PVT1及TNF基因多態(tài)性與2型糖尿病性腎病病位、病性的相關(guān)性研究

紀(jì)春敏，鄭曉軍，洪冠宇，王全興

(泉州市中醫(yī)院 內(nèi)分泌科，福建 泉州 362000)

糖尿病性腎病(Diabetic kindney disease，DKD)是指由糖尿病引起的慢性腎臟病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)白蛋白尿或腎小球?yàn)V過率(GFR)低于60 mL/(min·1.73 m2)超過3個(gè)月，該病是發(fā)達(dá)國家和地區(qū)終末期腎病(ESRD)的首要原因[1]。多數(shù)學(xué)者從臨床辨證論治上將DKD歸屬于中醫(yī)“消渴”“水腫”等范疇[2]。研究發(fā)現(xiàn)腎、肝、脾、胃為糖尿病腎病的主要病位，其主要病性表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜，體現(xiàn)為濕、熱、痰、陰虛、氣虛、血虛、陽虛[3]。

DKD不同病位、病性對DKD病理發(fā)展演變趨勢的影響，與先天因素關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)在不同人群中存在一些基因與DKD易感性相關(guān)，早期識別這些基因?qū)τ谠缙诟深A(yù)DKD意義深遠(yuǎn)。其中漿細(xì)胞瘤異位基因(PVT1)作為唯一一個(gè)與腎臟疾病相關(guān)的長鏈非編碼RNA，與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。PVT1可在糖尿病患者的腎小球系膜細(xì)胞中顯著表達(dá)，下調(diào)PVT1可明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖[5-6]。另外，其還可通過上調(diào)miR-455表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病祖細(xì)胞損傷和凋亡[7]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種多功能促炎細(xì)胞因子，與細(xì)胞凋亡、增殖、炎癥和免疫調(diào)節(jié)等一些病理過程密切相關(guān)。橫斷面研究發(fā)現(xiàn)TNF-α基因rsl800629的A等位基因和AA基因型與糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[8-9]。本研究通過“證素辨證方法”、基因型檢測技術(shù)，進(jìn)一步研究DKD不同病位、病性形成與PVT1基因rs6918698及TNF基因rs1800629多態(tài)性的關(guān)系，旨在初步探討DKD不同病位、病性形成的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2017年1月-2018年6月于泉州市中醫(yī)院內(nèi)分泌科治療的DKD患者195例。同時(shí)對照組納入本院體檢中心健康患者134例。T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017年2型糖尿病防治指南[8]。DKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019年中國糖尿病腎病疾病防治臨床指南[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在30歲以下或70歲以上；②合并其他嚴(yán)重并發(fā)癥者，如高血糖高滲狀態(tài)、糖尿病酮癥酸中毒等；③合并嚴(yán)重的心、肝等并發(fā)癥；④因其他因素導(dǎo)致ACR升高者，如泌尿系感染、發(fā)熱、運(yùn)動等；⑤出現(xiàn)腎功能迅速惡化，但無持續(xù)蛋白尿者；⑥導(dǎo)致繼發(fā)性腎損害的其他疾病，如原發(fā)性腎小球疾病、高血壓、心功能不全、血液病、自身免疫性疾病、腫瘤及藥物等；⑦精神病患者。所有研究對象彼此間無血緣關(guān)系，并且均為我市常住人群。本研究所有研究對象均簽署知情同意書，且通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核同意。

1.2 研究方法

1.2.1 中醫(yī)證素提取 以《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語》為參照，依據(jù)“600常見癥狀的辨證意義”[10]，制訂規(guī)范化四診信息采集量表，進(jìn)行四診資料的規(guī)范化采集。病理要素和證素的確定參照朱文鋒《證素辨證學(xué)》[11]，以加權(quán)閾值法，結(jié)合四診信息在診斷中的權(quán)重確定。利用“中醫(yī)健康狀態(tài)辨識與咨詢系統(tǒng)v1.0”完成證素積分計(jì)算。根據(jù)積分判定有無證素病理改變，其中0級指證素積分之和<70，判定基本無該證素病理變化；70≤積分<100，歸為1級(輕度病理變化)；100≤積分<150，歸為2級(中度病理變化)；積分≥150，歸為3級(重度病理變化)。各癥狀對某一證素貢獻(xiàn)度之和達(dá)到100分通用閾值時(shí)，該證素得以診斷。

1.2.2 DNA提取 以患者空腹外周靜脈血3 mL為檢測標(biāo)本，輔以中量全血基因組DNA提取試劑盒(DP2102，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA?；蚪MDNA純度和濃度的檢測采用超微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop-2000，美國Thermo公司)進(jìn)行，所有基因組DNA樣本的純度和濃度均滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.3 PVT1及TNF基因多態(tài)性分析 本研究PVT1基因及TNF基因多態(tài)性檢測，采用上海天昊生物科技有限公司自主專利研發(fā)的imLDRTM多重SNP分型試劑盒進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料結(jié)果以例數(shù)表示。各基因型采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算。各組基因型頻率的比較及各基因型證素分布采用R×C卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DKD患者PVT1基因型與病位、病性證素R×C卡方檢驗(yàn)分布

病位證素脾、肝、腎、胃在PVT1基因型CC、GC、GG的分布比例接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病性證素痰、血瘀、濕熱、陽亢、氣滯、血虛、陰虛、陽虛在PVT1基因型CC、GC、GG的分布比例接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但氣虛在風(fēng)險(xiǎn)基因型GC上分布比例顯著升高(P<0.01)。見表1、表2。

表1 DKD患者PVT1基因型與病位證素相關(guān)性分析

表2 DKD患者PVT1基因型與病性證素相關(guān)性分析

2.2 DKD患者TNF基因型與病位、病性證素R×C卡方檢驗(yàn)分布

病位證素肝、脾、腎、胃在TNF基因型AA、GA、GG的分布比例接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病性證素血瘀、濕、熱、陽亢、氣滯、氣虛、血虛、陰虛、陽虛在TNF基因型AA、GA、GG的分布比例接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但痰在風(fēng)險(xiǎn)基因GG上分布比例顯著升高(P<0.05)。見表3、表4。

表3 DKD患者TNF基因型與病位證素相關(guān)性分析

表4 DKD患者TNF基因型與病位證素相關(guān)性分析

3 討論

糖尿病腎病可導(dǎo)致尿毒癥，嚴(yán)重危害人類健康，給公共醫(yī)療帶來了巨大壓力。臨床發(fā)現(xiàn)DKD的發(fā)生并不局限于血糖或血壓控制不達(dá)標(biāo)的患者。研究表明，DKD具有強(qiáng)烈的遺傳易感性，我們提出假設(shè)：DKD的疾病過程是否具有其特征的遺傳易感性。一項(xiàng)家族聚集研究發(fā)現(xiàn)，在同樣都有高發(fā)糖尿病的家庭中，一些家庭罹患DKD的風(fēng)險(xiǎn)大大提高，而另一些家庭卻沒有[11]?？梢娺z傳因素在DKD的疾病進(jìn)程中占據(jù)不容忽視的地位。近年來，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome wide associa-tion study，GWAS)發(fā)現(xiàn)了許多與DKD關(guān)聯(lián)密切的基因和多態(tài)性位點(diǎn)。本課題研究前期成果發(fā)現(xiàn)PVT1基因rs6918698、TNF基因rs1800629與DKD的遺傳易感性顯著相關(guān)(另文發(fā)表)。但這兩個(gè)基因與DKD的病位、病性形成、變化轉(zhuǎn)歸關(guān)系如何，尚缺乏系列報(bào)道。

本課題發(fā)現(xiàn)在病性證素上，與無氣虛比較，氣虛的分布比例在PVT1風(fēng)險(xiǎn)基因型GC上顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示PVT1風(fēng)險(xiǎn)基因GC可能是DKD患者多發(fā)氣虛的遺傳學(xué)基礎(chǔ)之一?！端貑枴そ?jīng)脈別論》言：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行?！比幌驶颊?，雖多飲多食，但食入之品未能利用，反見神疲、虛胖、無力等正氣虛象。正氣虧虛，津液生化伐源，水谷精微運(yùn)化失常，不能為臟腑提供能量。王向明等[12]研究認(rèn)為腎臟能量供應(yīng)是否充足影響著糖尿病腎病的病情進(jìn)展，其將腎氣虛比象于糖尿病腎病腎臟能量供應(yīng)障礙，提出具有抗氧化應(yīng)激、減輕線粒體損傷以及增進(jìn)ATP合成的補(bǔ)氣類中藥可一定程度上使腎臟損傷得以改善。《圣濟(jì)總錄》云：“消渴日久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，小便至甜，有膏”，從先天因素分析了消渴病腎病與腎氣虛密切相關(guān)。腎主水、藏精，腎氣虛，則氣化失司，蒸騰乏源，水液失布，精關(guān)不固，發(fā)為水腫、蛋白尿。無論是先天不足，還是后天虧虛，氣虛貫穿消渴病腎病的整個(gè)發(fā)病過程。臨床辨證論治上，王震宇等[13]從552例糖尿病腎病患者中分析發(fā)現(xiàn)氣虛為糖尿病腎?、颉羝诤诵淖C型。遠(yuǎn)方教授認(rèn)為虛是導(dǎo)致糖尿病腎小球動脈硬化的始動因素，在治療消渴病腎病上，主張利用升清降濁法，以補(bǔ)中益氣湯加味，重用黃芪及葛根為君藥已達(dá)補(bǔ)中氣、升清陽之效，臨床收效顯著[14-15]。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載黃芪為補(bǔ)氣圣藥，古籍文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)氣藥黃芪在糖尿病腎病中應(yīng)用最多[16]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中富含的黃芪多糖可使糖尿病腎病腎臟病理改變減輕，抑制腎間質(zhì)纖維化，使腎功能改善。黃芪通過調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2動態(tài)平衡，從而減少腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積，延緩腎纖維化進(jìn)程[17]。

與非痰證相比，痰證在TNF風(fēng)險(xiǎn)基因GG的分布比例上顯著升高(P<0.05)，提示攜帶GG風(fēng)險(xiǎn)基因的人群更容易兼夾痰證。消渴病機(jī)以本虛標(biāo)實(shí)為主，臨床生理演變過程中痰邪貫穿其中?！端貑枴て娌≌撈穼⑾什C(jī)治法概括為“此肥美之所發(fā)也，此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢轉(zhuǎn)為消渴，治之以蘭，除陳氣也”。陳氣實(shí)則脾胃運(yùn)化失常所致的病理產(chǎn)物“痰邪”。痰作為病理產(chǎn)物，又是致病因素，其可使機(jī)體臟腑功能失調(diào)，是糖尿病重要的發(fā)病基礎(chǔ)，如此惡性循環(huán)，變證叢生，成為糖尿病合并DKD的主要原因。痰飲致病，隨氣流竄至全身，無處不到，產(chǎn)生各種不同病變。《雜病源流犀燭·痰飲源流》說：“其為物則流動不測，故其為害，上至巔頂，下至涌泉，隨氣升降，周身內(nèi)外皆到，五臟六腑俱有?！迸c丹溪所述“善治痰者，必先治氣”不謀而合。王麗華等[18]擬祛痰通絡(luò)方治療糖尿病腎病大鼠，發(fā)現(xiàn)治療后糖尿病腎病大鼠腎臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)明顯增強(qiáng)，可見，其腎臟保護(hù)作用的核心機(jī)制可能在于祛痰通絡(luò)湯可有效降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

綜上所述，特定體質(zhì)的人群在某些證上的易患性升高，恰恰說明證存在一定的基因遺傳學(xué)基礎(chǔ)。陳可冀[19]認(rèn)為以病證結(jié)合為法，中醫(yī)藥治療DKD總體療效優(yōu)于單純西藥治療。本研究發(fā)現(xiàn)DKD患者中氣虛質(zhì)及合并痰證人群具有典型的基因遺傳多態(tài)性特點(diǎn)，一定程度闡釋了不同證的形成與先天因素的相關(guān)性，也為臨床遣方用藥治療DKD提供了基因遺傳學(xué)依據(jù)。