同居雞出現(xiàn)眼睛腫脹、出血病變(圖3(a)和(b))，該癥狀一直持續(xù)至試驗結(jié)束。

(a)(b)眼瞼腫脹；(c)哈德氏腺出血；(d)胸腺出血；(e)盲腸扁桃體腫脹出血；(f)腎臟腫脹(a) (b) Eyelid swelling; (c) Harderian gland hemorrhage; (d) Thymic hemorrhage; (e) Cecal tonsil hemorrhage; (f) Kidney swelling圖3 H3N8病毒感染雞典型臨床表現(xiàn)及剖檢病變Fig.3 Gross lesions in SPF chickens inoculated with the H3N8 AIVs

攻毒后4 d每組取3只攻毒雞進行剖檢，可見眼睛紅腫、哈德氏腺出血(圖3(c))；鼻甲內(nèi)有黏液滲出，氣管黏膜潮紅，有滲出物附著，肺臟輕微淤血；胸腺、盲腸扁桃體出血(圖3(d)和(e))，腎臟腫大(圖3(f))。病理組織學觀察可見眼結(jié)膜上皮細胞壞死脫落，黏膜下層淋巴組織急性增生(圖4(a))；鼻甲黏膜下層淋巴組織增生，大量炎性細胞浸潤，毛細血管擴張充血，部分區(qū)域出血(圖4(c))；氣管纖毛上皮細胞壞死脫落，黏膜下層炎性細胞浸潤，血管充血(圖4(e))；肺臟終末細支氣管周圍大量炎性細胞浸潤，伴有充血出血，導致部分肺房實變(圖4(g))。免疫組化原位檢測可見：哈德氏腺黏膜層細胞(圖4(b))、鼻甲腺體上皮細胞(圖4(d))，氣管纖毛上皮細胞(圖4(f))，肺臟終末細支氣管上皮細胞(圖4(h))有大量流感病毒抗原陽性信號。掃描電鏡觀察氣管黏膜層病變，可見H3N8病毒感染雞氣管纖毛上皮細胞壞死崩解，纖毛大量脫落(圖5)。

左側(cè)為HE染色,(a)(c)(g)放大倍數(shù)為100×，(e)放大倍數(shù)為200×。右側(cè)為免疫組化染色,放大倍數(shù)為400×。(a)哈德氏腺腫脹出血，淋巴小結(jié)增生；(b)哈德氏腺黏膜層細胞陽性；(c)鼻甲黏膜下層炎性細胞浸潤；(d)鼻甲腺體細胞陽性；(e)氣管上皮細胞壞死脫落；(f)氣管上皮細胞陽性；(g)肺臟實變；(h)肺臟終末細支氣管上皮細胞陽性。Left is HE staining. Magnification of (a) (c) (g) is 100× and (e) is 200×. Right is immunohistochemical staining and magnification is 400×. (a) H3N8 virus infection causes Harderian gland swelling and inflammatory changes; (b) Extensive influenza viral NP distribution in the Harderian gland; (c) Infiltration of inflammatory cells in submucosa of turbinate； (d) Extensive influenza viral NP distribution in the turbinate epithelial cells (e)Necrosis of tracheal epithelial cells; (f) Extensive influenza viral NP distribution in the tracheal epithelial cells (g) Severe interstitial pneumonia and bronchopneumonia; (h) Extensive influenza viral NP distribution in the lung epithelial cells.圖4 H3N8病毒感染SPF雞引起的病理組織學變化Fig.4 Histopathological changes of SPF chickens inoculated with the H3N8 AIVs

(a)正常對照雞氣管；(b)H3N8病毒感染雞氣管(a) Trachea of mock infection chicken; (b) Trachea of the H3N8 virus infection chicken圖5 H3N8病毒感染SPF雞氣管掃描電鏡觀察Fig.5 Scanning electron microscope observation for trachea of SPF chicken inoculated with the H3N8 AIVs

2.5 新型H3N8病毒對SPF雞的感染性及傳播性

3株H3N8病毒的攻毒組和同居組雞口咽拭子和泄殖腔拭子中均檢測到排毒，口咽的排毒量顯著高于泄殖腔，排毒期最長為8 d,攻毒組排毒高峰在2～4 d,同居組排毒高峰在4～6 d(圖6)。攻毒后14 d，所有攻毒雞、同居雞均出現(xiàn)抗體轉(zhuǎn)陽。表明H3N8病毒對雞高度適應，主要通過口咽排毒，在雞群中可以高效傳播。

口咽拭子樣品標記為紅色，泄殖腔拭子樣品標記為綠色，與X軸平行的虛線代表最低病毒檢出量，攻毒與同居雞樣品由與Y軸平行的虛線分隔。Red represents oropharyngeal samples, green represents cloacal samples, dashed lines parallel to X axis indicate the lower limit of virus detection, dashed lines parallel to Y axis separate inoculated and contacted groups of each virus.圖6 H3N8病毒對雞的感染性及傳播性Fig.6 Replication and transmission of the H3N8 AIVs in SPF chickens

臟器病毒定量結(jié)果顯示(圖7)，3株病毒均可以在雞的呼吸系統(tǒng)高效復制，鼻甲、氣管和肺臟中均可以檢測到較高的病毒滴度，肺外臟器中哈德氏腺病毒含量最高，脾臟等臟器檢測到較低的病毒滴度。3株 H3N8分離株對雞的致病性存在一定的差異，其中HN/F0316毒株在組織臟器中的分布最廣泛，除呼吸系統(tǒng)和哈德氏腺含毒量較高之外，在脾臟、腎臟、腦、胸腺、法氏囊和十二指腸均檢測到病毒(圖7(c))，說明此毒株具有較廣的組織親嗜性，感染與復制能力較強。

與X軸平行的虛線代表最低病毒檢出量。Dashed lines parallel to X axis indicate the lower limit of virus detection.圖7 H3N8病毒攻毒雞臟器病毒分布及載量Fig.7 Virus distribution and titration of H3N8 AIVs in SPF chicken organs

3 討 論

本研究通過對發(fā)病雞群疫病監(jiān)測，在我國雞群中發(fā)現(xiàn)一種具有致病性的新型H3N8病毒。這種新型禽流感病毒由歐亞分支H3基因、北美分支N8基因與G57基因型H9N2病毒內(nèi)部基因三源重排組成。通過對臨床病例的流行病學調(diào)查以及病毒對SPF雞進行致病、傳播性研究，結(jié)果顯示這種新型三源重排H3N8亞型禽流感病毒對雞高度適應，可在雞上呼吸道高水平復制、排毒，在雞群中高效傳播，造成雞呼吸系統(tǒng)損傷，可引起結(jié)膜炎特征性病變。

H3亞型AIV是我國流行最為廣泛的AIV亞型，以往流行病學調(diào)查顯示，H3亞型病毒主要流行于野生禽類或家鴨中，但多數(shù)為無癥狀帶毒，很少有H3亞型病毒引起禽類發(fā)病的報道，雞群攜帶H3亞型病毒的報道較少，多為活禽市場雞體污染攜帶。表明之前流行的H3亞型AIV主要存在于水禽這一流感病毒自然宿主庫中，對雞等陸生家禽尚未很好適應。本研究發(fā)現(xiàn)，新型雞源H3N8病毒不僅能在雞呼吸系統(tǒng)高效復制、排毒，而且可高效傳播給同居雞，造成病毒在雞群間的快速流行擴散。新型H3N8病毒雖然HA蛋白裂解位點未有多堿性氨基酸插入，但其致病性相比于早期水禽源H3病毒明顯提升，對呼吸系統(tǒng)黏膜造成嚴重損傷，為細菌、支原體繼發(fā)感染提供條件。特別值得注意的是該病毒可造成眼結(jié)膜損傷，這一特征性病變可作為臨床診斷的標準之一。本研究分離到的H3N8病毒多數(shù)來源于三黃雞、麻雞等有色羽肉雞，有色羽肉雞的飼養(yǎng)模式多為開放式或半開放式，這種養(yǎng)殖模式的雞與其他家禽或者野生禽類的接觸頻繁，同時，開放式養(yǎng)殖模式使得雞場的生物安全防護更難執(zhí)行，這為新型流感病毒的流行擴散提供了條件。

相比于早期流行的水禽源H3N8病毒，含有H9N2病毒內(nèi)部基因的新型H3N8病毒對雞致病性增強，表明獲得了H9N2病毒的內(nèi)部基因是導致其對雞感染、致病力增強的主要原因。研究表明，2010年之后流行的G57基因型H9N2病毒對雞的復制、致病性均顯著高于早期流行毒株，尤其是2015年之后流行的G57基因型變異性H9N2病毒，不僅引起雞氣管栓塞、肺臟實變等嚴重呼吸道癥狀，而且造成腎臟等肺外多臟器損傷。其中G1-like

M

基因?qū)τ诖龠M病毒在雞體內(nèi)高效復制具有重要貢獻作用；vRNP復合體基因的變異導致的聚合酶活性提升也是致病性增強的重要機制之一。因此，新型H3N8病毒直接獲得了H9N2病毒的內(nèi)部基因利于其快速適應雞群，而且現(xiàn)有禽流感疫苗免疫抗體對H3亞型病毒均無交叉保護效果，這也利于新型H3N8病毒的快速傳播。

自2013年H7N9流感病毒出現(xiàn)以來，陸續(xù)出現(xiàn)H5N6、H7N4、H10N8、H10N3以及H3N8亞型感染人的新型AIV。值得關(guān)注的是，這些病毒的內(nèi)部基因均為H9N2來源，表明H9N2已成為產(chǎn)生新型病毒的“母病毒”?；蚍治鲲@示，新型H3N8病毒的表面基因形成獨立進化分支，但其內(nèi)部基因來源于多個分支，表明其在流行過程中存在“動態(tài)重排”的特點，這一現(xiàn)象在之前的H7N9和H10N8等病毒中都有發(fā)現(xiàn)。這種與H9N2病毒基因庫的“動態(tài)重排”為病毒適應新環(huán)境提供了極大便利，可使新型病毒短時間內(nèi)快速適應不同區(qū)域、不同養(yǎng)殖環(huán)境，從而形成流行。目前，我國雖然應用滅活疫苗免疫減輕了雞群感染H9N2病毒的發(fā)病癥狀，但是由于單純體液免疫無法有效阻止病毒在雞上呼吸道的感染，H9N2病毒在免疫雞群中仍廣泛流行。因此，研發(fā)可提供上呼吸道局部黏膜免疫的新型禽流感疫苗是防控H9N2病毒的關(guān)鍵措施，也是從根本上控制新型流感病毒產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

特別值得注意的是2022年4月，河南駐馬店市一名4歲男孩感染H3N8病毒；隨后，2022年5月，湖南長沙市一名5歲男孩感染H3N8病毒?；蚍治霰砻鳎嗽碒3N8病毒與雞源病毒高度同源，表明人感染H3N8病毒是由接觸帶毒雞造成的“溢出性”感染。雖然當前H3N8禽流感病毒為零星散發(fā)，鑒于H3亞型禽流感病毒曾引起1968年香港流感大流行流感，因此需要高度重視H3N8禽流感病毒的公共衛(wèi)生威脅。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)一種新型三源重排H3N8亞型禽流感病毒在我國雞群中流行，并引起雞臨床發(fā)病。新型H3N8禽流感病毒對雞高度適應，對呼吸系統(tǒng)致病性較強，且具有感染人類風險，對家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成巨大威脅。應盡快開展系統(tǒng)的流行病學監(jiān)測，及早對病毒的源頭及傳播途徑進行防控，力爭將這種新型病毒消滅在流行早期階段。