降糖益腎丸抗糖尿病腎病大鼠腎損傷作用實驗研究

謝 瑜，楊 蕙，雷 昌，廖小娟*，劉艷紅，胡月子，鄒菊英，鄧鈺文，王艾琳

(1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心/湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，可引起腎小球硬化形成結節(jié)并導致終末期腎病，為糖尿病患者致死、致殘的主要原因。國際糖尿病聯(lián)合會預計2035年世界范圍內的糖尿病患者將達到5.92億[1]，而糖尿病患者約50%會發(fā)生DN，且DN人群發(fā)展至ESRD的比例約40%[2]。我國是DN患病人數最多的國家，發(fā)展到晚期只能血液透析或換腎，給患者帶來極大的身心痛苦和經濟負擔。

現(xiàn)代醫(yī)學在緩解患者的臨床癥狀及降低尿蛋白等方面存在局限性，其化學藥物治療作用途徑單一，且存在易復發(fā)、副作用大等缺點。中醫(yī)臨床結合辨證論治指導及復方中藥治療消渴病腎病早期(西醫(yī)臨床Mogensen方案的前3期)，可有效逆轉DN的發(fā)生發(fā)展。本研究中降糖益腎丸(湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院院內制劑，批準文號：湘藥制字Z20080821)具有多途徑、多靶點的作用特點，控制DN癥狀療效確切。為了進一步明確降糖益腎丸抗DN的作用，本實驗以高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)造模后的模型大鼠為研究對象，觀察降糖益腎丸的抗DN作用，為中醫(yī)藥防治DN研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SD實驗大鼠36只均購自長沙市天勤生物技術有限公司，SPF級，許可證號：SCXK(湘)2019-0014，雄性，體質量(300±20) g；高脂高糖飼料購自長沙市天勤生物技術有限公司；飼養(yǎng)籠具、墊料、飼料、飲水均按SPF級實驗動物的要求進行制備與消毒。

1.2 試藥

鹽酸二甲雙胍片(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.25 g，批號：A2011056)；厄貝沙坦片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格0.15 g，批號：201110JB)；降糖益腎丸(由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室生產，批號：20200407)。

1.3 儀器與試劑

AE224型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；5804R離心機(德國Eppendorf公司)；GA-3型血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)；SE-150高速粉碎機(永康市圣象電器有限公司)；SOPTOP CX-40生物顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；M3LY630T顯微成像系統(tǒng)(Sony Exmor CMOS Sensor)。

鏈脲佐菌素(STZ，S17049，18883-66-4 USP級，98.5%，上海源葉生物技術有限公司)；4%多聚甲醛通用型組織固定液(BL539A，biosharp)；滅菌注射用水(石家莊四藥有限公司，批號：2005203201)，其余實驗用水為重蒸餾水；羧甲基纖維鈉(CMC-Na，批號：200401，安徽山河藥用輔料股份有限公司)；蘇木素、伊紅染色液(珠海貝索生物技術有限公司)。

1.4 動物造模、分組及給藥

SPF級雄性SD大鼠按照體質量隨機分為正常對照組與模型組。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)3天后，按體質量換算予單次腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。除對照組外其余大鼠給予高脂高糖飼料+飲水飽和喂養(yǎng)3天后，予單次腹腔注射STZ 60 mg/kg(STZ臨用前用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解，pH=4.4，4 ℃，配制成1%STZ溶液，避光冰浴中進行)。72 h后，尾靜脈采血，用快速血糖儀測空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG穩(wěn)定于16.7 mmol/L及以上，列入觀察對象。繼續(xù)給予高脂高糖飲食8周，24 h尿蛋白定量≥30 mg/dl/24 h，即提示糖尿病腎病造模成功[3-6]。

造模成功后的大鼠隨機分為5組：DN模型組、DN模型+降糖益腎丸高劑量組(5.4 g/kg/d)、DN模型+降糖益腎丸中劑量組(2.7 g/kg/d)、DN模型+降糖益腎丸低劑量組(1.35 g/kg/d)、DN模型+鹽酸二甲雙胍(180 mg/kg/d)+厄貝沙坦(27 mg/kg/d)組，每組6只。分組后開始給藥，對照組、DN模型組給予等體積蒸餾水，各組大鼠均相應給藥4周[7]。

1.5 動物處理及樣本收集

給藥結束后記錄大鼠的體質量，收集各組大鼠24 h尿液并進行一般情況觀察；采集血液分別注入含有抗凝劑的離心管里，混勻后在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上層血清樣品于-80 ℃冰箱中保存，備用。處死各組大鼠，于冰上摘取腎臟，剝離腎包膜，置于4%多聚甲醛通用型組織固定液中保存，備用。

1.6 指標檢測

1.6.1 一般情況觀察 觀察各組大鼠的毛色、活動情況、食欲、排便等一般情況，根據大鼠體質量、腎臟質量計算腎指數，腎指數(%)=腎質量(g)/體質量(g)。

1.6.2 腎功能檢測 采用自動生化儀檢測各組大鼠24 h尿蛋白量(24 h urine protein，24h-Pro)及血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(Serum creatinine，Scr)。

1.6.3 腎臟組織染色形態(tài)學觀察 腎樣本固定液中24 h后，取適量腎皮質，二甲苯透明，分別用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇等脫水，水洗后蘇木素染色，水洗后鹽酸分化，流水洗后伊紅染色，水洗，脫水，吹干封片，石蠟包埋，制成3 μm石蠟切片，電鏡觀察大鼠腎組織腎小球的形態(tài)結構變化[3]。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況觀察

與對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)活動度低，精神萎靡，毛色枯黃，出現(xiàn)弓背、進食量減少、多飲等現(xiàn)象，各藥物組大鼠癥狀有不同程度減輕。結果見表1。

表1 各組大鼠在給藥結束后一般情況觀察

2.2 各組大鼠腎指數情況比較

與對照組比較，模型組大鼠腎指數明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組大鼠腎指數顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖1。

注：與空白對照組比較*P≤0.01；與DN模型組比較**P≤0.01。圖1 各組大鼠腎指數情況比較

2.3 各組大鼠FBG、24h-Pro、BUN、Scr含量比較

與對照組比較，模型組大鼠FBG、24h-Pro、Scr、BUN的含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組與中、高劑量組大鼠FBG、24h-Pro、Scr、BUN的含量均顯著降低，低劑量組大鼠FBG、24h-Pro、Scr、BUN的含量亦下降(P<0.01或P<0.05)。與中、高劑量組比較，低劑量組FBG、24h-Pro、Scr、BUN的含量亦升高(P<0.01)。結果見表2。

表2 各組大鼠腎功能指標比較

2.4 腎臟組織染色形態(tài)學觀察

正常對照組大鼠腎細胞正常排列，形態(tài)結構正常。與正常對照組比較，模型組腎小球體積明顯增大，腎小球出現(xiàn)較多的空泡，包曼氏囊腔呈現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，且腎小管潰腫，上皮細胞脫落至管腔，皮質區(qū)腎小管有擴張并空泡變，表明腎小球有炎癥浸潤現(xiàn)象，存在一定程度的損傷。與模型組比較，各藥物組大鼠腎小球大多數體積明顯變小，殘留個別腎小球有所增大，空泡較少，包曼氏囊腔皺縮程度較輕，腎小管內見少量水腫液，部分腎小管擴張，腎小球受損程度有所緩解。結果見圖2。

A.正常對照組；B.糖尿病腎病模型組；C.糖尿病腎病模型+降糖益腎丸高劑量組；D.糖尿病腎病模型+降糖益腎丸中劑量組；E.糖尿病腎病模型+降糖益腎丸低劑量組；F.糖尿病腎病模型+陽性藥組圖2 大鼠腎臟組織HE染色(×100)

3 討論

自發(fā)性動物模型模擬人類DN，其培養(yǎng)困難，造價高昂?；蚬こ绦∈筮z傳背景清晰，造模時間短、成模效果較好，但大多數基因工程小鼠與人類DN仍然存在差距[8]。將致病基因與易感模型鼠結合可以快速地建立DN模型，但有待深入研究。目前化學誘導動物模型能模擬早期人類DN模型，為加快腎臟病理變化，在高脂高糖飲食喂養(yǎng)的情況下，結合單側或部分腎切后留存腎的代償性破壞，同時使用小劑量STZ腹腔注射，即三聯(lián)法“高脂高糖飲食+手術切除單腎+注射STZ”造模，可加速糖尿病腎臟病變的進展，縮短實驗周期。但實驗操作過程中大鼠易感染或出血導致死亡[9]，考慮到實驗成本及更接近人類DN模型，本研究中加大實驗周期代替單側腎切除。

DN是糖尿病高血糖引起腎小球微血管病變介導的腎臟疾病，糖尿病發(fā)展至DN的病理改變主要是腎小球微血管內皮細胞(Glomerular endothelial cells，GECs)的結構和功能障礙[10]。GECs位于腎小球微血管管腔內血液循環(huán)和血管壁之間，呈連續(xù)排列且結構特殊，分為窗孔、基底層和糖萼[11]。豐富的窗孔在水、小溶質通過毛細血管壁的過程中發(fā)揮濾過作用，同時糖萼可調節(jié)血管通透性、血流平衡并排斥血細胞遠離血管壁[12]。GECs參與構成腎小球濾過屏障，高糖持續(xù)刺激導致GECs微循環(huán)障礙，表現(xiàn)為腎小球濾過屏障通透性改變、蛋白尿發(fā)生及腎小球硬化，是DN發(fā)生發(fā)展的關鍵[13]。因此，本研究對于解析降糖益腎丸控制早期高血糖導致的腎小球微血管病變與腎小球濾過屏障受損具有一定的價值。

降糖益腎丸治療DN早期療效確切，在多年臨床應用中無不良反應，安全可靠[14]。本研究證實了降糖益腎丸能夠降低FBG、24h-Pro、Scr、BUN的含量，對模型大鼠具有明顯的抗DN腎小球損傷作用，為降糖益腎丸治療DN的臨床癥狀、改善腎功能提供了科學依據，為該藥的臨床推廣應用奠定了基礎。