冬蟲(chóng)夏草提取物及核苷酸類(lèi)成分對(duì)堿性磷酸酶的抑制活性研究

張 浩，李文佳，黃 琦，錢(qián)正明，楊豐慶*

(1.重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331；2.宜昌山城水都冬蟲(chóng)夏草有限公司，湖北 宜昌 443000)

堿性磷酸酶(ALP)是一種金屬蛋白酶，在蛋白質(zhì)、核酸或小分子去磷酸化過(guò)程中不可或缺[1-2]。ALP在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性和信號(hào)通路中也發(fā)揮著重要作用。通常，有兩種類(lèi)型的ALP同工酶，包括存在于生殖細(xì)胞(GCAP)、腸道(IAP)和胎盤(pán)(PLAP)[3]中的組織特異性ALP，以及主要存在于肝臟、骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟等多種組織中的非特異性ALP(TNAP)。目前，ALP已被證實(shí)為許多疾病的重要生物標(biāo)志物，如肝病[4]、老年癡呆[5]、膽道梗阻[6]、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移[7]和血管礦化[8]等。因此，開(kāi)發(fā)TNAP抑制劑是治療焦磷酸鹽代謝障礙的一種潛在方法。

冬蟲(chóng)夏草為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，2020版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌Cordycepssinensis(BerK.) Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座和幼蟲(chóng)尸體的干燥復(fù)合體，具有補(bǔ)腎益肺、止血化痰之功效[9]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲(chóng)夏草化學(xué)成分復(fù)雜，主要藥效成分包括核苷、多糖、甘露醇、麥角甾醇、氨基酸、脂肪酸等[10]，具有抗衰老、抗氧化、提高機(jī)體免疫力的作用，對(duì)心腦血管疾病、呼吸道系統(tǒng)疾病、肝腎疾病等也具有良好的治療效果[11-12]，探究冬蟲(chóng)夏草提取物和主要核苷酸類(lèi)成分對(duì)ALP的抑制作用具有重要意義。因此，本文評(píng)價(jià)了27個(gè)冬蟲(chóng)夏草水提物和5個(gè)核苷酸成分的ALP抑制活性，以期為蟲(chóng)草類(lèi)藥材治療疾病及加工提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

小牛腸堿性磷酸酶(EC 3.1.3.1)(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：M26N11Y127666)；4-硝基苯磷酸二鈉鹽(p-NPP)(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：7031021)；腺苷5′-單磷酸二鈉鹽(阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，批號(hào)：P1626447)；尿苷5′-單磷酸二鈉鹽(阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，批號(hào)：P03930)；胞苷5′-磷酸二鈉鹽(阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，批號(hào)：P03925)；鳥(niǎo)苷-5′-單磷酸二鈉鹽(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：787171170)；胸苷-5′-單磷酸二鈉鹽(上海西格瑪奧德里奇試劑有限公司，批號(hào)：061M1420V)；鹽酸(成都科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：2020040801)；三(羥基甲基)氨基甲烷(Tris)(成都科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20191216)。天然冬蟲(chóng)夏草樣品采集自西藏那曲、四川和青海。所有人工培植冬蟲(chóng)夏草均為宜昌山城水都冬蟲(chóng)夏草有限公司提供。所有樣品均存放于重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的儀器包括FE 28 pH計(jì)(梅特勒-托利多國(guó)際有限公司)、超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)、UV-5500 PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、SHZ-82恒溫振蕩器(江蘇常州金壇城西崢嶸實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng))、CP411-1料理機(jī)(廣東德?tīng)栯娖饔邢薰?、研磨機(jī)(IKA TUBE-MILL 100 control，德國(guó)，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司(IKA中國(guó)))、烘箱(Binder ED115，德國(guó)Binder公司)，以及ATSgene18 20A基因型超純水機(jī)(重慶市安特生環(huán)保設(shè)備有限公司)。

1.2 冬蟲(chóng)夏草樣品和溶液制備

采用Tris-HCl緩沖液(10.0 mM，pH=8.0)制備酶活性為0.6 U/mL的ALP溶液。采用Tris-HCl緩沖液(10.0 mM，pH=8.0)制備濃度為0.8 mmol·L-1的p-NPP。濃度為10.0 mmol·L-1的5個(gè)核苷酸類(lèi)小分子化合物分別溶解在10.0 mmol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)中。

采用沸水提取法制備冬蟲(chóng)夏草水提取物。稱(chēng)取0.5 g冬蟲(chóng)夏草粉末于玻璃試管中，加入5.0 mL(95 ℃)超純水，蓋上玻璃塞，精確稱(chēng)量并置于超聲波清洗器中(65 ℃～70 ℃)超聲提取30.0 min。提取后冷卻至室溫，將混合溶液以5 000 r/min離心10.0 min，最后取上清液過(guò)0.22 μm尼龍膜(上海泰坦科技有限公司)，即得。提取液在使用前儲(chǔ)存在-20℃冰箱中。

1.3 ALP抑制活性測(cè)定過(guò)程

首先，將15.0 μL ALP(0.6 U/mL)添加至30.0 μL小分子化合物(10.0 mmol·L-1)或蟲(chóng)草提取液中。接著加入15.0 μL p-NPP(3.2 mmol·L-1)啟動(dòng)酶促反應(yīng)。40 ℃孵育2.0 min后，利用紫外分光光度計(jì)于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。

1.4 分子對(duì)接研究

分子對(duì)接研究用于預(yù)測(cè)核苷酸類(lèi)小分子化合物與ALP的結(jié)合位點(diǎn)和模式。利用Chem Office 3D繪制核苷酸類(lèi)小分子化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。已知的ALP晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：1EW2)來(lái)自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[13-14]。利用拉馬克遺傳算法進(jìn)行對(duì)接研究。網(wǎng)格框中心值沿X、Y和Z軸設(shè)置為24.349、21.359和9.000，網(wǎng)格間距為0.375 ?，大小值設(shè)定為X=100、Y=100和Z=100。對(duì)接后，分析最低結(jié)合能的構(gòu)象。利用Discovery Studio繪制對(duì)接復(fù)合體的2D圖形。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制活性評(píng)價(jià)

由表1可知，冬蟲(chóng)夏草水提物的ALP抑制活性均在50%以上(西藏那曲樣品除外)。比較不同的加工方式，發(fā)現(xiàn)陰干和烘干處理的冬蟲(chóng)夏草ALP抑制活性最好，凍干處理的冬蟲(chóng)夏草ALP抑制活性較差。此外，同一加工方式下不同批次間，曬干處理的冬蟲(chóng)夏草的ALP抑制活性批次間差異較大。比較西藏人工培植和西藏那曲冬蟲(chóng)夏草ALP抑制活性發(fā)現(xiàn)，人工培植的冬蟲(chóng)夏草酶抑制活性較好。比較不同地區(qū)的冬蟲(chóng)夏草發(fā)現(xiàn)，ALP抑制活性也存在較大差異。以上結(jié)果表明因地理環(huán)境、氣候、加工方式等的不同導(dǎo)致冬蟲(chóng)夏草樣品ALP抑制活性存在差異。進(jìn)一步考察5個(gè)核苷酸小分子化合物的ALP抑制活性發(fā)現(xiàn)，AMP-2Na和CMP-2Na具有相對(duì)較好的酶抑制活性。

表1 5個(gè)核苷酸和27個(gè)蟲(chóng)草提取物對(duì)堿性磷酸酶的抑制活性

2.2 分子對(duì)接研究

5個(gè)核苷酸小分子化合物在ALP上的最佳對(duì)接構(gòu)象如圖1所示，ALP與5個(gè)核苷酸小分子化合物之間的結(jié)合能、氫鍵和氨基酸殘基或金屬離子相互作用見(jiàn)表2。AMP和ARG166、SER92、THR431、HIS153之間存在氫鍵；GMP和SER92、ARG166、GLU429之間存在氫鍵；TMP和HIS358、ARG166、SER92、HIS153、TYR169、ARG150之間存在氫鍵；UMP和PRO90、HIS358、ARG166之間存在氫鍵；CMP和SER92、ARG166、ASN167之間存在氫鍵。此外，金屬-受體相互作用存在于5個(gè)核苷酸小分子化合物和ALP之間。總之，分子對(duì)接結(jié)果表明氫鍵和金屬-受體相互作用是配體與ALP結(jié)合的重要作用力。此外，含有羥基、羧基或磷酸基團(tuán)的化合物可能與ALP的極性基團(tuán)(-NH2、-OH和Zn2+)形成氫鍵或金屬受體相互作用。

圖1 5個(gè)核苷酸小分子化合物在ALP上的最佳對(duì)接構(gòu)象

表2 5個(gè)核苷酸類(lèi)小分子化合物與堿性磷酸酶的對(duì)接結(jié)果

3 結(jié)論

本研究評(píng)價(jià)了27個(gè)冬蟲(chóng)夏草水提物和5個(gè)核苷酸成分的ALP抑制活性。測(cè)定結(jié)果表明冬蟲(chóng)夏草具有較好的ALP抑制活性，不同加工方式與不同來(lái)源樣品的ALP抑制活性存在差異。這可能因地理環(huán)境、氣候、加工方式等的不同，從而導(dǎo)致冬蟲(chóng)夏草樣品ALP抑制活性存在差異。對(duì)5個(gè)核苷酸小分子化合物的ALP抑制活性研究發(fā)現(xiàn)，AMP-2Na和CMP-2Na具有相對(duì)較好的酶抑制活性。分子對(duì)接結(jié)果表明氫鍵和金屬-受體相互作用是核苷酸類(lèi)小分子化合物與ALP結(jié)合的重要作用力。綜上，本研究結(jié)果可為蟲(chóng)草類(lèi)藥材治療疾病及加工提供參考。