芥藍TCP家族全基因組鑒定及表達分析

曾家晶 趙怡嬌 曾東琳 唐為玲 李尊文Gefu WANG-PRUSKI 賴鐘雄 郭容芳*

(1.福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學戴爾豪西大學聯(lián)合試驗室，福州 350002)

TCP

家族基因是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族之一，不僅參與調(diào)控細胞的生長和增殖，在植物體生長發(fā)育的各個階段也起到重要的調(diào)控作用。

TCP

轉(zhuǎn)錄因子基因家族首先發(fā)現(xiàn)于1999年，此基因的命名起初來自3個不同物種的4個基因，分別是對玉米中抑制側(cè)枝生長和雄花形成有重要作用的

TB1

(

Teosinte

branched

1

)基因、金魚草中參與早期的花器官側(cè)生區(qū)域表達并調(diào)控花對稱性的

CYC

(

CYCLOIDEA

)基因、水稻中與細胞發(fā)育相關(guān)的

PCF1

(

Proliferating

cell

factors

1

)基因和

PCF2

(

Proliferating

cell

factors

2

)基因，

TCP

即取其4個基因的首字母而得名。基于對

TCP

基因家族結(jié)構(gòu)域同源性分析，可將

TCP

基因家族分為ClassⅠ(或者

TCP

-

P

)和ClassⅡ(或者

TCP

-

C

)2個類群。ClassⅠ類又名

PCF

亞家族，ClassⅡ則進一步劃分為

CIN

和

CYC

/

TB1

這2個亞家族。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，

TCP

基因家族相繼在擬南芥、水稻、番茄、馬鈴薯、高粱、牡丹和香蕉等物種中得到鑒定，并發(fā)現(xiàn)該家族成員廣泛參與調(diào)控植物胚胎生長、種子萌發(fā)、花粉發(fā)育、葉片發(fā)育、細胞衰老、細胞周期調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律和激素信號傳導等生長發(fā)育過程。在擬南芥屬于ClassⅠ類的成員中，

AtTCP15

不僅參與節(jié)間長度調(diào)控，在葉片發(fā)育方面也起調(diào)控作用；

AtTCP20

與生長發(fā)育、茉莉酸(JA)生物合成及葉片衰老調(diào)控有關(guān)；

AtTCP22

負調(diào)控葉片的衰老，且與

AtTCP15

存在功能上的冗余。在擬南芥屬于ClassⅡ類的成員中，

AtTCP1

能夠調(diào)控

DWARF4

基因的表達，從而影響油菜素類固醇的合成，進而調(diào)控其自身的生長發(fā)育；

AtTCP18

和

AtTCP12

在腋芽中表達，其單突變體能夠減少這2個基因的表達，增加分枝；5個

CIN

-

TCP

基因(

AtTCP2

、

AtTCP3

、

AtTCP4

、

AtTCP10

和

AtTCP24

)均是miR319的靶基因，參與調(diào)控葉片的形態(tài)建成；

CIN

-

TCP

轉(zhuǎn)錄因子通過促進分化來影響葉片形狀。在金魚草中，

CIN

類成員促進了葉片層的組織分化和生長停滯，將發(fā)育程序推向了次級形態(tài)發(fā)生。在擬南芥中，當葉片開始發(fā)育時，連續(xù)的

TCP

活性促進了從初級形態(tài)發(fā)生到細胞擴張和次級形態(tài)發(fā)生階段的轉(zhuǎn)變。此外，玉米Ⅱ組基因

TB1

能夠影響腋分生組織的分化速率，防止低節(jié)間點芽的突起和促進高節(jié)間點雌花序的形成；番茄Ⅱ組基因

SlTCP9

和

SlTCP7

對腋芽的起始和突起起到相似的作用。此外，有研究表明相關(guān)ClassⅡ亞家族成員與ClassⅠ亞家族成員起相互拮抗作用。芥藍(

Brassica

oleracea

)屬于十字花科蕓薹屬一二年生草本植物，甘藍類蔬菜之一，原產(chǎn)于中國南部，是中國的特產(chǎn)蔬菜之一。芥藍品種多樣，葉片和主薹等形態(tài)存在差異，其菜苔柔嫩、鮮脆，味鮮美，以肥嫩的花薹和嫩葉供食用，且芥藍富含胡蘿卜素、維生素C和芥子油苷等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種營養(yǎng)價值很高的功能型蔬菜。芥藍因其獨特風味和營養(yǎng)保健功效而受到人們喜愛?！愎健嫠{因真葉葉脈上長有小葉，貌似菇花而得名，其真葉上長出的小葉形態(tài)特異，俗稱‘菇葉’，屬于廣東潮汕地區(qū)特色品種，后引種到福建。作為蕓薹屬物種的重要蔬菜之一，芥藍在我國南方地區(qū)如福建、廣東和云南等地廣泛栽培。雖然栽培面積較廣，但是其單位面積產(chǎn)出率偏低，導致其總產(chǎn)量和經(jīng)濟效益總體偏低。菜薹產(chǎn)量較低以及口感較差，很大一部分原因是對調(diào)控其食用器官的分子機制尚未可知，這就涉及到與葉片發(fā)育密切相關(guān)的

TCP

轉(zhuǎn)錄因子家族。目前，對于

TCP

基因家族的研究主要集中在模式植物擬南芥、水稻和玉米等物種，在蔬菜中，特別是十字花科蕓薹屬物種，關(guān)于

TCP

基因家族的研究鮮有報道，而關(guān)于葉片發(fā)育的研究則更加不明確。相關(guān)

TCP

家族成員在模式植物中，對葉片生長發(fā)育方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而葉片作為植物重要的組成部位，對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要，影響葉菜類植物產(chǎn)量及風味品質(zhì)的形成?；诖耍狙芯客茰y葉菜類的‘香菇’芥藍中，其葉片發(fā)育大小和葉緣形狀與

TCP

轉(zhuǎn)錄因子家族密切相關(guān)。因此，本研究擬以甘藍基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用生物信息學方法對芥藍中的

TCP

家族成員進行鑒定，明確相關(guān)

BoTCP

成員與葉片發(fā)育之間存在的關(guān)系，進而全面分析

BoTCP

家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序、基因的染色體定位、種內(nèi)種間共線性關(guān)系、系統(tǒng)進化樹、啟動子順式作用元件、蛋白互作關(guān)系、RNA-Seq數(shù)據(jù)和qRT-PCR表達，旨在為深入揭示芥藍

TCP

基因家族的生物學功能及挖掘與葉片發(fā)育相關(guān)成員奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為‘香菇’芥藍，第1批試驗材料種植于福建農(nóng)林大學園藝樓人工培養(yǎng)室內(nèi)。將芥藍種子均勻撒在裝有濕潤珍珠巖的培養(yǎng)皿中(

d

=15 cm)，置于28 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行常規(guī)催芽，前3 d黑暗處理，后7 d光周期設(shè)定為16 h/8 h(Light/Dark)。待子葉完全展開且育苗滿10 d后將芥藍幼苗移入裝有混合基質(zhì)(

V

(草炭土)∶

V

(蛭石)∶

V

(珍珠巖)=3∶1∶1)的培養(yǎng)缽中，放置在人工氣候箱(MGC-450HP-2，上海一恒科技有限公司)，25 ℃(16 h/8 h(Light/Dark))進行光照培養(yǎng)。生長3周后，挑選長勢良好的‘香菇’芥藍植株，對其根、葉緣、葉肉、葉脈和菇葉這5個部位進行取樣，每份樣品取0.1 g，3次生物學重復。

第2批試驗材料種植于福建農(nóng)林大學設(shè)施溫室大棚，前期在催芽與幼苗培養(yǎng)中培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置與第1批試驗材料相同。培養(yǎng)20 d后定植于精整的田間，行距為35 cm，列距為30 cm，田間四周設(shè)置保護行，定期進行日常澆水和施肥等田間管理。在2020年9月—2021年3月期間，挑選長勢良好的‘香菇’植株，進行不同組織部位取樣，取樣分2個時期共10個部位：在抽薹未開花時期(以下簡稱Ⅰ時期)，對根、真葉、花莖和薹葉(1次側(cè)薹)進行取樣；在全部結(jié)莢時期(以下簡稱Ⅱ時期)，對根、真葉、花莖和薹葉進行取樣；在顯微鏡下觀察到種子處于子葉形胚時期(以下亦簡稱Ⅱ時期)，對該時期種子和種莢進行取樣。每份樣品取0.1 g，3次生物學重復，取樣后經(jīng)液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱，以備后續(xù)qRT-PCR表達分析。

1.2 方法

1

.

2

.

1

芥藍

TCP

基因家族成員鑒定

本研究所使用的基因組序列信息和基因組基因結(jié)構(gòu)注釋信息包含甘藍基因組、擬南芥基因組以及水稻基因組，其中甘藍基因組和水稻基因組來源于Ensembl網(wǎng)站(http:∥plants.ensembl.org/)，擬南芥基因組來源于TAIR網(wǎng)站(https:∥www.arabidopsis.org/)。

利用TBtools 1.0695軟件，在Blast界面下設(shè)定參數(shù)E-value:1e-5和Number of hits:500，選取擬南芥

TCP

家族氨基酸序列作為引用序列與甘藍數(shù)據(jù)庫進行同源比對，并結(jié)合NCBI網(wǎng)站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast分析獲得芥藍

TCP

候選成員。將獲得的芥藍

TCP

候選成員序列在NCBI中的CD-Seach進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域比對，手動刪除不包含

TCP

結(jié)構(gòu)域的候選序列。進一步采用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)網(wǎng)站中PFAM domain在線分析候選成員序列的蛋白結(jié)構(gòu)域，從而篩選以確定芥藍

TCP

家族的成員數(shù)目。最后根據(jù)擬南芥

TCP

家族成員在芥藍中的查找同源基因注釋，參考擬南芥現(xiàn)有的命名方法，對芥藍

TCP

家族成員進行命名。

1

.

2

.

2

芥藍

BoTCP

家族成員表達分析參考擬南芥

TCP

家族注釋到芥藍的同源基因功能和TAIR數(shù)據(jù)庫基因的表達量，選定

BoTCP21

和

BoTCP25

用于qRT-PCR試驗分析。

1

.

2

.

3

芥藍

TCP

基因結(jié)構(gòu)及蛋白基序分析采用ExPASy(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采用singalp(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)分析N端信號肽，采用Softberry ProtComp 9.0(http:∥www.softberry.com/berry.phtml)進行亞細胞定位的分析與預測。下載gDNA序列的fasta文件和gff3文件后，進一步獲得CDS序列，進行Blast比對分析；采用GSDS2.0(http:∥gsds.cbi.pku. edu.cn/)對芥藍

TCP

不同成員進行基因結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子和外顯子特征分析并在線作圖；通過MEME(https:∥meme-suite.org/)在線分析

BoTCP

不同成員蛋白質(zhì)保守基序motif，設(shè)置motif檢索數(shù)目為20，并采用TBtools 1.0695軟件對獲得的motif進行可視化分析作圖，再結(jié)合Smart中domain蛋白結(jié)構(gòu)域進行進一步分析。

1

.

2

.

4

芥藍

TCP

基因染色體定位分析利用甘藍基因組中的gff3文件，通過TBtools 1.0695軟件，對芥藍

TCP

家族成員在染色體上的位置分布圖進行繪制。

1

.

2

.

5

芥藍

TCP

基因家族種內(nèi)和種間共線性分析使用TBtools 1.0695中Circle gene view功能構(gòu)建芥藍全基因組種內(nèi)相關(guān)共線性圖譜。為進一步揭示甘藍類作物基因組存在三倍化復雜復制過程，采用MCScanX對芥藍與擬南芥及水稻

TCPs

進行種間共線性分析。

1

.

2

.

6

芥藍

TCP

基因啟動子順式作用元件和轉(zhuǎn)錄起始位點預測采用TBtools 1.0695軟件提取

BoTCP

基因家族成員ATG上游2 000 bp作為啟動子序列，使用BDGP(http:∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線預測各成員啟動子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點；同時使用PlantCARE Database(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線預測各成員啟動子的順式作用元件種類和數(shù)量，在Excel 2016中整理數(shù)據(jù)并繪制透視圖。

1

.

2

.

7

芥藍

TCP

基因蛋白互作預測及系統(tǒng)發(fā)育分析將擬南芥、芥藍和水稻3個物種共86條

TCP

家族氨基酸序列在MEGA X軟件中進行多序列比對，通過建模找出構(gòu)建進化樹的最佳模型，進一步在MEGA X中采用鄰近法(Neighbor-joining)下的JTT模型進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，自展法系數(shù)(Bootstrap)設(shè)置為1 000次。利用String 11.5(http:∥cn.string-db.org)在線軟件，選用K均值聚類算法分析，最低互動評分選擇High confidence(0.700)，對

BoTCP

成員蛋白之間、成員與其他蛋白之間存在的互作關(guān)系進行預測。

1

.

2

.

8

家族基因在芥藍不同光質(zhì)處理下和不同時期種子種莢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)合芥藍在紅藍光質(zhì)處理下RNA-seq數(shù)據(jù)以及處于魚雷形胚時期和子葉形胚早期種子種莢的FPKM值，分析

BoTCP

家族各成員的表達趨勢，使用TBtools 1.0695軟件繪制表達量熱圖。

1

.

2

.

9

家族基因在芥藍不同時期不同組織部位的qRT

-

PCR分析采用TaKaRa試劑盒RNAiso Plus (Code No. 9109)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Code No. RR047A)和TB GreenPremix Ex

Taq

TM Ⅱ (Code No. RR820A)來依次提取芥藍材料總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qRT-PCR反應(yīng)。利用DNAMAN 9.0和Primer Premier 5軟件對所選序列進行同源比對和qRT-PCR引物設(shè)計(表1)。以

BoActin

作為內(nèi)參基因，使用CFX96 Real-Time PCR Detection System儀器進行定量檢測，反應(yīng)體系為20 μL：TB Green Premix Ex

Taq

Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2x)10 μL，ddHO 7.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，每個樣品4次生物學重復。qRT-PCR反應(yīng)程序為:95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)進行擴增。根據(jù)2方法來計算相對表達量，利用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 24軟件中的Duncan法進行顯著性分析(

P

≤0.05),并用Origin 2017軟件制作柱形圖。

表1 芥藍家族相關(guān)基因引物序列
Table 1 Primer sequence of family related genes in Chinese kale

引物名稱Primer name上游引物(5'→3')Forward primer (5'→3')下游引物(5'→3')Reverse primer (5'→3')引物用途Primer useBoActinCTGTGACAATGGTACCGGAATGACAGCCCTGGGAGCATCA內(nèi)參 ActinBoTCP5ACGACGGAGCAATGACTAACGTGGCGGCTATGATGGAAGGqPCRBoTCP14GCTCCACCGTCGTCGTCAATCGTCAGCATCAGCGTTCGTCqPCRBoTCP16CCCTTCAGTCCAGTTACAGTCCCAGGGACCCCTCTGAGAATAAAGCqPCRBoTCP21CAACTTGGCTGATACTCAAACGCCTTGGCTTAGGTTCGGGGTGqPCRBoTCP25GTCCCCTTCAGTCCAGTTACAGTGACCATCGTGCTGCTCCTCTqPCRBoTCP40GAGGTGGTGAATTATCGGTTGGGGTGTCGGACGAAGAGTGTAGCqPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍TCP基因家族成員鑒定及其在葉片不同部位的qRT-PCR分析

利用生物信息學方法，最終在芥藍中鑒定得到40個具有完整保守結(jié)構(gòu)域的

BoTCP

家族成員，參考擬南芥

TCP

家族成員命名方法，將其依次命名為

BoTCP1

～

BoTCP40

。參考擬南芥同源

TCP

基因注釋及擬南芥數(shù)據(jù)庫基因的相對表達量，初步選取

BoTCP21

和

BoTCP25

基因，采用qRT-PCR分析

BoTCP21

和

BoTCP25

在葉片不同部位(圖1(a))的相對表達量(圖1(b))。

BoTCP21

和

BoTCP25

均在葉片中大量表達，但兩者在真葉不同部位的表達模式存在差異。

BoTCP21

在真葉葉肉、葉脈和‘菇葉’中高表達，在葉緣中表達量較低，而

BoTCP25

則在葉緣中高表達，在葉肉、葉脈和‘菇葉’中表達量較低。表明這2個

BoTCP

成員與葉片發(fā)育密切相關(guān)且在葉片的近軸端和遠軸端的表達趨勢相反，在葉片生長發(fā)育的過程中，二者是相互協(xié)同還是拮抗作用，是否還有其他的

BoTCP

家族成員參與葉片生長發(fā)育過程，有待進一步研究。

圖(b)內(nèi)不同小寫字母代表顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters in the graph (b) represent significant differences (P<0.05).圖1 ‘香菇’芥藍取樣示意圖及相關(guān)BoTCP成員在葉片不同部位的相對表達量Fig.1 ‘Xiang Gu’ Chinese kale sampling diagram and relative expression of relevant BoTCP members in different parts of leaves

2.2 芥藍TCP基因家族成員蛋白基本理化性質(zhì)分析

通過分析芥藍

TCP

家族成員蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)(表2)，該家族的氨基酸長度在188～473 aa之間，其中氨基酸序列最短的是

BoTCP22

，最長的是

BoTCP18

；分子量介于3 222.52～50 857.24 ku，其中分子量最小的為

BoTCP17

，最大的為

BoTCP18

；等電點在5.24～10.48范圍內(nèi)，其中等電點最低的是

BoTCP6

，最高的是

BoTCP10

，有15個基因的等電點小于7.00，呈酸性，有1個等于7.00，呈中性，有24個大于7.00，呈堿性；

TCP

基因編碼蛋白的氨基端均無信號肽，屬于非分泌蛋白；親水性數(shù)值顯示都為負值，預測40個

BoTCP

基因編碼蛋白均為親水性蛋白；根據(jù)不穩(wěn)定分析結(jié)果顯示，

BoTCP13

、

BoTCP22

和

BoTCP37

這3個基因編碼蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)低于40，可能為穩(wěn)定蛋白，其余可能是不穩(wěn)定蛋白；亞細胞定位預測結(jié)果顯示，絕大部分的

BoTCP

家族成員定位在細胞核，各有1個成員定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞質(zhì)和液泡；參考擬南芥同源基因注釋，有19個

BoTCP

成員屬于

PCF

亞家族，13個成員屬于

CIN

類亞家族，其他8個成員屬于

CYC

類亞家族。

表2 芥藍基因家族成員蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)
Table 2 Basic physical and chemical properties of gene family proteins in Chinese kale

基因名稱Genename基因IDGeneID氨基酸數(shù)Numberof aminoacids分子量Molecularweight理論等電點Theoreticalpl平均親水性Gravy不穩(wěn)定指數(shù)Instabilityindex亞細胞定位Subcellularlocalization擬南芥同源基因Arabidopsishomologousgene類別ClassBoTCP1Bo00998s02028830 999.505.89-0.63451.05NCAtTCP19PCFBoTCP2Bo1g01952035839 146.657.91-0.84941.26NCAtTCP2CINBoTCP3Bo1g11749042648 744.226.88-0.89051.09NCAtTCP18CYCBoTCP4Bo1g12983035838 633.827.00-0.65468.00NCAtTCP3CINBoTCP5Bo2g00904022523 567.399.29-0.38849.71NCAtTCP21PCFBoTCP6Bo2g05564034639 407.665.24-0.86651.59NCAtTCP1CYC/TB1BoTCP7Bo2g06125034539 044.637.71-0.84251.92NCAtTCP12CYC/TB1BoTCP8Bo2g06439031433 286.407.43-0.67759.42NCAtTCP15PCFBoTCP9Bo2g07521037138 832.988.97-0.65444.42NCAtTCP22PCFBoTCP10Bo2g16097023024 924.2110.48-0.50353.01NCAtTCP7PCFBoTCP11Bo2g16124030133 765.066.35-0.80847.50NCAtTCP5CINBoTCP12Bo3g00467024427 292.216.40-0.62055.63NCAtTCP17CINBoTCP13Bo3g00485023524 258.1910.18-0.35838.63NCAtTCP21PCFBoTCP14Bo3g03890029330 942.339.71-0.24855.77NCAtTCP9PCFBoTCP15Bo3g05546032035 752.396.56-0.81854.77NCAtTCP13CINBoTCP16Bo3g06654040444 097.587.49-0.79168.45NCAtTCP4CINBoTCP17Bo3g0715602873 222.527.27-0.70457.12NCAtTCP18CYC/TB1BoTCP18Bo3g13472047350 857.246.66-0.87665.35NCAtTCP14PCFBoTCP19Bo3g14776030734 402.567.80-0.96964.52NCAtTCP24CINBoTCP20Bo4g02486033235 273.949.44-0.27758.57ERAtTCP9PCFBoTCP21Bo4g05368034938 687.396.44-0.87151.32CPAtTCP10CINBoTCP22Bo4g14076018820 205.639.20-0.64528.70NCAtTCP6PCFBoTCP23Bo5g06258031735 046.127.81-0.91550.83NCAtTCP24CINBoTCP24Bo5g11741041147 348.208.90-0.87854.55NCAtTCP18CYC/TB1BoTCP25Bo5g12750040444 277.888.02-0.80764.90NCAtTCP3CINBoTCP26Bo5g15284039043 898.389.12-0.46352.29VCAtTCP13CINBoTCP27Bo6g09527031133 366.407.43-0.73953.95NCAtTCP15PCFBoTCP28Bo6g09904035440 233.905.67-0.79844.91NCAtTCP1CYC/TB1BoTCP29Bo6g10367035940 875.565.41-0.86761.65NCAtTCP1CYC/TB1BoTCP30Bo6g10724032336 445.128.82-0.76360.43NCAtTCP12CYC/TB1BoTCP31Bo6g11029031934 037.097.08-0.77161.49NCAtTCP15PCFBoTCP32Bo6g11453035637 338.296.64-0.62846.90NCAtTCP23PCFBoTCP33Bo7g08412031833 475.996.95-0.66153.31NCAtTCP20PCFBoTCP34Bo7g09779024125 956.989.69-0.58155.64NCAtTCP7PCFBoTCP35Bo7g09826036440 441.986.35-0.89252.72NCAtTCP5CINBoTCP36Bo7g10596038241 987.657.05-0.93142.80NCAtTCP2CINBoTCP37Bo9g00811027429 032.245.64-0.49138.77NCAtTCP20PCFBoTCP38Bo9g01426021623 119.849.38-0.47545.17NCAtTCP7PCFBoTCP39Bo9g05209039241 170.066.05-0.67152.48NCAtTCP8PCFBoTCP40Bo9g17449023624 818.567.99-0.45446.81NCAtTCP21PCF

注：NC，細胞核；ER，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；CP，細胞質(zhì)；VC，液泡。
Note: NC, nucleus； ER, endoplasmic reticulum; CP, cytoplasm; VC, vacuole.

2.3 芥藍TCP基因家族基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白基序組成分析

利用基因組信息和蛋白質(zhì)編碼序列從基因結(jié)構(gòu)角度分析芥藍

TCP

家族的進化過程(圖2(a))。結(jié)果表明40個家族成員中大部分成員基本不存在內(nèi)含子，僅以1個外顯子為主，占總數(shù)的82.5%；其中有4個家族成員(

BoTCP7

、

BoTCP11

、

BoTCP26

和

BoTCP28

)具有2個外顯子，占總數(shù)的10.0%，僅有1個家族成員(

BoTCP17

)包含有3個外顯子，占總數(shù)的2.5%，有2個

TCP

家族成員(

BoTCP3

和

BoTCP24

)具有4個外顯子，占總數(shù)的5.0%。有趣的是，在擬南芥中，其

TCP

基因家族只含有1個外顯子的成員約占總數(shù)的82.0%，占比上趨近于芥藍，不同

BoTCP

成員外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)數(shù)量分布不同，可能是物種進化過程中由于內(nèi)含子的插入或丟失造成的，進而很大程度上會導致其基因功能的分化和表達調(diào)控方式的多樣性。通過上述結(jié)果，預測擬南芥和芥藍的

TCP

家族成員在基因功能的表達上具有一定的相似性。為了解芥藍

TCP

家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域特點，利用MEME在線軟件預測分析，設(shè)定搜索出20個motif，結(jié)果顯示40個芥藍

TCP

家族成員氨基酸序列中均包含motif1，大部分序列(25條以上)包含motif2～4和motif15這4個motif，表明這5個基序在芥藍TCP蛋白中較為保守。由編碼蛋白保守基序標識和motif基本信息所示(圖2(b))，其中最保守的基序motif1的氨基酸長度為50，數(shù)量為40，再結(jié)合domain結(jié)構(gòu)域(圖2(c))進一步分析可知，motif1即為

TCP

結(jié)構(gòu)域。各成員含有motif的數(shù)量差異較大，最少含有2個motif，且總是以motif1與motif2、motif1與motif3組合的形式出現(xiàn)在9個芥藍

TCP

家族成員蛋白序列中；最多含有7個motif，其中

BoTCP4

、

BoTCP16

、

BoTCP25

編碼蛋白與

BoTCP28

、

BoTCP29

編碼蛋白具有的motif基序種類和排列順序一致；某些motif保守基序只在特定的成員氨基酸序列中出現(xiàn)，motif10只在

BoTCP8

、

BoTCP27

和

BoTCP31

這3個成員中出現(xiàn)，motif14也只在

BoTCP4

、

BoTCP16

和

BoTCP25

中出現(xiàn);另外同一個家族成員編碼的蛋白序列中，只有motif2存在2次重復出現(xiàn)的情況，體現(xiàn)在

BoTCP14

和

BoTCP39

編碼的蛋白質(zhì)序列中，預測二者可能編碼相似的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本研究還發(fā)現(xiàn)，某些motif的出現(xiàn)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，如motif2總是與motif1相鄰并在其后出現(xiàn)，motif3也總是與motif1相鄰并在其前出現(xiàn)，推測可能包含該序列特征的成員屬于同一個亞家族。

圖2 芥藍TCP家族基因結(jié)構(gòu)(a)、保守基序(b)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域(c)分布圖Fig.2 The distribution map of the gene structure (a), conserved motif (b) and protein conserved domain (c) of the TCP family of Chinese kale

2.4 芥藍TCP基因家族染色體定位

利用甘藍基因組gff3文件，通過TBtools軟件進行染色體定位結(jié)果可視化，獲得芥藍

TCP

家族成員染色體定位信息(圖3)。40個芥藍

TCP

家族成員中除了

TCP1

，其他39個成員均能精準定位在組裝好的9條染色體上的第1、2、3、4、5、6、7及第9條上且不均勻分布。其中第3條染色體上分布最多，含有8個成員，占比20.0%；第1條和第4條分布最少，各有3個成員，各占比7.5%；第5、7和9條染色體各包含4個成員，各占比10.0%；第6條染色體分布有6個成員，占比15.0%；第2條染色體含有7個成員，占比17.5%。除此之外，從圖中可以明顯看出存在小型的基因簇，第2條染色體上的

BoTCP10

和

BoTCP11

、第3條染色體上的

BoTCP12

和

BoTCP13

以及第7條染色體上的

BoTCP34

和

BoTCP35

都相聚在同一位點上，預測這3條染色體的2個成員在功能上具有相似性。

圖3 芥藍TCP家族成員染色體定位圖Fig.3 Chromosome mapping of TCP family members of Chinese kale

2.5 芥藍TCP基因家族種內(nèi)和種間共線性分析

在進化過程中，染色體通過節(jié)段復制、串聯(lián)復制和全基因組復制在不同基因組中發(fā)生擴增有助于擴大基因家族。采用MCScanX軟件對

BoTCPs

進行共線性關(guān)系分析(圖4(a))，發(fā)現(xiàn)該家族存在24對重復基因，其中在第2、3和7條染色體上各含有1對串聯(lián)重復基因，分別為

BoTCP10-BoTCP11

、

BoTCP12-BoTCP13

和

BoTCP34-BoTCP35

，其余21對基因為染色體片段重復基因。由于甘藍類作物基因組存在三倍化復雜復制過程，利用擬南芥基因組和水稻基因組與甘藍基因組進一步分析芥藍與擬南芥同源基因、水稻

TCP

家族的共線關(guān)系。如圖4(b)所示，共有8條染色體上的32個

BoTCP

基因與5條染色體上的19個

AtTCP

基因構(gòu)成37對共線性關(guān)系。對擬南芥

TCP

基因與芥藍的共線基因統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，68%的

AtTCP

基因在芥藍中有2個以上共線基因，其中

AtTCP4

在芥藍中有9個共線基因，表明

BoTCP

基因家族在蕓薹屬多倍化事件中得到顯著的擴張。僅有4條染色體上的5個

BoTCP

基因與4條染色體上的5個

OsTCP

基因存在6對共線性關(guān)系，表明芥藍與雙子葉植物擬南芥的親緣關(guān)系更近，與單子葉植物水稻的親緣關(guān)系更遠。此外，5個成員(

BoTCP19

、

BoTCP23

、

BoTCP31

、

BoTCP33

和

BoTCP34

)在芥藍與擬南芥基因組共線性及芥藍與水稻基因組共線性中均有發(fā)現(xiàn)，推測這些成員在單子葉與雙子葉植物祖先分化前已經(jīng)完成進化。

圖4 芥藍TCP家族成員種內(nèi)(a)及與擬南芥和水稻的種間(b)共線性關(guān)系圖Fig.4 Intraspecific (a) and interspecific (b) collinear relationships amongTCP family members in Chinese kale and Arabidopsis and rice

2.6 芥藍TCP基因家族系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建分析

為研究芥藍與擬南芥和水稻

TCP

之間的進化關(guān)系，采用這3個物種的TCP氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5)。參考擬南芥中

TCP

基因分類，再結(jié)合進化樹中成員聚類情況，可初步將

TCP

基因家族分為3類，即

PCF

亞家族、

CYC

亞家族和

CIN

亞家族。在

PCF

亞家族中，芥藍、擬南芥和水稻各有成員19、12和14個；在

CYC

亞家族中，芥藍、擬南芥和水稻各有成員8、4和2個；在

CIN

亞家族中，芥藍、擬南芥和水稻各有成員13、8和6個。從聚類情況來看，芥藍

TCP

家族成員將近50%屬于

PCF

亞家族，同一類的

TCP

基因家族成員可能行使相似的功能。

圖5 芥藍、水稻和擬南芥中TCP家族成員的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of TCP family members in Chinese kale, rice and Arabidopsis

2.7 芥藍TCP基因家族啟動子順式作用元件和轉(zhuǎn)錄起始位點分析

分析芥藍

BoTCP

基因啟動子序列(ATG上游2 000 bp)，預測存在的核心啟動子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點。將芥藍

TCP

家族成員啟動子分別命名為：

BoTCP1p

～

BoTCP40p

。轉(zhuǎn)錄起始位點預測結(jié)果表明：40個芥藍

TCP

家族成員中除了

BoTCP22p

、

BoTCP24p

和

BoTCP25p

這3個成員出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始起點缺失外，其余37個成員均包含轉(zhuǎn)錄起始起點；其中

BoTCP9p

、

BoTCP14p

和

BoTCP30p

僅有1個轉(zhuǎn)錄起始位點，

BoTCP21p

轉(zhuǎn)錄起始位點最多，達到6個，且得分都≥0.88，其余33個成員均具有多個轉(zhuǎn)錄起始位點?？傮w而言，轉(zhuǎn)錄起始位點數(shù)量和得分存在較大差異。為深入了解

BoTCP

家族成員之間對環(huán)境脅迫的響應(yīng)和激素的應(yīng)答調(diào)控功能，對其基因上游2 000 bp的啟動子序列進行順式作用元件預測(圖6)。結(jié)果表明：在預測到的15種響應(yīng)元件中，所有家族成員均具有光響應(yīng)元件，且各成員含有的光響應(yīng)元件在種類和數(shù)量上存在較大差異；55%以上的基因成員含有厭氧誘導響應(yīng)元件、脫落酸和茉莉酸甲酯激素應(yīng)答元件；40%的基因成員響應(yīng)生長素和乙烯的調(diào)控；20%的基因成員含有赤霉素、水楊酸、玉米膠蛋白代謝、低溫、晝夜節(jié)律、防御脅迫和干旱脅迫下

MYB

結(jié)合位點響應(yīng)元件，表明這些基因可能具有響應(yīng)以上元件的作用；只有4個(

BoTCP1p

、

BoTCP6p

、

BoTCP13p

和

BoTCP27p

)成員包含響應(yīng)分生組織表達元件，推測這些成員在芥藍分生組織表達方面發(fā)揮重要作用；此外，也只有4個(

BoTCP1p

、

BoTCP5p

、

BoTCP12p

和

BoTCP40p

)成員包含光脅迫下

MYB

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，暗示了在特定條件下，芥藍

TCP

家族基因可能受

MYB

結(jié)合因子調(diào)控作用；值的注意的是，只有

BoTCP1p

基因同時含有分生組織表達和光脅迫下

MYB

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，猜測

BoTCP1p

基因在芥藍中協(xié)同調(diào)控分生組織表達和

MYB

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

圖6 芥藍TCP基因家族啟動子順式作用元件分布Fig.6 Distribution of cis-acting elements in the promoters of the TCP gene family of Chinese kale

2.8 芥藍TCP基因家族編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)互作預測分析

利用String 11.5在線軟件對芥藍

TCP

基因編碼蛋白之間以及與其他蛋白之間進行蛋白互作預測(圖7)。聚類結(jié)果顯示，除BoTCP25和BoTCP26蛋白外，剩余38個芥藍TCP蛋白之間均可以發(fā)生不同程度的相互作用。BoTCP蛋白既可以與自身成員之間發(fā)生互作，也可以和其他蛋白之間發(fā)生互作。BoTCP蛋白與其他蛋白存在互作關(guān)系并形成3個分支，第1支(紅色區(qū)域)與ARF4和Rab發(fā)生互作，主要與生長素合成運輸和細胞增殖功能相關(guān)；第2支(綠色區(qū)域)與Cpn60、P450、Methyltyansf和Prenyltrans等存在互作，這些蛋白依次與葉綠體分子伴侶蛋白、植物細胞色素、甲基化作用和異戊烯酶合成等功能相關(guān)；第3支(青色區(qū)域)與CCT、PDB、PPR-4和DUF1313發(fā)生互作，這些蛋白依次與光周期響應(yīng)、過氧化物酶、胚胎發(fā)育和未知結(jié)構(gòu)域蛋白功能相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)尤其在青色區(qū)域和綠色區(qū)域中，TCP蛋白之間和其他多種蛋白之間發(fā)生互作的關(guān)系最強，預測與TCP蛋白互作關(guān)系較強的蛋白可能與TCP具有功能相關(guān)性。

K均值聚類下分為3支：第1支(紅色區(qū)域)、第2支(綠色區(qū)域)和第3支(青色區(qū)域)。K-means clustering is divided into three branches: the first branch (red area)， the second branch (green area) and the third branch (cyan area).圖7 芥藍TCP基因家族編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)互作預測Fig.7 Interacting protein prediction of TCP gene family in Chinese kale

2.9 TCP家族基因在芥藍不同光質(zhì)處理下和不同時期種子種莢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

結(jié)合芥藍在紅藍光質(zhì)處理下以及處于魚雷形胚時期和子葉形胚早期種子種莢的FPKM值，生成聚類熱圖(圖8(a)和(b))分析

BoTCP

家族基因的表達模式。結(jié)果顯示其表達模式可分為六類：第一類在紅藍光處理下和子葉形胚的種子表達量較高(

BoTCP4

和

BoTCP16

)；第二類在紅藍光處理下和子葉形胚的種莢表達量較高(

BoTCP5

和

BoTCP13

)；第三類在紅光處理下表達量較高(

BoTCP14

)；第四類在紅藍光處理下表達量較高(

BoTCP18

和

BoTCP21

)；第五類除了在魚雷形胚的種子中表達量較低，其他階段都有較高表達量(

BoTCP25

和

BoTCP36

)；第六類中

BoTCP40

在每個階段都有較高的表達量?？傮w而言，

TCP

家族成員在芥藍不同表達模式中存在協(xié)同作用，推測其可能存在功能冗余和分化。

(a)中B為藍光處理，R為紅光處理；(b)中PC和SC為魚雷形胚種子種莢，PD和SD為子葉形胚種子種莢。In figure (a), B is blue light processing and R is red light processing; In Figure (b), PC and SC are torpedo-shaped embryo seed pods, PD and SD are cotyledon embryo seed pods.圖8 BoTCP家族成員在芥藍不同光質(zhì)處理(a)和不同時期種子種莢(b)下表達量熱圖Fig.8 BoTCP family members expressed caloric maps under different light quality treatments (a) and seed pods (b) at different times in Chinese kale

2.10 TCP家族基因在芥藍不同時期不同組織部位的qRT-PCR分析

為了進一步了解

TCP

家族基因在芥藍不同時期不同組織部位的表達模式，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下的熱圖分析，

BoTCP

家族差異基因有6種表達模式。每種模式下各選擇1個成員，結(jié)合PCR表達量驗證，最終選取

BoTCP5

、

BoTCP14

、

BoTCP16

、

BoTCP21

、

BoTCP25

和

BoTCP40

基因，以‘香菇’芥藍在不同時期不同組織部位(Ⅰ時期的根、真葉、花莖和薹葉及Ⅱ時期的根、真葉、花莖、薹葉、種子和種莢)為試驗對象，利用qRT-PCR檢測以上6個成員的相對表達量(圖9)。結(jié)果顯示，

BoTCP5

、

BoTCP21

、

BoTCP25

和

BoTCP40

在種子中高表達，尤其是

BoTCP21

，其在種子中的表達量遠高于其他成員，這和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達量趨勢一致，進一步驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性。其中

BoTCP5

在種莢和花莖也具有較高的表達量，

BoTCP21

和

BoTCP25

還在真葉和薹葉中具有較高的表達量，而

BoTCP40

還在薹葉中高表達,

BoTCP14

在開花結(jié)莢的植株根部表達量較高,而

BoTCP16

則在抽薹植株的根部表達量最高。以上結(jié)果表明，芥藍中的

TCP

廣泛參與了植株的形態(tài)建成和器官發(fā)育且不同

BoTCP

家族成員在表達模式上存在時空特異性。

圖內(nèi)不同小寫字母代表顯著差異(P≤0.05)。Different lowercase letters in the graph represent significant differences (P≤0.05).圖9 TCP家族成員在‘香菇’芥藍不同時期不同組織部位的相對表達量Fig.9 Relative expression of TCP family members in different tissues of ‘Xiang Gu’ Chinese kale in different periods

3 討論與結(jié)論

TCP

基因家族有重要且廣泛的調(diào)控作用，其蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。目前，

TCP

基因家族已經(jīng)陸續(xù)在馬鈴薯、高粱、菠蘿和玉米中分別被鑒定出43、27、9和43個成員。本研究通過序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析，從甘藍基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出40個

BoTCP

基因。相比模式作物擬南芥，甘藍類蕓薹屬作物經(jīng)歷了全基因組三倍化復制事件，通過種內(nèi)和種間共線性發(fā)現(xiàn)，芥藍與擬南芥的同源共線性基因?qū)?shù)不太吻合三倍體復制化進程，表明甘藍蕓薹屬作物在漫長的進化過程中發(fā)生過基因丟失。然而由于芥藍

TCP

成員存在串聯(lián)重復和片段復制現(xiàn)象，總體上

BoTCP

基因家族發(fā)生了基因擴張現(xiàn)象，這也表明

BoTCP

基因家族有著更加精細的功能。前人研究發(fā)現(xiàn)，在模式植物擬南芥中

TCP

家族成員廣泛調(diào)節(jié)葉片發(fā)育和種子的形態(tài)建成。金魚草

CIN

基因突變導致葉邊緣形態(tài)發(fā)生改變，同時對葉子大小也有重要的調(diào)控作用。

AtTCP24

、

AtABAP1

和

AtORC1

通過形成復合物抑制葉片發(fā)育過程中DNA的復制；

AtTCP4

直接激活

HD

-

ZIP

轉(zhuǎn)錄因子

HAT2

的表達，以調(diào)控生長素響應(yīng)，使葉片細胞分裂結(jié)束從而導致葉片減小。除了

CIN

類成員，ClassⅠ基因也參與調(diào)控葉的發(fā)育，

AtTCP9

和

AtTCP20

突變導致葉片發(fā)育早期表面細胞增大，

AtTCP14

不僅影響葉邊緣細胞增殖，還參與調(diào)控種子的胚胎發(fā)育。芥藍與擬南芥同屬十字花科，二者在葉片和種子等部位生長發(fā)育上存在一定的相似及差異性。生物信息學分析顯示

BoTCP5

與

AtTCP14

基因同源聚類，本研究通過qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)

BoTCP

5在種子中高表達，這與前人的研究一致。

AtTCP23

參與植物開花節(jié)律和植物發(fā)育，但在此次的芥藍研究中未能充分體現(xiàn)相關(guān)成員具有與之相似的功能，可能是只在其同源基因

BoTCP32

上及芥藍不同品種間特異性表達。關(guān)于不同物種間

TCP

成員參與根部位調(diào)控研究的文獻未見報道，在本研究中，

BoTCP14

在‘香菇’Ⅱ時期的根中高表達，

BoTCP16

在‘香菇’Ⅰ時期的根中特異性表達且表達量相對較高，是否這2個成員與根部形態(tài)建成密切相關(guān)，有待后期進一步研究。除了

TCP

家族外，

NGA

、

SPL

、

GRF

和

ARF

等家族也在不同時期以直接或者間接的方式調(diào)控葉片的發(fā)育，這可能很大程度上導致其功能的冗余，進而導致基因表達存在時空特異性。據(jù)文獻報道，擬南芥

AtTCP3

能夠結(jié)合

AtNGA3

啟動子中的1個保守區(qū)域，通過激活

NGA3

啟動子來調(diào)控其合成表達，進而影響葉片的形態(tài)發(fā)育。本研究生物信息學分析表明

BoTCP25

與

AtTCP3

基因同源聚類，是否

BoTCP25

與

BoNGA3

存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控關(guān)系，有待進一步研究。葉片發(fā)育來源于莖頂端分生組織(Shoot apical meristem，SAM)，莖尖分生組織外周特定區(qū)域形成細胞突起，隨后發(fā)育形成葉原基，葉原基經(jīng)生長和分化發(fā)育最終形成成熟葉片。生長素(Auxin)促進葉原基分化形成小葉，高濃度生長素在SAM中的積累部位是葉原基起始的位置，與此相似，生長素高濃度點也是葉緣缺刻和小葉發(fā)生的部位。

ARF

家族是1類與生長素合成密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族，

AtARF4

通過與

AtARF5

和

IAA12

的協(xié)同作用調(diào)節(jié)不定芽再生，同時與AtTCP10蛋白也存在一定的協(xié)同作用。本研究進化樹聚類分析表明

BoTCP21

與

AtTCP10

基因同源聚類且蛋白網(wǎng)絡(luò)互作預測

BoTCP21

與

BoARF4

存在潛在的互作關(guān)系，是否二者間存在互作后期有待試驗佐證。綜上，本研究基于生物信息學、RNA-seq下的FPKM值和qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)

BoTCP

家族成員在‘香菇’芥藍不同時期不同組織部位表達存在一定的時空特異性，推測其在植物生長的不同階段行使不同的生物學功能。本研究表明

CIN

類

BoTCP

與葉片發(fā)育密切相關(guān)，而葉片作為十字花科蕓薹屬植物重要的組成部位和食用器官，對植物的生長發(fā)育及現(xiàn)代化的生產(chǎn)至關(guān)重要，這為后期深入挖掘

BoTCP

相關(guān)基因在芥藍葉片發(fā)育中的分子功能研究和調(diào)控利用提供理論依據(jù)。