二斑葉螨取食抗、感螨木薯品種對茉莉酸信號途徑基因表達(dá)的影響

韓志玲 陳青 梁曉 伍春玲 劉迎 伍牧鋒 徐雪蓮

（1. 海南大學(xué)植物保護學(xué)院，?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室/海南省熱帶作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，?？?571101；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院/海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室，三亞 572000）

木薯（Manihot esculenta Crantz）是全球熱帶地區(qū)僅次于水稻和玉米的第三大糧食作物［1］，為100多個國家近10億人口提供碳水化合物來源［2-3］，同時木薯廣泛應(yīng)用于食品加工、飼料加工和新能源開發(fā)等領(lǐng)域，市場需求量大［4］。我國木薯主栽區(qū)有廣西、海南、云南、廣東、福建、江西等［5-6］，但當(dāng)前70%以上的木薯原料依賴進口，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)加工需要［4］。

二斑葉螨（Tetranychus urticae Koch）是世界危險性害螨，寄主植物超過1 100多種［2，7］，該螨為木薯四大有害生物之一［8］，主要以成蟲或若蟲刺吸葉片為害，為害初期僅在葉脈附近出現(xiàn)失綠斑點，中后期斑點逐漸擴大連片，葉片大面積褪綠褐化。蟲口密度大時，被害葉片布滿絲網(wǎng)，提前脫落［7］，阻礙植株營養(yǎng)生長，引起產(chǎn)量大幅下降，嚴(yán)重時可導(dǎo)致絕收，對木薯的安全生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅［9-10］。當(dāng)前二斑葉螨的防治依然依賴于化學(xué)藥劑，但由于其生活史短、繁殖速度快、環(huán)境適應(yīng)能力和隱蔽性強，加之農(nóng)藥的不合理使用導(dǎo)致二斑葉螨對多數(shù)殺螨劑產(chǎn)生了不同程度的抗性［11］，同時也造成產(chǎn)品和產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境安全問題突出。因此，亟需發(fā)展綠色高效、環(huán)境友好的二斑葉螨防控新策略。

誘導(dǎo)和提高作物自身的免疫防御反應(yīng)在害蟲防控中的重要性越發(fā)得到重視［12-14］。茉莉酸（jasmonic acid，JA）是自然界中廣泛存在的一種植物內(nèi)源激素，在植物生長、發(fā)育及逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用［15］，同時還是激活植物免疫防御系統(tǒng)的信號分子［16-18］。無論是植物內(nèi)源產(chǎn)生的JA，還是外源噴施的JA類物質(zhì)均能在作物被有害生物脅迫時激活植株防御反應(yīng)，誘導(dǎo)JA信號途徑介導(dǎo)的作物抗性相關(guān)的基因表達(dá)量、蛋白酶活性、次生代謝物質(zhì)含量等的變化［19-23］。研究表明，上述生理生化指標(biāo)的變化幅度與作物受害程度和時間關(guān)系密切，這在煙粉虱與番茄［24-25］、小綠葉嬋與茶樹［26］、柑橘全爪螨與柑橘［27］、益生菌EG-2與辣椒［28］的互作研究中均得到證實。

迄今為止，對于二斑葉螨與木薯互作時，是否影響JA信號途徑基因表達(dá)的害螨密度和取食時間效應(yīng)仍鮮見報道。本研究以抗、感螨木薯品種為參試材料，系統(tǒng)分析比較不同密度二斑葉螨取食不同時間后，JA信號途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化趨勢及其在抗、感螨木薯品種間的差異，以初步明確引起抗、感螨木薯品種JA信號途徑基因顯著差異表達(dá)的害螨密度和取食時間范圍，為闡明茉莉酸信號途徑在木薯抗蟲性中的重要作用及抗螨種質(zhì)資源鑒定評價提供理論依據(jù)與參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試二斑葉螨 二斑葉螨為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室室內(nèi)以豇豆長期繼代飼養(yǎng)的試驗種群。飼養(yǎng)條件為溫度（28±2）℃，相對濕度為（75±5）%，光照為L 16 h/8 h D。選擇發(fā)育歷期相同、大小一致的雌成螨進行后續(xù)試驗。

1.1.2 供試木薯 抗螨木薯種質(zhì)C1115，感螨木薯種質(zhì)面包［29］由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃提供。木薯以種莖進行營養(yǎng)繁殖，種植土（土壤∶泥炭土∶珍珠巖=1∶1∶1）濕度保持在（75±5）%，自然光種植。待木薯生長約60 d后，選擇長勢一致的健康抗、感螨木薯植株進行害螨接種［29］。

1.2 方法

1.2.1 害螨接種與取樣 每株木薯選擇植株中部對應(yīng)相同位置的葉片，用吸蟲器小心吸取不同數(shù)量的二斑葉螨接種于單張木薯葉片的背面，每張葉的害螨密度分別設(shè)置為15、25、35、45、50和55頭螨/葉，并在葉柄基部涂抹羊毛脂以防止害螨逃逸。分別于螨害1、2、4和8 d后采集不同害螨密度的葉片，并將葉背的害螨移除后提取葉片RNA，同時以同一時間采集的未接螨的相同品種木薯葉片為對照，每個螨害密度和螨害時間均設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 RNA提取及cDNA第一條鏈的合成 參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，美國）說明書提取木薯葉片RNA，取去除gDNA后的RNA樣品1.0 μg進行cDNA第一條鏈的合成，合成方法參照RT EasyMix for qPCR試劑盒（TOLOBIO，中國）。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)布的木薯JA信號途徑關(guān)鍵基因DAD1、LOX2、OPR3和JAR1序列設(shè)計qPCR引物（表1）。cDNA樣品經(jīng)RNase-free ddH2O稀釋160倍后作為qPCR的模板，以木薯Metub為內(nèi)參基因［30］（表1）。qPCR反應(yīng)體系的配制參照2×Q3 SYBR qPCR Master Mix試劑盒（TOLOBIO，中國）。qPCR反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。使用LightCycler?96儀器（Roche，瑞士）默認(rèn)溶解曲線程序采集溶解曲線。分別以未受螨害的木薯JA途徑基因的表達(dá)量歸一化設(shè)置為1.0，螨害后的JA途徑基因的表達(dá)量變化情況以為害前的相對倍數(shù)表示，根 據(jù)Livak等［31］的2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt2-ΔCt1，ΔCt1為2個樣本內(nèi)參基因的Ct值差值，ΔCt2為2個樣本目的基因的Ct值差值）方法計算而得，每個處理均設(shè)置3個重復(fù)，目的基因在2個樣本間的相對表達(dá)量為3個重復(fù)的平均值。

表1 木薯JA信號途徑基因qPCR分析的引物Table 1 qPCR primers for the the expression analysis of jasmonic acid（JA）pathway genes in cassava

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel進行數(shù)據(jù)匯總整理，使用統(tǒng)計學(xué)軟件DPS（V15.10）進行不同害螨密度和不同為害時間的基因表達(dá)量差異分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進行數(shù)據(jù)間的多重比較（顯著性水平均為α=0.05）。

2 結(jié)果

2.1 抗、感參照木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后OPR3表達(dá)量差異分析

圖1結(jié)果表明，抗、感木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后JA信號途徑基因OPR3表達(dá)量變化趨勢差異顯著。隨害螨密度的增加及為害時間的延長，抗螨木薯品種C1115中OPR3表達(dá)量總體上均呈現(xiàn)出先顯著升高再顯著降低的趨勢（P＜0.05），其中在35-50頭螨/葉的害螨密度下以及1-2 d的為害時間內(nèi)，OPR3的表達(dá)量均維持在為害前的2.89倍以上。而感螨木薯品種面包的OPR3表達(dá)波動較大，在15-25頭螨/葉時OPR3表達(dá)量隨害螨密度增加而顯著降低（P＜0.05），在35-50頭螨/葉時表達(dá)量又隨害螨密度增加而顯著升高（P＜0.05），并且在45-50頭螨/葉，為害1-4 d的時間內(nèi)，OPR3的表達(dá)量均維持在為害前的2.15倍以上，而過高的害螨密度和較長的為害時間均導(dǎo)致抗、感木薯品種中OPR3表達(dá)量的顯著降低。進一步比較抗、感品種之間OPR3的表達(dá)量差異發(fā)現(xiàn)，在害螨密度為25-50頭螨/葉范圍內(nèi)，在為害時間為2-4 d時，C1115的OPR3表達(dá)量顯著高于面包（P＜0.05）?？傊l(fā)現(xiàn)35-50頭螨/葉，為害2 d后，抗、感木薯品種的OPR3表達(dá)量均較為害前顯著提高，并且2個品種間的表達(dá)量差異最顯著，即抗螨品種中OPR3表達(dá)量顯著高于感螨品種（P＜0.05）。

2.2 抗、感參照木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后LOX2表達(dá)量差異分析

通過對二斑葉螨取食后的抗、感木薯品種葉片中LOX2表達(dá)量分析，結(jié)果（圖2）表明，抗、感木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后JA信號途徑基因LOX2表達(dá)量變化趨勢差異顯著。隨害螨密度的增加及為害時間的延長，抗螨木薯品種C1115中LOX2的表達(dá)量總體上均呈現(xiàn)出先顯著升高再顯著降低的趨勢（P＜0.05），其中，在50-55頭 螨/葉的害螨密度下以及1-2 d的為害時間內(nèi)，LOX2的表達(dá)量均維持在為害前的2倍以上，8 d時LOX2的表達(dá)量急劇降低至螨害前水平。而感螨木薯品種面包的LOX2表達(dá)量與抗螨木薯品種C1115的LOX2表達(dá)量呈相反趨勢，LOX2表達(dá)量隨害螨密度的增加及為害時間的延長呈現(xiàn)出先顯著降低再顯著升高的趨勢，在45-50頭螨/葉時LOX2表達(dá)量隨害螨密度增加而顯著降低（P＜0.05），并且在45-50頭螨/葉，為害1-4 d的時間內(nèi)，LOX2的表達(dá)量下降到螨害前水平。進一步比較抗、感品種之間LOX2的表達(dá)量差異發(fā)現(xiàn)，在害螨密度為45-50頭/螨范圍內(nèi)，在為害時間為2 d時，C1115的LOX2表達(dá)量顯著高于面包（P＜0.05）。綜上所述，發(fā)現(xiàn)45-55頭螨/葉，為害2 d后，抗、感木薯品種的LOX2表達(dá)量均較為害前顯著提高，并且2個品種間的表達(dá)量差異最顯著，即抗螨品種中LOX2表達(dá)量顯著高于感螨品種（P＜0.05）。

2.3 抗、感參照木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后DAD1表達(dá)量差異分析

通過對二斑葉螨取食后的抗、感木薯品種葉片中DAD1表達(dá)量分析，結(jié)果（圖3）表明，抗、感木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后JA信號途徑基因DAD1表達(dá)量變化趨勢差異顯著。隨害螨密度的增加及為害時間的延長，抗螨木薯品種C1115中DAD1的表達(dá)量總體上均呈現(xiàn)出先顯著升高再顯著降低的趨勢（P＜0.05），其中，在15頭螨/葉的害螨密度下以及2-4 d的為害時間內(nèi)，DAD1的表達(dá)量均維持在為害前的4.37倍以上。而感螨木薯品種面包的DAD1的表達(dá)量又隨害螨時間增加而呈現(xiàn)先顯著升高后降低的趨勢（P＜0.05），并且在35、45和55頭螨/葉，為害2 d的時間內(nèi)，DAD1的表達(dá)量均維持在為害前的2.56倍以上，而過高的害螨密度和較長的為害時間將導(dǎo)致抗、感木薯品種中DAD1表達(dá)量的顯著家升高。進一步比較抗、感品種之間DAD1的表達(dá)量差異發(fā)現(xiàn)，在害螨密度為15頭/螨范圍內(nèi)，在為害時間為2-4 d時，C1115的DAD1表達(dá)量顯著高于面包（P＜0.05）。綜上所述，發(fā)現(xiàn)15、35、45和55頭螨/葉，為害2 d后，抗、感木薯品種的DAD1表達(dá)量均較為害前顯著提高，并且2個品種間的表達(dá)量差異最顯著（P＜0.05）。

圖3 不同密度二斑葉螨為害不同時間后DAD1的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative transcriptions of DAD1 gene in miteresistant and mite-susceptible cassava cultivars after infested by the mites of different densities at different time

2.4 抗、感參照木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后JAR1表達(dá)量差異分析

通過對二斑葉螨取食后的抗、感木薯品種葉片中JAR1表達(dá)量分析，結(jié)果（圖4）表明，抗、感木薯品種被不同密度二斑葉螨取食不同時間后JA信號途徑基因JAR1表達(dá)量變化趨勢差異顯著。隨害螨密度的增加及為害時間的延長，抗螨木薯品種C1115中JAR1的表達(dá)量總體上均呈現(xiàn)出先顯著升高再顯著降低的趨勢（P＜0.05），其中在45-55頭螨/葉的害螨密度下以及1-2 d的為害時間內(nèi)，JAR1的表達(dá)量均維持在為害前的1.9倍以上。而感螨木薯品種面包的JAR1的表達(dá)量隨害螨密度增加而顯著降低（P＜0.05）。在15頭螨/葉，為害1-2 d的時間內(nèi)，JAR1的表達(dá)量均維持在為害前的0.85倍以上，而過高的害螨密度和較長的為害時間將導(dǎo)致抗、感木薯品種中JAR1表達(dá)量的顯著降低。進一步比較抗、感品種之間JAR1的表達(dá)量差異發(fā)現(xiàn)，在害螨密度為45-50頭/螨范圍內(nèi)，在為害時間為1-2 d時，C1115的JAR1表達(dá)量顯著高于面包（P＜0.05）。綜上所述，發(fā)現(xiàn)35-50頭螨/葉，為害2 d后，抗、感木薯品種的JAR1表達(dá)量均較為害前顯著提高，并且2個品種間的表達(dá)量差異最顯著，即抗螨品種中JAR1表達(dá)量顯著高于感螨品種（P＜0.05）。

圖4 不同密度二斑葉螨為害不同時間后JAR1的相對表 達(dá)量Fig. 4 Relative transcriptions of JAR1 gene in miteresistant and mite-susceptible cassava cultivars after infested by the mites of different densities at different time

3 討論

JA信號途徑在作物免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［32-34］，而該信號防御途徑由多基因控制［35-39］。DAD1編碼葉綠體磷脂酶AI，催化磷脂轉(zhuǎn)化成亞麻酸，是JA生物合成的第一步［40］。12-氧-植物二烯酸還原酶（12-oxo-phytodienoic acid reductase，OPR）和脂肪氧化酶（lipoxidase，LOX）是JA生物合成途徑中的2個關(guān)鍵酶。OPR控制JA合成的最后步驟，將OPDA還原生成JA的前體，而LOX控制JA合成的初始步驟，將不飽和脂肪酸氧化成氫過氧化物［41］。當(dāng)植物受到有害生物為害時，體內(nèi)激活脂氧合酶基因LOX，誘導(dǎo)JA及MeJA的合成和積累，而生成的JAs又可進一步激活LOX，促進JAs的積累［42］。在LOX表達(dá)受抑制后，JAs和防御相關(guān)物質(zhì)的合成受阻，植物易受害。在JA信號途徑中，JA可以在JAR1（jasmonate resistant 1）的催化下主要是與異亮氨酸（Ile）結(jié)合生成復(fù)合物JA-Ile，該復(fù)合物與茉莉酸受體COI1（COR-insensitive 1）特異性結(jié)合之后，在E3泛素連接酶SCFCOI1復(fù)合物的作用下促使JAZ（jasmonate-zimdomain protein 1）蛋白的泛素化并使之被26S蛋白酶體降解，釋放出MYC2（myelocytomatosis proteins 2），從而啟動JA早期應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄［43］。若JAR1基因發(fā)生突變可導(dǎo)致JA信號級聯(lián)傳遞受阻［43］。Guo等［44］在水稻抗蟲性研究中發(fā)現(xiàn)OPR3在中抗水稻品種中能夠過量表達(dá)，增強對二化螟的抗性，而AOC的過度表達(dá)，增加了水稻對褐飛虱的抗性。范東哲等［19］發(fā)現(xiàn)抗、感蚜辣椒品種被桃蚜為害后，JA信號途徑基因LOX2、AOC表達(dá)量在抗蚜辣椒品種中先顯著上升，隨后又逐漸降低至為害前水平，但在感蚜辣椒品種中這兩個基因被顯著抑制，其表達(dá)量顯著低于抗蚜辣椒中的水平。本研究發(fā)現(xiàn)受二斑葉螨為害后，上述基因在抗、感螨木薯品種中的表達(dá)量表現(xiàn)出顯著不同的變化趨勢，表明茉莉酸信號途徑介導(dǎo)的防御反應(yīng)可能因木薯品種的抗性差異而有所差別。

有害生物的蟲口密度和為害時間能顯著影響作物茉莉酸信號途徑基因的表達(dá)［45-47］。張海波［45］以感煙粉虱品種蘇椒15號和抗煙粉虱品種新蘇椒五號為材料，研究煙粉虱在不同蟲口密度（0、30、60、90和120頭/葉）下取食不同時間（0、2、12、24、48、72和96 h）對辣椒葉片JA信號途徑相關(guān)基因（LOX、AOC和OPR3）表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)煙粉虱蟲口密度以60頭/葉取食后對抗、感2個辣椒品種葉片中JA含量的影響顯著高于其余密度水平，并呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；在處理24-96 h內(nèi)可誘導(dǎo)抗蟲品種JA途徑基因LOX、AOC上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量均高于感蟲品種，OPR3呈下調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量低于感蟲品種。劉勇［47］分析了薊馬取食菜豆不同時間（0、1、6、12、24和48 h）對JA途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)在薊馬取食菜豆6 h時，LOX最先出現(xiàn)表達(dá)峰值，隨后AOS表達(dá)量在12 h出現(xiàn)第一個高峰期，這兩個防御基因的表達(dá)量在薊馬取食誘導(dǎo)后的48 h均達(dá)到第二個峰值。張鎮(zhèn)川等［36］通過檢測不同濃度（1、0.1、0.01和0.001 μmol/L）冠菌素注射番茄葉片之后防御基因表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)用1 μmol/L冠菌素處理番茄可誘導(dǎo)LOXD、MYC2、PAL5等基因的高表達(dá)；0.001和0.01 μmol/L的冠菌素處理會導(dǎo)致番茄葉片MYC2和LOXD的下調(diào)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在較高的害螨密度（45-50頭螨/葉）和較短的為害時間（螨害2 d）處理下，抗螨木薯品種茉莉酸信號途徑關(guān)鍵基因LOX2、OPR3和JAR1的表達(dá)量不僅顯著高于其螨害前的水平，而且也顯著高于感螨木薯品種在同個處理條件下的表達(dá)量，而在其他的害螨密度和為害時間處理時，上述基因在抗、感螨品種間的相對表達(dá)量并沒有統(tǒng)一的變化趨勢，推測二斑葉螨短時間為害時（例如螨害1 d），由于木薯植株受損程度較輕，能快速誘導(dǎo)茉莉酸信號途徑基因的表達(dá)，因此，上述基因在抗螨木薯品種中被誘導(dǎo)的程度并不一定高于感螨木薯品種，而隨著害螨密度的提高和螨害時間的延長，抗螨木薯C1115受螨害程度顯著低于感螨木薯面包，使得上述基因在C1115中的表達(dá)量也顯著高于面包，而較高的害螨密度和較長的螨害時間處理均超出了抗、感螨木薯的耐受螨害的閾值水平，因而在此密度下上述基因的相對表達(dá)量并無固定的變化規(guī)律。

本研究一方面初步闡明了基于茉莉酸信號途徑的木薯抗螨性分子機理，另一方面表明上述基因可能具有作為鑒定評價木薯抗螨性水平的分子指標(biāo)的潛力。但必須指出的是，本研究僅僅比較了單個抗螨和感螨木薯品種之間的基因表達(dá)差異，上述評價指標(biāo)在抗、感螨木薯品種群體中是否具有通用性和適用性仍需后續(xù)研究進一步證實。

4 結(jié)論

較高的害螨密度和較短的為害時間處理時，木薯茉莉酸信號途徑關(guān)鍵基因LOX2、OPR3和JAR1在抗螨木薯品種中的表達(dá)量顯著高于感螨木薯品種。