巨噬細(xì)胞胞外囊泡在疾病治療中的應(yīng)用

范文霖， 聶偉東， 謝海燕

(1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；2.北京理工大學(xué)材料學(xué)院，北京 100081)

1 前言

巨噬細(xì)胞是血液中未完全分化的單核細(xì)胞被招募到外周系統(tǒng)中，并在接觸了局部生長因子、促炎細(xì)胞因子和微生物產(chǎn)物等之后迅速分化而產(chǎn)生的[1,2]，具有特殊的免疫功能[3]，主要包括：(1)吞噬病原體、受感染的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞等；(2)提呈抗原；(3)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CXCL9、CCL17等。巨噬細(xì)胞在不同的環(huán)境刺激下會極化為不同的表型，主要包括M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。M1具有促炎作用，可殺傷微生物和腫瘤細(xì)胞，M2具有抗炎作用，能促進(jìn)組織修復(fù)和腫瘤發(fā)展。巨噬細(xì)胞在癌癥、糖尿病、動脈粥樣硬化等重大疾病中都起著重要作用，也可以為相關(guān)的治療提供新思路。如，M1可以抵抗微生物感染和進(jìn)行腫瘤治療，M2則可以進(jìn)行抗炎治療和組織修復(fù)。

然而，目前基于巨噬細(xì)胞的疾病治療仍面臨諸多困難：例如無法長期監(jiān)測或維持巨噬細(xì)胞的生物活性，這在一定程度上影響了巨噬細(xì)胞的治療效果；巨噬細(xì)胞治療更傾向于使用原代巨噬細(xì)胞，制備較繁瑣、重復(fù)性較差；巨噬細(xì)胞治療的安全性也需要考慮，如增強(qiáng)的細(xì)胞毒性可能引起細(xì)胞因子風(fēng)暴和過激的炎癥環(huán)境；且腫瘤微環(huán)境能夠使巨噬細(xì)胞極化為M2組織修復(fù)表型，進(jìn)一步增加腫瘤的惡性程度等[4]。

細(xì)胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是細(xì)胞分泌到胞外的膜性囊泡。在分泌過程中，核酸、蛋白等被包覆在囊泡內(nèi)，不僅繼承了親本細(xì)胞的性質(zhì)和功能[5]，還可以回避細(xì)胞治療所面臨的問題。因此，研究者們開始嘗試?yán)眉?xì)胞外囊泡代替細(xì)胞進(jìn)行疾病治療。細(xì)胞外囊泡根據(jù)粒徑大小、結(jié)構(gòu)特征和生物起源等因素可以分為外泌體(Exosomes)，微囊泡(Microvesicles，MVs)和凋亡小體(Apoptotic Bodies)三個亞型，其中粒徑大概在30～100 nm的外泌體研究得最為廣泛[6]。外泌體起源于細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的內(nèi)體，在內(nèi)體膜向內(nèi)出芽形成腔內(nèi)小泡(Intraluminal Vesicles，ILVs)的過程中，細(xì)胞質(zhì)中的蛋白、脂質(zhì)和核酸被分選進(jìn)入小泡中，之后眾多的ILVs聚集成為多泡體(Multivesicular Bodies，MVBs)。部分MVBs將被溶酶體降解，其余的MVBs與細(xì)胞膜融合將ILVs釋放到細(xì)胞外空間，成為外泌體[7]。微囊泡是細(xì)胞在環(huán)境壓力下通過細(xì)胞質(zhì)膜出芽的方式釋放到胞外的囊泡總稱，粒徑在100～1 000 nm之間[8,9]。凋亡小體是凋亡中的細(xì)胞通過細(xì)胞質(zhì)膜出泡的形式釋放到胞外的囊泡，尺寸約為1 000～5 000 nm[10]，除了含有來自母細(xì)胞胞漿的蛋白質(zhì)等分子外，還含有細(xì)胞器、DNA片段和組蛋白[11]。鑒于上述的細(xì)胞外囊泡的特征，使得巨噬細(xì)胞胞外囊泡具有了重要的生物學(xué)功能。如，借助表面的蛋白趨化至腫瘤部位或炎癥部位，利用攜帶的microRNA影響受體細(xì)胞的信號通路進(jìn)而改善受體細(xì)胞的生理特性，表現(xiàn)出免疫抑制或免疫刺激作用；此外，細(xì)胞外囊泡還有穿越組織屏障的能力，如血腦屏障BBB等[12]。其較小的尺寸以及免疫原性低、無毒、穩(wěn)定性高等優(yōu)點也使得細(xì)胞外囊泡成為很好的診療生物材料[13]。在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行工程化改造可賦予細(xì)胞外囊泡新的特性和功能，通過與其天然性能結(jié)合，能達(dá)到更好的診療效果。

巨噬細(xì)胞胞外囊泡在疾病治療中的主要作用如圖1所示。

圖1 巨噬細(xì)胞胞外囊泡在疾病治療中的作用示意圖Fig.1 Schematic diagram of the role of macrophage extracellular vesicles in disease treatment

2 天然巨噬細(xì)胞外囊泡用于疾病治療

巨噬細(xì)胞是一種廣泛分布于哺乳動物機(jī)體內(nèi)的重要免疫細(xì)胞[14]，具有顯著的可塑性，面對不同的環(huán)境刺激，它們能夠改變自身的生理反應(yīng)，表現(xiàn)出不同的表型[`4]。最典型的有兩種：經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(CAMs,M1型巨噬細(xì)胞)和替代性活化巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)，根據(jù)基因表達(dá)情況不同，M2型巨噬細(xì)胞又分為M2a、M2b、M2c和M2d四種亞型。M1表達(dá)高水平的促炎因子，產(chǎn)生活性氮和活性氧，促進(jìn)輔助性T細(xì)胞Th1分化，并且有強(qiáng)的微生物和腫瘤殺傷活性。而M2促進(jìn)組織重塑和腫瘤發(fā)展，并具有免疫調(diào)節(jié)功能[16]。M1和M2的細(xì)胞外囊泡也具有和其母細(xì)胞相似的功能，例如，Yang等[17]的研究表明，M2b的外泌體主要通過攜帶CCL1蛋白(M2b的特征之一是分泌CCL1趨化因子)到結(jié)腸與在Th2細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)上表達(dá)的CCR8受體相互作用，顯著減輕葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。M2b外泌體進(jìn)行治療后，結(jié)腸炎小鼠脾臟中的Treg細(xì)胞數(shù)量增加、IL-4水平升高(Th2極化)，而與結(jié)腸炎相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和IL-17A)的表達(dá)水平顯著降低，Th2型免疫應(yīng)答與被DSS給藥誘導(dǎo)的Th1型免疫應(yīng)答相平衡，而Treg細(xì)胞平衡了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎炎性紊亂，從而達(dá)到緩解結(jié)腸炎的目的。

巨噬細(xì)胞具有腫瘤靶向性[18,19]，具有快速定向遷移到病理部位的能力，分泌特定的趨化因子，而實體腫瘤對趨化因子有高的滲透性，因此允許巨噬細(xì)胞定向聚集并浸潤到腫瘤環(huán)境中；且腫瘤部位高分泌許多趨化因子，如CCL2和CCL5，能夠確保巨噬細(xì)胞被招募到腫瘤部位[20]。巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡也被證明具有腫瘤靶向性，因此能夠作為腫瘤特異性的藥物遞送系統(tǒng)。Rayamajhi等[21]將小鼠巨噬細(xì)胞的小細(xì)胞外囊泡(sEVs)與合成脂質(zhì)體雜交得到雜交外泌體HE，同時裝載水溶性Dox。sEVs提高了藥物靶向性，增強(qiáng)了小分子的穩(wěn)定性和延長了血液循環(huán)時間。具有促炎表型的M1過表達(dá)表面趨化因子受體CCR2，而腫瘤組織會產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1,CCL2)，它是C-C趨化因子家族的成員，能通過CCL2-CCR2機(jī)制將單核/巨噬細(xì)胞招募到腫瘤微環(huán)境中[22]。M1釋放的細(xì)胞外囊泡也繼承了供體細(xì)胞的特異靶向性。Guo等[23]用M1的細(xì)胞外囊泡分別和正常細(xì)胞CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)和腫瘤細(xì)胞SKOV3細(xì)胞(人卵巢癌細(xì)胞)共孵育，在腫瘤細(xì)胞中檢測到了更高的細(xì)胞攝取率；此外，M1的細(xì)胞外囊泡(M1-EVs)用熒光團(tuán)DiD標(biāo)記后，腹腔給藥于原位卵巢癌小鼠模型，觀察到M1-EVs主要聚集在轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)中，肝臟較少，其他臟器中的熒光信號可以忽略，表明了其良好的腫瘤靶向性，而使用CCR2抑制劑后，轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)中的熒光信號顯著減弱，說明CCR2可能與M1-EVs的腫瘤趨向性有關(guān)。

M2及其胞外囊泡具有抗炎特性，能夠促進(jìn)機(jī)體形成抗炎的微環(huán)境[24]。例如，M2的外泌體通過表面的趨化因子受體能夠?qū)崿F(xiàn)炎癥趨化作用，然后在炎癥部位釋放抗炎細(xì)胞因子(如IL-10，IL-1Ra和TGF-β)，因而能表現(xiàn)出理想的抗炎作用[25]。在Wu等人的工作中[25]，通過電穿孔將己基-5-氨基乙?；撬猁}(HAL)載入到M2的外泌體中，M2外泌體可以趨向炎癥部位和發(fā)揮抗炎作用，而包封的HAL可進(jìn)行血紅素的胞內(nèi)生物合成和代謝，產(chǎn)生抗炎的一氧化碳和膽紅素，進(jìn)一步增強(qiáng)抗炎作用，最終緩解動脈粥樣硬化；同時，血紅素生物合成途徑的中間產(chǎn)物原卟啉IX(PpIX)能進(jìn)行動脈粥樣硬化的熒光成像和跟蹤，為動脈粥樣硬化的診療提供了新方法。Li團(tuán)隊[26]用低濃度為50 μg/mL，高濃度為500 μg/mL的巨噬細(xì)胞外泌體和高葡萄糖處理過的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(GH-HUVEC)共孵育，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)顯著降低，表明巨噬細(xì)胞的外泌體具有抗炎作用。他們還發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞外泌體可提高Ⅰ型糖尿病小鼠的創(chuàng)面縮小率，并且這一過程與炎癥的調(diào)節(jié)有關(guān)，說明巨噬細(xì)胞來源的外泌體可能是通過抗炎治療糖尿病創(chuàng)面損傷的一種新策略。

M2還具有促進(jìn)組織重塑的功能，其細(xì)胞外囊泡也對受傷的組織和細(xì)胞起到一些有益的作用。Dai等人的研究[27]顯示，M2的外泌體攜帶有微小RNA-148a(miR-148a)，能通過下調(diào)硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)和鈍化TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路減輕心肌缺血再灌注(MI/R)損傷。當(dāng)流向組織或器官的血流量減少時，就會發(fā)生缺血，妨礙氧氣的供應(yīng)，導(dǎo)致部分或全部組織/器官損傷。Gangadaran等[28]發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡(MAC-EVs)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成；在體內(nèi)實驗中，與對照組相比，MAC-EVs可促進(jìn)小鼠基質(zhì)膠栓內(nèi)新的大血管形成。說明MAC-EVs可以促進(jìn)血管生成從而治療缺血性損傷疾病。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中常駐的免疫細(xì)胞，是一類特殊的巨噬細(xì)胞群體，中風(fēng)導(dǎo)致的腦部損傷可以使小膠質(zhì)細(xì)胞分化為M1和M2型巨噬細(xì)胞，其中M2型被認(rèn)為具有治療效果，顯示對大腦的神經(jīng)保護(hù)作用，并能改善中風(fēng)后的長期神經(jīng)效果[29 - 31]。Song等人的研究[32]顯示M2小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體能夠減弱缺氧-葡萄糖剝奪后神經(jīng)元的凋亡。M2小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體還可顯著減小腦缺血3天后的梗死體積并減輕行為缺陷，從而對缺血性中風(fēng)起到治療效果，這與外泌體攜帶的微小RNA miR-124進(jìn)入神經(jīng)元后下調(diào)泛素特異蛋白酶14(USP14)的表達(dá)有關(guān)。

巨噬細(xì)胞是一種能抵抗病原體感染的原生免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡對感染性疾病也起到一定的治療作用。在Reales-Calderon等人的研究[33]中，被白色念珠菌感染的巨噬細(xì)胞的EVs能激活其他巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK和p38激酶，增加其促炎細(xì)胞因子的分泌和抑制白色念珠菌的活性。Cheng和Schorey的研究[34]發(fā)現(xiàn)用結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白(CFP)處理過的巨噬細(xì)胞外泌體可誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)抗原特異性IFN-γ和IL-2。使用低劑量結(jié)核分枝桿菌小鼠氣溶膠感染模型，發(fā)現(xiàn)來自CFP處理的巨噬細(xì)胞外泌體既可啟動保護(hù)性免疫反應(yīng)，又可促進(jìn)卡介苗前期免疫，提示了巨噬細(xì)胞外泌體可能成為一種新型的抗結(jié)核分枝桿菌感染的無細(xì)胞疫苗。Velandia-Romero等人的研究[35]顯示被登革熱病毒DENV-2感染的U937巨噬細(xì)胞胞外囊泡可以轉(zhuǎn)運(yùn)由DENV RNA編碼的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)(NS3)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的激活，并在疾病早期引發(fā)一種防御程序，抵御登革熱病毒的侵害。這些研究提示巨噬細(xì)胞的胞外囊泡可能通過傳遞病毒物質(zhì)或治療分子來增強(qiáng)抗感染的免疫應(yīng)答。

M1或M2的細(xì)胞外囊泡還具有相互極化的能力。Kim課題組[36]在體外和體內(nèi)驗證了M2的外泌體由于攜帶有調(diào)節(jié)因子CCL22,CCL24和MFG-E8可以將M1極化為M2，從而加速傷口的愈合。M1的納米囊泡或其細(xì)胞外囊泡可以使M2向M1再極化，進(jìn)而增強(qiáng)抗腫瘤效果[37]。Liu等人的研究[38]也顯示M1的細(xì)胞外囊泡能夠極化腫瘤處的M2(TAMs)為M1，從而達(dá)到對腫瘤細(xì)胞的吞噬和殺傷效果。

3 工程化巨噬細(xì)胞外囊泡用于疾病的治療

天然巨噬細(xì)胞外囊泡應(yīng)用于疾病治療研究進(jìn)展迅速，但仍有很多局限性。如：天然效力不足，特異性和靶向性不夠強(qiáng)，不能及時從溶酶體逃逸等等。于是，研究者們開始思考如何對細(xì)胞外囊泡進(jìn)行改造以增強(qiáng)其功能，得到了很多工程化改造的巨噬細(xì)胞胞外囊泡[39]。工程化改造細(xì)胞外囊泡主要可以分直接工程化(直接對細(xì)胞外囊泡本身進(jìn)行改造)和間接工程化(對細(xì)胞外囊泡來源的細(xì)胞進(jìn)行改造)兩類。間接工程化修飾主要是利用基因工程、代謝標(biāo)記和外源性傳遞的方法將靶向配體等表達(dá)在細(xì)胞膜上或裝載進(jìn)細(xì)胞中，進(jìn)而表現(xiàn)在細(xì)胞形成的胞外囊泡上[40 - 43]。但是基于細(xì)胞的EVs功能化策略通常只能將總裝載組分的一小部分包裝進(jìn)EVs中，裝載效率低、成本高。而直接對純化出的EVs進(jìn)行功能化可確保所有修飾位點或被封裝的物質(zhì)都定位于細(xì)胞外囊泡中。直接工程化的方式也可以分為被動封裝和主動封裝兩種，被動裝載方法依賴于自發(fā)的相互作用，如共孵育[44]和多價靜電相互作用介導(dǎo)的陽離子化合物結(jié)合到帶負(fù)電的EVs膜表面[45]，而主動裝載策略則需要暫時破壞EVs膜以允許裝載物進(jìn)入，包括電轉(zhuǎn)[46]、脂質(zhì)體介導(dǎo)[47]、冷熱交替[48]、超聲[49]、擠壓[49]、膜滲透[50]等。這兩種方法能將所需要修飾的抗體、靶向肽或者其他分子(化療藥[51]，siRNA[52])整合在囊泡里。

3.1 間接工程化

幾十年來，研究人員已經(jīng)嘗試將非天然組分引入細(xì)胞以增強(qiáng)其治療功能[53,54]。而這些組分中的許多會表現(xiàn)在細(xì)胞外囊泡中。例如，修飾在細(xì)胞膜的組分會自然地?fù)饺胛⑴葜校鴥?nèi)在化的組分可能會分泌到外泌體中?；蛐揎?、代謝標(biāo)記和外源性傳遞等細(xì)胞工程技術(shù)已被證明可以改變細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡表面蛋白表達(dá)和內(nèi)容物[55]，從而提高細(xì)胞外囊泡靶向病灶的能力以及治療疾病的效率。同時，經(jīng)過工程化細(xì)胞得到的細(xì)胞外囊泡還可以再經(jīng)過直接工程化改造使得其功能進(jìn)一步加強(qiáng)。

比較簡單的間接工程化方法包括通過物理包覆使細(xì)胞裝載治療組分，而后治療組分能夠被包裝入其細(xì)胞外囊泡中，同時結(jié)合細(xì)胞外囊泡本身的靶向性等特性用于疾病的高效治療。在Tang等人的研究[56]中，用地塞米松(dexamethasone，DEX)孵育RAW巨噬細(xì)胞后提取其微泡(MV)，得到裝載有DEX的微泡MV-DEX，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，MV-DEX表面明顯表達(dá)有整合素αLβ2(LFA-1)和α4β1(VAL-4)，使它們能夠靶向有炎癥的腎臟。在體外實驗中，只有游離的DEX 1/5劑量的MV-DEX能通過抑制NF-κB的活性起到顯著的抗炎作用。在體內(nèi)實驗中，與游離DEX等摩爾劑量的MV-DEX能顯著減輕脂多糖(LPS)或阿霉素(ADR)誘導(dǎo)的腎病小鼠的腎損傷，并能增強(qiáng)對腎臟炎癥和纖維化的治療效果。巨噬細(xì)胞能夠通過吞噬作用主動吞噬和內(nèi)化大量的外源物質(zhì)，因此與其他細(xì)胞相比可以在同樣的納米顆粒濃度和孵育時間下達(dá)到一種可觀的細(xì)胞載荷。Silva等[57]將小分子光敏劑及Fe3O4納米顆粒與巨噬細(xì)胞一起孵育，巨噬細(xì)胞分泌具有磁性和光響應(yīng)性的細(xì)胞外囊泡，能夠在體內(nèi)進(jìn)行磁靶向、磁共振成像和光動力治療。

為了提高細(xì)胞外囊泡對病灶部位的靶向性，還可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加能插入細(xì)胞膜的靶向肽從而使細(xì)胞和細(xì)胞外囊泡上帶有靶向分子。Wang等[58]將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)功能化DSPE-PEG(DSPE-PEG -RGD)和巰基功能化DSPE-PEG(DSPE-PEG-SH)的培養(yǎng)基中，用RGD和巰基修飾供體細(xì)胞的膜，然后提取其外泌體，外泌體也可以被RGD和巰基修飾(RGD -Exos-SH)。此外，還將外泌體表面通過共價鍵與另一種腫瘤特異性靶向配體葉酸(FA)連接，通過兩種靶向配體的協(xié)同作用提高對腫瘤的靶向效果。

作為所有細(xì)胞操作策略中最完善的一種，基因工程也被用于間接工程化修飾EVs以治療疾病。與簡單的物理包覆不同，基因工程改造有更強(qiáng)的可操作性和更多的改造范圍。利用轉(zhuǎn)基因的手段將目的蛋白基因轉(zhuǎn)染進(jìn)母細(xì)胞中，能夠得到表達(dá)有目的蛋白的EVs。例如，針對細(xì)胞外囊泡及其內(nèi)容物溶酶體逃逸差的特點，通過基因工程的方法改造巨噬細(xì)胞可以使其上表達(dá)膜融合相關(guān)蛋白，從而使其細(xì)胞外囊泡直接與靶細(xì)胞膜融合而非進(jìn)入溶酶體。在Liu等人的研究[38]中，能表達(dá)口腔炎病毒糖蛋白VSV-G的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞中，提取其細(xì)胞外囊泡，則該囊泡上也表達(dá)有VSV-G蛋白，之后將PD-L1的小干擾RNA(siPD-L1)電轉(zhuǎn)進(jìn)此細(xì)胞外囊泡中，構(gòu)建了一種病毒模擬核酸工程化的細(xì)胞外囊泡(siRNA@V-M1 EV)。給CT26荷瘤小鼠注射后，由于M1 EV的天然腫瘤歸巢特性，這種工程化的細(xì)胞外囊泡能夠靶向腫瘤組織。VSV-G是一種pH敏感細(xì)胞融合蛋白，可使該細(xì)胞外囊泡與靶細(xì)胞膜融合，促進(jìn)siPD-L1直接釋放到細(xì)胞質(zhì)中而非溶酶體中從而引發(fā)有效的PD -L1基因沉默，有效阻斷PD -L1/PD -1相互作用，進(jìn)而使得CD8+T細(xì)胞數(shù)量升高。PD -L1/PD -1通路阻斷、T細(xì)胞識別重建等聯(lián)合應(yīng)用，可以獲得較好的抗腫瘤效果。

代謝標(biāo)記也是一種理想的細(xì)胞功能化策略，可以避免基因操作過于復(fù)雜的問題。該方法通過向細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充非天然代謝產(chǎn)物(例如氨基酸，脂質(zhì)，寡核苷酸或聚糖等)來改變細(xì)胞生物合成，這些代謝物被細(xì)胞吸收后能整合到蛋白質(zhì)組、基因組、脂質(zhì)和糖中[55]。采用代謝標(biāo)記的方法能夠?qū)奘杉?xì)胞進(jìn)行工程化改造，從而得到具有功能基團(tuán)的細(xì)胞外囊泡。Nie等[59]利用生物合成和磷脂代謝的方法將疊氮基團(tuán)引入M1型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上，從而得到疊氮化的外泌體。隨后通過pH敏感的苯甲酸-亞胺鍵將疊氮化的M1細(xì)胞外泌體(M1 Exo)和DBCO化的CD47/SIRPα兩種免疫調(diào)節(jié)抗體(Ab)結(jié)合獲得M1 Exo-Ab。經(jīng)系統(tǒng)給藥后，通過CD47抗體對腫瘤細(xì)胞表面CD47分子的特異性識別增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞靶向。同時，在酸性的腫瘤微環(huán)境下，苯甲酰亞胺鍵被裂解，釋放的抗體導(dǎo)致"don’t eat me"信號通路被阻斷，從而能使巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬增強(qiáng)。

3.2 直接工程化

直接工程化修飾細(xì)胞外囊泡包括通過主動裝載將藥物包裝進(jìn)細(xì)胞外囊泡中，再利用細(xì)胞外囊泡本身的靶向性或者促炎等特性與藥物聯(lián)合起來治療疾病。比如，Wang等[60]提取了M1的外泌體M1-Exos，通過超聲將紫杉醇(PTX)裝載到外泌體中，M1-Exos將PTX靶向遞送到腫瘤組織中，同時M1-Exos能激活初始巨噬細(xì)胞的NF-κB通路，促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，建立局部炎癥環(huán)境，并通過caspase -3介導(dǎo)的途徑增強(qiáng)抗腫瘤活性，兩者的結(jié)合，使PTX-M1-Exos組的抗腫瘤效果顯著增強(qiáng)。Haney等[61]通過超聲或滲透化處理將TPP1裝載進(jìn)巨噬細(xì)胞外囊泡中，顯著提高了TPP1抵抗蛋白酶降解的能力以及遞送到靶細(xì)胞的效率；腹腔注射EV-TPP1后，在晚期嬰兒神經(jīng)元型蠟樣脂褐素病(LINCL)小鼠模型中表現(xiàn)出了EVs的腦積聚和小鼠壽命的延長。

通過物理包裹將疏水性藥物包裹到EVs中是被動裝載的一個例子。疏水相互作用能有效地驅(qū)使小的親脂性物質(zhì)自發(fā)整合到EVs膜中，并且在溫和的環(huán)境條件(25～37 ℃)下進(jìn)行簡單的共孵育就能實現(xiàn)，其負(fù)載效率與外源物質(zhì)的疏水性成正相關(guān)[62]。在Ding等人的研究[63]中，將M1外泌體(M1 Exo)與雙[2,4,5-三氯-6-(戊氧基羰基)苯基]草酸酯(CPPO)和光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)在37 ℃共孵育，通過疏水相互作用將二者裝載在外泌體膜上，隨后將前藥阿霉素(Dox-EMCH)電轉(zhuǎn)進(jìn)外泌體中，構(gòu)建了一種可以自我激活的載藥外泌體(M1CCD)，以實現(xiàn)腫瘤的化學(xué)能激發(fā)的PDT、免疫治療和化療三模式治療。

在細(xì)胞外囊泡表面連接靶向肽等是提高其特異靶向性的重要手段，由于不需要考慮細(xì)胞活性，其反應(yīng)條件較間接工程化更為廣泛，也因此有了更為多樣的修飾方法。Kim等[64]通過超聲將紫杉醇(PTX)裝載到巨噬細(xì)胞的外泌體中，并在其表面通過被動裝載連接氨基乙烷基對甲氧苯甲酰胺-聚乙二醇(AA-PEG)使其能夠靶向肺癌細(xì)胞上過表達(dá)的sigma受體從而顯著提高了化療效果。除共孵育的方法外，通過化學(xué)反應(yīng)在囊泡的膜上連接靶向肽是更為準(zhǔn)確且高效的修飾方法。Li等[65]開發(fā)了一種巨噬細(xì)胞來源的外泌體包覆聚乳酸-乙醇酸(PLGA)納米平臺用于三陰性乳腺癌的靶向化療。他們將外泌體膜包覆在裝載有阿霉素的PLGA納米顆粒上，外泌體的表面通過共價連接用一種多肽修飾以靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞上過表達(dá)的間充質(zhì)-上皮過渡因子(c-Met)。他們還在體外和體內(nèi)的實驗中發(fā)現(xiàn)所設(shè)計的外泌體包覆納米平臺具有良好的腫瘤聚集效果，能顯著提高化療藥物的腫瘤抑制效率。

4 總結(jié)與展望

細(xì)胞外囊泡(EVs)相關(guān)的研究方興未艾。與無機(jī)有機(jī)等化學(xué)納米藥物相比，EVs具有生物內(nèi)源的固有特點，同時其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高、功能化操作簡便等優(yōu)點。而且，細(xì)胞外囊泡還具有與巨噬細(xì)胞相似的性質(zhì)和功能，如趨炎和抗炎特性、腫瘤靶向性、極化巨噬細(xì)胞為M1/M2型、組織修復(fù)能力、抗病原體感染等，在癌癥診斷、液體活檢、基因治療與免疫療法等領(lǐng)域均有重要應(yīng)用價值。

巨噬細(xì)胞外囊泡本身的內(nèi)容物如蛋白和核酸等可以直接影響受體細(xì)胞的生理性質(zhì)因而可以直接作為治療疾病的介質(zhì)，而工程化改造后的巨噬細(xì)胞外囊泡更是提高了其靶向能力和治療效果，相關(guān)研究也越來越多，從簡單的物理包覆到基因工程改造再到代謝標(biāo)記，通過改造細(xì)胞來功能化囊泡的技術(shù)逐漸趨向于在優(yōu)化功能的同時簡化操作，而直接工程化改造囊泡則由于不需要考慮活細(xì)胞而使得操作更為簡便，可能在未來的囊泡工程化中成為主要的改造方法，這些技術(shù)的進(jìn)步將推動該領(lǐng)域的快速發(fā)展。但工程化改造仍有許多問題需要考慮。例如，外來組分是否可以在結(jié)合EVs的同時不破壞其功能?引入外來物質(zhì)是否會產(chǎn)生有害的免疫原性？改造也可能會改變膜的剛性從而改變EVs的細(xì)胞結(jié)合能力等。此外，目前EVs的研究工作還主要集中在動物實驗及預(yù)臨床實驗中，需要更多的實驗來支持實際的臨床應(yīng)用。同時，巨噬細(xì)胞的EVs的機(jī)理研究工作仍需進(jìn)一步開展，例如其生物發(fā)生途徑、結(jié)構(gòu)與組成以及生物學(xué)功能之間的關(guān)聯(lián)，這對于疾病的診斷與治療過程至關(guān)重要。雖然目前基于巨噬細(xì)胞EVs的研究充滿了未知與挑戰(zhàn)，但巨噬細(xì)胞EVs在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景仍然是廣闊無垠的。