1例威寧雞源ALV-J與MDV混合感染診斷及其遺傳進(jìn)化分析

韋秒粘，周 貴，陳 廣，溫貴蘭，徐 飛，龔新勇，朱二鵬

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3義龍新區(qū)農(nóng)林水務(wù)和移民局，貴州 興義 562400 )

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)是一種能夠引起宿主產(chǎn)生嚴(yán)重免疫抑制的反轉(zhuǎn)錄病毒，最終會導(dǎo)致宿主產(chǎn)生多種惡性腫瘤，嚴(yán)重的免疫抑制常常造成多種病原的混合感染，該病無明顯臨床癥狀、主要表現(xiàn)為頭冠蒼白，多器官組織腫瘤等特征。AL的亞群特異性是由表面的囊膜蛋白gp85決定的，gp85作為囊膜蛋白的主要成分，主要負(fù)責(zé)識別靶細(xì)胞膜上的特異性病毒受體，在感染時(shí)能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其抗原性可以決定病毒的亞群特異性，gp85高度的可變性導(dǎo)致ALV-J亞型基因具有高度多態(tài)性，同時(shí)反映出不同亞群的差異。根據(jù)ALV囊膜蛋白的特性可將其分為A～K共11個(gè)亞型，對雞生產(chǎn)影響較為嚴(yán)重的分別是A、B和J亞型，在眾多亞型中，J亞型的感染率最高。

雞馬立克病是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的，它的典型病癥是發(fā)病雞出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞瘤和嚴(yán)重的免疫抑制，腫瘤主要發(fā)生于內(nèi)臟器官，但也發(fā)生于肌肉和皮膚，根據(jù)臨床癥狀可分為內(nèi)臟型、神經(jīng)型和眼型。MDV共有3種血清型，即血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)、血清3型(MDV-3)，但只有血清1型具有致病性和致瘤性，根據(jù)MDV-1致病性的強(qiáng)弱，可將其分為溫和型(mild MDV，mMDV)、強(qiáng)毒型(virulent MDV，vMDV)、超強(qiáng)毒型(very virulent MDV，vvMDV)、超超強(qiáng)毒MDV(very virulent plusMDV，vvMDV)。相關(guān)研究表明，與MDV致腫瘤相關(guān)的基因有、、、等，其中基因是公認(rèn)的主要致瘤基因，與MDV-1強(qiáng)弱毒株致瘤性的不同有關(guān)。

貴州威寧雞作為一種肉蛋兼用雞型，體質(zhì)結(jié)實(shí)，結(jié)構(gòu)勻稱，骨骼粗壯，深受人們的喜愛，若威寧雞受到ALV與MDV這兩種疫病的侵害，將會對人們的生活造成巨大的阻礙，將會對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2020年9月份開始以臨床發(fā)病呈劈叉主要癥狀約40日齡威寧雞為對象，診斷其致病原因進(jìn)行病原核酸的檢測，并對其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明此病例為ALV-J與MDV混合感染，以期為該養(yǎng)殖場ALV與MDV混感提供一定的參考依據(jù)，為ALV-J與MDV混感的疫情防控提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

病料采自貴州省威寧縣某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的約40日齡疑似ALV與MDV感染的威寧雞，現(xiàn)保存于貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑及儀器

柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DL-DNA5000 Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；pMD-19T載體購自寶生物工程(大連有限公司)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自碧云天公司；PCR擴(kuò)增儀購自杭州柏恒科技有限公司；電泳儀電源購自北京百晶生物技術(shù)有限公司；電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)購自香港Gene公司。

1.3 方法

..臨床觀察及病變觀察

為了解貴州威寧雞疫病感染情況，對發(fā)病雞觀察臨床癥狀及病變觀察并記錄結(jié)果。

..病料采集

在臨床剖解完全暴露腹腔，觀察病變組織，無菌采集疑似ALV與MDV的感染病變組織，如心臟等，裝入提前標(biāo)記好的采樣袋中，于-20 ℃冰箱中保存，以待后期研究備用。

..引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的ALV-J毒株HPRS103登錄號為Z46390和 MDV meq 基因組(登錄號為EF546430)序列，利用 Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對特異性引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

..病原核酸檢測

為檢測樣品中是否存在ALV與MDV抗原，以提取的病毒總DNA為模板分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增體系總體積為20 μL。PCR體系為：2×Taq MasterMix 10 μL，DNA/cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddHO 6 μL。

ALV的PCR 鑒定擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察并記錄結(jié)果。

MDV的PCR 鑒定擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察并記錄結(jié)果。

..ALV-J與 MDV基因克隆與PCR鑒定

用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒膠回收 PCR產(chǎn)物后與 pMD-19T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，置 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)接種于含氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h，克隆并進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增體系與程序同..，將陽性克隆質(zhì)粒分別送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

..ALV-J與 MDV基因序列分析

為了辨別ALV-J基因?qū)儆谀囊粋€(gè)亞群及MDV基因可能屬于哪一個(gè)毒株型，利用 DNAStar 軟件包中的 Megalign 軟件分析ALV-J及MDV基因與NCBI上發(fā)布參考毒株的核苷酸同源性并繪制系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。ALV-J及MDV基因參考毒株信息分別見表 2和表3。

表2 ALV-J gp85基因參考毒株信息Tab.2 ALV-J gp85 gene reference strain information

表3 MDV meq基因參考毒株信息Tab.3 MDV meq gene reference strain information

2 結(jié)果與分析

2.1 威寧雞臨床觀察及病變觀察

疑似ALV與MDV混感病雞，可見病雞頭冠蒼白，精神沉郁，兩腿呈劈叉狀；剖解病雞可見心臟有明顯腫瘤結(jié)節(jié)(圖1)。結(jié)果表明，發(fā)病雞疑似存在ALV與MDV混合感染。

注：a為威寧雞兩腿呈劈叉狀圖;b為威寧雞心臟可見明顯腫瘤;c為威寧雞心臟可見明顯腫瘤。圖1 威寧雞臨床觀察及病變觀察Fig.1 Clinical observation and lesion observation of Weining chicken

2.2 病原核酸檢測

..ALV-J核酸檢測

為檢測病雞是否存在ALV抗原感染，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖2。待檢樣品3、4號可擴(kuò)增出約931 bp目的條帶，與預(yù)期大小相符，而空白對照組未見該條帶，說明樣品3、4號疑似存在ALV-J感染。

注：M為DL5000 Marker;1～4為樣品;-為陰性對照。圖2 ALV-J核酸PCR檢測Fig.2 ALV-J nucleic acid PCR detection

..MDV核酸檢測

為檢測病雞是否存在MDV抗原感染，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖3。待檢樣品3號可擴(kuò)增出約1020 bp目的條帶，與預(yù)期大小相符，而空白對照組未見該條帶，說明樣品3號疑似存在MDV感染。

注：M為DL5000 Marker;1～4為樣品;-為陰性對照。圖3 MDV 核酸PCR檢測Fig.3 MDV nucleic acid PCR detection

2.3 ALV-J gp85基因序列分析

..ALV-J基因克隆 PCR 鑒定

為確定PCR擴(kuò)增出的DNA序列是ALV核酸片段，以擴(kuò)增出ALV陽性樣品3、4號提取的克隆菌液DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖4。待檢樣品3、4號克隆均可擴(kuò)增出約931 bp目的條帶，與預(yù)期大小相符，而空白對照組未見該條帶，說明樣品3、4號疑似存在ALV-J基因感染。

注：M為DL5000 Marker;1～6為樣品;-為陰性對照。圖4 ALV-J gp85基因克隆 PCRFig.4 ALV-J gp85 gene cloning PCR

..ALV-J基因序列分析

根據(jù)測序結(jié)果，將ALV-J基因編碼的核苷酸序列與GenBank 中已發(fā)表的不同亞群ALV參考株(見表2)的核苷酸進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示ALV-J基因與ALV-J參考毒株核苷酸同源性為98.0%～99.7%，與 ALV-J基因參考株AHaq02核苷酸同源性高達(dá)99.7%，ALV-J基因與ALV-A的核苷酸同源性為49.3%～50.5%；ALV-J基因與ALV-B的核苷酸同源性為49.8%～49.9%；ALV-J基因與ALV-C的核苷酸同源性為50.2%～50.5%；ALV-J基因與ALV-D的核苷酸同源性為50.7%～51.3%；ALV-J基因與ALV-E的核苷酸同源性為51.2%～51.8%；ALV-J基因與ALV-K的核苷酸同源性為50.4%～51.2%(圖5)。不同亞型參考毒株間核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹分析顯示，ALV-J基因與J亞群的參考毒株處于同一分支，表明ALV-J基因與J亞群ALV的親緣關(guān)系較近，應(yīng)屬于同一亞型(圖6)。

注：本研究基因標(biāo)為“★”。圖5 ALV-J gp85基因核苷酸同源性分析Fig.5 Analysis of nucleotide homology of ALV-J gp85 gene

注：本研究基因標(biāo)為“★”。圖6 ALV-J gp85基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 ALV-J gp85 gene nucleotide phylogenetic tree analysis

2.4 MDV meq 基因序列分析

..MDV基因克隆 PCR 鑒定

為確定PCR擴(kuò)增出的DNA序列是MDV核酸片段，以擴(kuò)增出MDV陽性樣品3號提取的克隆DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖7。待檢樣品3號克隆均可擴(kuò)增出約1020 bp的目的條帶，與預(yù)期大小相符，而空白對照組未見該條帶，說明樣品3號疑似存在MDV基因感染。

注：M為DL5000 Marker;1～2為樣品;-為陰性對照。圖7 MDV meq基因克隆PCRFig.7 MDV meq gene clone PCR

..MDV基因序列分析

根據(jù)測序分析結(jié)果，將MDV基因編碼的核苷酸序列與GenBank 中已發(fā)表的不同毒力MDV參考株(表3)的核苷酸進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示MDV基因與超超強(qiáng)毒株(vv)的核苷酸同源性為98.7%～99.8%，與MDV基因參考毒株GXY2、YLO40920這兩株毒株核苷酸同源性高達(dá)99.8%(圖8)；不同毒力型參考毒株間基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹分析顯示，MDV基因與毒力型為超超強(qiáng)毒株型(vv)的參考毒株處于同一分支，表明MDV基因與vv的親緣關(guān)系較近，可能屬于同一毒力型(圖9)。

注: 本研究基因標(biāo)為“★”；m,溫和型;v,強(qiáng)毒型；vv,超強(qiáng)毒型；vv+,超超強(qiáng)毒型。圖8 MDV meq基因核苷酸同源性分析Fig.8 Nucleotide homology analysis of MDV meq gene

注: 本研究基因標(biāo)為“★”；m,溫和型;v,強(qiáng)毒型；vv,超強(qiáng)毒型；vv+,超超強(qiáng)毒型。圖9 MDV meq基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.9 Nucleotide phylogenetic tree analysis of MDV meq gene

3 結(jié)論與討論

貴州威寧某養(yǎng)雞場發(fā)病雞的臨床表現(xiàn)為精神沉郁，頭冠蒼白，兩腿呈明顯劈叉狀，剖檢可見心臟有明顯腫瘤結(jié)節(jié)。張喜懿等發(fā)現(xiàn)貴州綠殼蛋雞中存在ALV-J與MDV的混合感染；史榮華等發(fā)現(xiàn)肉種雞中存在ALV與MDV的混合感染；威寧雞作為肉蛋兼用型雞，如果也存在這兩種疫病的混合感染，將會對家禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，便對發(fā)病雞進(jìn)行病原核酸檢測和測序結(jié)果的測定，結(jié)果表明，發(fā)病雞存在ALV-J與MDV的混合感染。

ALV-J于2000年首次在中國分離得到，該毒株宿主范圍廣泛、進(jìn)化迅速，目前已成為最流行的禽白血病病毒亞型，ALV-J在貴州感染常有病例發(fā)生，為了解當(dāng)?shù)匾咔楦腥荆銓ν庪u進(jìn)行檢測。測序結(jié)果顯示，ALV-J基因與ALV-J原型毒株HPRS103基因核苷酸同源性達(dá)到98.0%且位于同一分支上，與ALV-J參考毒株同源性為98.0%～99.7%，說明基因ALV-J屬于ALV-J。MDV的特征性臨床癥狀為肢體的非對稱進(jìn)行性麻痹，繼而發(fā)展為完全麻痹，因其侵害的神經(jīng)不同而表現(xiàn)不同的臨床癥。最常見的是坐骨神經(jīng)受侵害，表現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，后完全麻痹，不能行走，蹲伏地上，或呈典型的“劈叉”姿勢，一腿伸向前方，另一腿伸向后方。MD存在于所有家禽業(yè)中，自1967年以來，給家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。測序結(jié)果顯示，MDV基因與超超強(qiáng)毒株(vv)的同源性為98.7%～99.8%，與MDV m型、v型、vv型各代表毒株不在同一個(gè)分支上，MDV基因與毒力型為超超強(qiáng)毒株型(vv)的參考毒株處于同一分支，故MDV基因可能屬于vv型。

ALV沒有可供使用的疫苗，也沒有特效的治療藥物，只能靠預(yù)防。在生產(chǎn)中，禽群中一旦發(fā)生ALV，一般只能作淘汰處理。MDV是唯一可以用疫苗進(jìn)行防治的腫瘤性疾病，雖然MDV有可供使用的疫苗，但疫苗不能阻止病毒的復(fù)制和傳播，由于某些人為因素也可導(dǎo)致免疫失敗，如不規(guī)范操作等。ALV和MDV都能使雞群機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，共同感染兩種病毒可促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展，故應(yīng)引起重視，秉承以預(yù)防為主的理念，有效做好預(yù)防工作。