蒼耳亭通過調(diào)控LOXL1-AS1/miR-520d-5p軸對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

王丹丹 饒琦 郭彩玲 趙寅 史岑敏

(四川大學(xué)華西醫(yī)院血液內(nèi)科,四川 成都 610041)

白血病是一種惡性克隆性造血干細(xì)胞疾病。由于白血病細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻、分化障礙等原因，機(jī)體正常造血功能受到抑制，并導(dǎo)致貧血和免疫缺陷等嚴(yán)重癥狀。蒼耳亭是從菊科植物蒼耳Xanthiumsibiricum干燥成熟帶總苞的果實(shí)中提取的天然倍半萜內(nèi)酯，具有抗癌、抗血管生成、抗炎、抗寄生蟲等作用[1-2]。研究報(bào)道蒼耳亭對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用[3]。蒼耳亭通過干擾核因子kB通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞G2/M周期阻滯和凋亡[4]。然而，蒼耳亭對(duì)白血病抗癌作用和機(jī)制鮮有報(bào)道。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是研究最多的非編碼類型，其通過直接或間接地調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因表達(dá)，具有抑癌或致癌基因功能[5-6]。lncRNA類賴氨酰氧化酶1反義RNA1(LOXL1-AS1)位于15q24.1，研究報(bào)道肺癌中LOXL1-AS1高表達(dá)明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力[7]。干擾LOXL1-AS1表達(dá)明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[8]。靶基因預(yù)測顯示miR-520d-5p是LOXL1-AS1的潛在靶點(diǎn)，有研究指出急性T淋巴細(xì)胞白血病患者中miR-520d-5p表達(dá)下調(diào)[9]。咪達(dá)唑侖通過上調(diào)miR-520d-5p表達(dá)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[10]。然而，LOXL1-AS1是否靶向miR-520d-5p調(diào)控白血病進(jìn)展并不清楚。本研究通過分析蒼耳亭對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡以及LOXL1-AS1、miR-520d-5p表達(dá)的影響，旨在探討蒼耳亭在白血病中潛在抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 白血病K-562細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；RPMI-1640、胎牛血清購自美國Gibco公司；蒼耳亭(純度≥98%，批號(hào)20200110)購自上海源葉生物；RNAiso Plus試劑購自大連Takara生物公司；熒光素酶報(bào)告載體、PCR引物、miR-520d-5p模擬物(mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、針對(duì)LOXL1-AS1小干擾RNA(si-LOXL1-AS1)及其陰性對(duì)照(si-NC)、LOXL1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-LOXL1-AS1)購自廣州銳博生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔單克隆抗體(AF1186)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2兔多克隆抗體(AF6285)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)兔單克隆抗體(AF1270)、山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒、lnRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和蒼耳亭濃度篩選 將K-562細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，放入37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取5×103個(gè)第三代對(duì)數(shù)期K-562細(xì)胞接種6孔板，分別用含0、5、15、30、60、90 μmol/L蒼耳亭[3]的培養(yǎng)液孵育K-562細(xì)胞24 h，每孔K-562細(xì)胞中加入10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h后，分光光度計(jì)測定450 nm處吸光度(OD)。增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。根據(jù)增殖抑制率選擇6、20、60 μmol/L蒼耳亭進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 取2×105個(gè)對(duì)數(shù)期K-562細(xì)胞接種6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度為50%時(shí)利用Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1、si-NC、pcDNA-LOXL1-AS1至K-562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h采用RT-qPCR檢測LOXL1-AS1水平已驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組為正常培養(yǎng)的K-562細(xì)胞；蒼耳亭6 μmol/L組、蒼耳亭20 μmol/L組、蒼耳亭60 μmol/L組為分別用含6、20、60 μmol/L蒼耳亭的培養(yǎng)液孵育K-562細(xì)胞24 h；si-NC組、si-LOXL1-AS1組為分別轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1的K-562細(xì)胞；蒼耳亭+pcDNA-LOXL1-AS1組為含60 μmol/L蒼耳亭的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA-LOXL1-AS1的K-562細(xì)胞24 h。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 CCK-8法檢測K-562細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1、si-NC或者pcDNA-LOXL1-AS1的K-562細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染K-562細(xì)胞以5×103個(gè)/孔密度接種96孔板，按照“1.2.2”實(shí)驗(yàn)分組加入一定濃度的蒼耳亭孵育細(xì)胞24 h，隨后按1.2.1步驟測定各孔OD值，根據(jù)OD值計(jì)算增殖抑制率。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測K-562細(xì)胞凋亡率 將各組K-562細(xì)胞重懸于100 μL的1×結(jié)合緩沖液中，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。分別取5 μL的Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)加入到述細(xì)胞懸液中，避光孵育15 min。補(bǔ)加400 μL的1×結(jié)合緩沖液并混合均勻。流式細(xì)胞儀檢測各組K-562細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白質(zhì)印記檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液提取各組K-562細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，設(shè)置電壓100 V，時(shí)間90 min。然后濕轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜上，設(shè)置電流20 mA過夜。用5%脫脂乳封閉膜2 h，4℃下用Bax抗體(1∶800)、Bcl-2抗體(1∶500)、內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2000)孵育過夜，室溫下用二抗(1∶1000)孵育1 h。洗膜后，用ECL試劑盒檢測蛋白條帶。以Image J軟件測得的Bax(或Bcl-2)與GAPDH條帶灰度值比值表示Bax(或Bcl-2)蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 RT-qPCR檢測LOXL1-AS1和miR-520d-5p表達(dá) 用RNAiso Plus試劑提取各組K-562細(xì)胞的總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用miRNA、lncRNA熒光定量檢測試劑盒分別檢測LOXL1-AS1、miR-520d-5p表達(dá)。miRNA和lncRNA的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。LOXL1-AS1：上游5′-GA TATGTTGGATGATGGA-3′，下游5′-GATATGTT GGATGGATGA-3′；內(nèi)參GAPDH：上游5′-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATGGT GATGGGATTTC-3′；miR-520d-5p：上游5′-TGAGT CTACAAAGGGAAGCCC-3′，下游5′-TCTCAAAC CGTAACCCACCA-3′；內(nèi)參U6：上游5′-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAAT TGCGT-3′。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 使用Starbase在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測LOXL1-AS1的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-520d-5p是其潛在靶點(diǎn)。將包含miR-520d-5p結(jié)合區(qū)域的LOXL1-AS1的野生(WT)序列插入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psiCHECK-2的下游，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體WT-LOXL1-AS1。將含miR-520d-5p結(jié)合位點(diǎn)的LOXL1-AS1序列進(jìn)行突變(MUT)，構(gòu)建突變型熒光素酶載體MUT-LOXL1-AS1。將上述載體分別與miR-520d-5p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染K-562細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，以海腎熒光素酶為內(nèi)控，雙熒光素酶活性系統(tǒng)測定K-562細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的蒼耳亭對(duì)K-562增殖的影響 采用不同濃度的蒼耳亭孵育K-562細(xì)胞，與0 μmol/L相比，5 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L的蒼耳亭孵育后細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，后續(xù)選擇6 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 蒼耳亭對(duì)K-562增殖的影響

2.2 蒼耳亭對(duì)K-562細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對(duì)照組比較，蒼耳亭(6、20、60 μmol/L)組K-562細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；隨著蒼耳亭濃度的升高，其對(duì)K-562細(xì)胞增殖、Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡、Bax蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。見圖2、表1。

圖2 蒼耳亭對(duì)K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表1 蒼耳亭對(duì)K-562細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.3 蒼耳亭對(duì)K-562中LOXL1-AS1和miR-520d-5p表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，蒼耳亭(6、20、60 μmol/L)組K-562細(xì)胞LOXL1-AS1表達(dá)顯著降低(P<0.05)，miR-520d-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05)。隨著蒼耳亭濃度的升高，其對(duì)K-562細(xì)胞LOXL1-AS1表達(dá)的抑制作用和對(duì)miR-520d-5p表達(dá)的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。見表2。

表2 蒼耳亭對(duì)K-562中LOXL1-AS1和miR-520d-5p表達(dá)的檢測

2.4 干擾LOXL1-AS1對(duì)K-562細(xì)胞增殖、凋亡的影響 si-LOXL1-AS1組K-562細(xì)胞LOXL1-AS1表達(dá)顯著低于si-NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染si-LOXL1-AS1后K-562細(xì)胞LOXL1-AS1表達(dá)受到抑制。與si-NC組比較，si-LOXL1-AS1組K-562細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 干擾LOXL1-AS1對(duì)K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表3 干擾LOXL1-AS1對(duì)K-562細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.5 LOXL1-AS1和miR-520d-5p靶向關(guān)系 Starbase在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-520d-5p與LOXL1-AS1序列間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。檢測相對(duì)熒光素酶活性顯示，同與WT-LOXL1-AS1共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miR-520d-5p mimics后K-562細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著低于轉(zhuǎn)染miR-NC(P<0.05)；同與MUT-LOXL1-AS1共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miR-520d-5p mimics后K-562細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染miR-NC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

圖4 LOXL1-AS1和miR-520d-5p的互補(bǔ)序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6 過表達(dá)LOXL1-AS1對(duì)蒼耳亭處理的K-562增殖和凋亡的影響 與對(duì)照組比較，蒼耳亭組K-562細(xì)胞LOXL1-AS1表達(dá)、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，miR-520d-5p表達(dá)、增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；與蒼耳亭組比較，蒼耳亭+pcDNA-LOXL1-AS1組K-562細(xì)胞LOXL1-AS1表達(dá)、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)，miR-520d-5p表達(dá)、增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見圖5、表5。

圖5 LOXL1-AS1可逆轉(zhuǎn)蒼耳亭對(duì)K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表5 LOXL1-AS1可逆轉(zhuǎn)蒼耳亭對(duì)K-562抑制率糖酵解活性和凋亡的影響

3 討論

盡管白血病的治療有明顯改善，但傳統(tǒng)化療藥物的療效較低，多數(shù)患者復(fù)發(fā)頻繁，預(yù)后較差，死亡率仍然居高不下[11]。天然產(chǎn)物由于其來源廣泛、價(jià)格低廉、抗腫瘤活性良好等優(yōu)勢已成為化療藥物的主要來源。近年來，蒼耳亭已被證實(shí)對(duì)多種癌細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性。蔡亞云等[12]報(bào)道蒼耳亭對(duì)體內(nèi)外肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移具有較強(qiáng)的抑制作用。狄澤敏等[13]證實(shí)蒼耳亭可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長。Li等[14]指出蒼耳亭可能通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路進(jìn)而抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖，抑制血管生成。本研究發(fā)現(xiàn)選擇6、20、60 μmol/L蒼耳亭濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，蒼耳亭處理后白血病細(xì)胞K-562細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，凋亡率明顯增加。此外，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，這與蒼耳亭的凋亡誘導(dǎo)作用一致。以上研究表明蒼耳亭通過抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在白血病中具有抗腫瘤活性。

LOXL1-AS1是多種腫瘤進(jìn)展的致癌因子，胃癌中LOXL1-AS1表達(dá)上調(diào)預(yù)示患者預(yù)后不良，并通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移加速胃癌的惡化[15]。前列腺癌中LOXL1-AS1表達(dá)增加，下調(diào)LOXL1-AS1可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn)蒼耳亭處理顯著下調(diào)K-562細(xì)胞中LOXL1-AS1表達(dá)水平。干擾LOXL1-AS1可抑制K-562細(xì)胞增殖，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與蒼耳亭抗腫瘤功能類似，提示LOXL1-AS1可能介導(dǎo)蒼耳亭抗腫瘤作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)蒼耳亭處理顯著上調(diào)miR-520d-5p水平。既往研究報(bào)道m(xù)iR-520d-5p表達(dá)可能參與胃癌發(fā)生過程[17]。宮頸癌中miR-520d-5p通過靶向PTK2抑制癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[18]。越來越多研究表明lncRNA可以直接與miRNA相互作用，調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)和活性，參與多種細(xì)胞過程[19]。LOXL1-AS1通過靶向miR-423-5p參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展[20]。本研究證實(shí)miR-520d-5p是LOXL1-AS1的直接靶點(diǎn)，且miR-520d-5p表達(dá)受LOXL1-AS1負(fù)向調(diào)控，提示LOXL1-AS1/ miR-520d-5p軸可能介導(dǎo)蒼耳亭的抗腫瘤作用。進(jìn)一步研究表明，過表達(dá)LOXL1-AS1明顯減弱蒼耳亭處理對(duì)K-562細(xì)胞增殖、凋亡以及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，基本恢復(fù)細(xì)胞增殖能力和凋亡水平，表明蒼耳亭可能通過調(diào)控LOXL1-AS1/ miR-520d-5p軸進(jìn)而影響K-562細(xì)胞的增殖和凋亡。

4 結(jié)論

蒼耳亭可抑制白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制LOXL1-AS1/ miR-520d-5p軸有關(guān)，初步揭示了蒼耳亭在白血病中的抗癌機(jī)制，為蒼耳亭作為一種有前景的白血病抗腫瘤候選藥物的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。