向日葵HaLACS1的克隆、表達(dá)及酵母功能互補(bǔ)鑒定

楊佳寶 周至銘 張展 馮麗 孫黎

（1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003；2. 兵團(tuán)興新職業(yè)技術(shù)學(xué)院，巴州 841007）

向日葵（Helianthus annuus L.）是我國(guó)四大油料作物之一，主要種植在內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等北方地區(qū)，種植面積約100萬(wàn)hm2，總產(chǎn)約200萬(wàn)t［1］。傳統(tǒng)葵花籽油中含有大量的不飽和脂肪酸，主要為油酸（14%-43%）和亞油酸（44%-75%），約占總脂肪酸含量的85%［2］，是最健康的食用植物油之一，而且向日葵耐鹽堿、抗旱、耐瘠薄，被譽(yù)為“鹽堿地的先鋒作物”［3］，在生態(tài)環(huán)境保護(hù)和地方經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展中具有不可替代的重要作用。

植物油主要以三酰甘油（triacylglycerol，TAG）形式儲(chǔ)存在成熟種子中，為種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)提供能量［4］。在TAG合成與分解代謝過(guò)程中，長(zhǎng)鏈脂酰CoA合成酶（long chain acyl-CoA synthetase，LACS）是極為重要的一類酶，它可催化游離脂肪酸生成脂酰CoA，這是其他脂代謝酶利用脂肪酸所必需的關(guān)鍵步驟［5-6］。LACS的催化作用主要分為兩步：首先游離脂肪酸和ATP反應(yīng)形成中間體，然后中間反應(yīng)產(chǎn)物與CoA的硫酯鍵反應(yīng)形成脂酰CoA［6-8］。形成的脂酰CoA可進(jìn)入β-氧化途徑，參與脂肪酸的降解過(guò)程［7］，也可作為TAG合成的前體物質(zhì)發(fā)揮 作用［5］。

LACS廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物、酵母以及大腸桿菌等生物體中，在生物油脂合成及分解代謝中發(fā)揮著重要作用。LACS屬于?；鵆oA合成酶（acyl-CoA synthetase，ACS）超家族，具有ACS家族的共同特征：其一是含有一個(gè)高度保守的AMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（AMP-binding domain，PROSITE PS00455）， 是ATP的結(jié)合位點(diǎn)［9］；其二是含有ACS信號(hào)序列，可能是ACS的激活位點(diǎn)和脂肪酸結(jié)合部位［10］。與其他ACS不同的是，LACS蛋白具有一個(gè)由大約45個(gè)氨基酸殘基組成的連接域（linker）［11］。

高等植物L(fēng)ACS基因家族包含多個(gè)成員，對(duì)擬南芥LACS各成員的功能研究工作開展得較為深入。擬南芥基因組中共有9個(gè)LACS基因（AtLACS1-AtLACS9），除了AtLACS6和AtLACS7以外，均能互補(bǔ)LACS缺陷型酵母的表型，使其恢復(fù)生長(zhǎng)［12］。其中AtLACS1編碼的蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在發(fā)育的種子中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，與AtLACS9存在部分功能冗余，在種子油脂合成中發(fā)揮重要作用［13］。此外，AtLACS1還與表皮蠟質(zhì)及花粉脂質(zhì)的形成有關(guān)［13-14］。由于角質(zhì)層是植物抵御生物和非生物脅迫的天然屏障，因此，LACS在植物抗逆響應(yīng)中也具有重要作用［15］，擬南芥單或雙突變體如atlacs2和atlacs1atlacs2提高了表皮的滲透性、水分散失率和對(duì)干旱的敏感 性［16-17］。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)LACS有4種形式，分別為Faa1p、Faa2p、Faa3p和Faa4p，其中Faa1p和Faa4p的催化活性較高，主要參與長(zhǎng)鏈脂肪酸的活化［18］。

雖然LACS基因在擬南芥中已經(jīng)有較為詳盡的研究，然而向日葵LACS基因在TAG合成和逆境脅迫中的作用至今仍不甚清楚。本研究通過(guò)分析向日葵基因組發(fā)現(xiàn)LACS為多基因家族，進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)室前期獲得的向日葵種子發(fā)育轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，LACS家族成員在種子發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)差異表達(dá)模式，篩選獲得一個(gè)包含完整編碼區(qū)的LACS基因序列，命名為HaLACS1，使用反轉(zhuǎn)錄PCR克隆獲得該基因并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，研究其亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)及在干旱、鹽和ABA處理下的表達(dá)模式，并通過(guò)酵母突變體功能互補(bǔ)試驗(yàn)進(jìn)一步明確HaLACS1編碼酶的活性和底物偏好性，以期為揭示該基因的功能及其在向日葵油脂合成和抗逆中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及處理 供試向日葵品種為油葵T303（含油量約49%），于2020年春季種植于石河子大學(xué)農(nóng)試場(chǎng)試驗(yàn)田。將開花后第0天的植株進(jìn)行人工自花授粉，并做標(biāo)記，取開花當(dāng)天及油脂積累3個(gè)不同時(shí)期（初期、中期和后期，即開花后10、24和31 DAF（day after flowering））的種子，液氮速凍后于-80℃保存。

將向日葵種子播種于花盆中，置于溫室中培養(yǎng)［（25±2）℃，16 h光照/8 h黑暗］，當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，分別取根、莖、葉和子葉，液氮速凍后-80℃保存，同時(shí)以盆栽幼苗為材料，以無(wú)菌水處理為對(duì)照，進(jìn)行不同濃度的鹽脅迫（0、150、200和300 mmol/L NaCl）處理24 h；干旱脅迫（15% PEG 6000）和外源ABA（100 μmol/L）處理0、1、3、6、12和24 h。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 菌株與主要試劑 pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。大腸桿菌（E. coli）DH5α、亞細(xì)胞定位載體pAN580-eGFP和酵母穿梭表達(dá)載體pYES2由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物功能基因?qū)嶒?yàn)室保存。pAN580帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）報(bào) 告 基 因。LACS缺陷型酵母（Saccharomyces cerevisiae）YB525菌株（faa1△faa4△）由朱駿教授（上海師范大學(xué)）惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 HaLACS1的克隆及序列分析 使用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme，南京，中國(guó)） 提取向日葵總RNA，使用PrimeScriptTMReverse Transcriptase（TaKaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)向日葵基因組，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)HaLACS1編碼區(qū)引物（L1F/L1R），并添加Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，用于構(gòu)建PYES2-HaLACS1載體（表1）。使用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)HaLACS1蛋白分子量和等電點(diǎn)。使用MEGA 7.0軟件的鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Clustal W結(jié)合GeneDoc軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行比較和可視化分析。利用在線軟件PlantCARE與TBtools分析HaLACS1啟動(dòng)子順式作用元件。

表1 引物信息Table 1 Information of primers used in this study

1.2.2 亞細(xì)胞定位分析 使用引物PF和PR擴(kuò)增HaLACS1，經(jīng)瓊脂糖凝聚檢測(cè)、純化后，與亞細(xì)胞定位載體pAN580-eGFP連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體pAN580-HaLACS1-eGFP。將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體、pAN580-eGFP空載體及mCherry-HDEL-eRFP（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位marker）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，弱光下培養(yǎng)8-10 h，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP在細(xì)胞內(nèi)的分布，判斷HaLACS1的亞細(xì)胞定位。

1.2.3 HaLACS1的表達(dá)分析 以向日葵18S rRNA（AF107577）基因?yàn)閮?nèi)參，使用ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)，分析HaLACS1的表達(dá)水平。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［19］。

1.2.4 HaLACS1 在酵母中的功能驗(yàn)證 使用引物L(fēng)1F和L1R（表1）擴(kuò)增HaLACS1的編碼區(qū)序列，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-HaLACS1。采用LiAc轉(zhuǎn)化法［20］，分別將重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pYES2轉(zhuǎn)化至LACS缺陷型酵母YB525中。轉(zhuǎn)基因酵母在含2%（W/V）半乳糖的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基（yeast synthetic drop-out agar medium without uracil，SCU）上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)［21-22］。

1.2.5 底物偏好性分析 將轉(zhuǎn)基因酵母接種于SCU培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期中后期，收集酵母細(xì)胞。加入2 mol/L山梨醇清洗2次。將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入3-5 mL SCU液體培養(yǎng)基（含2%半乳糖），30℃培養(yǎng)4 h，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。測(cè)OD600，然后吸取30 μL菌液加入到3 mL含2%半乳糖、98 μmol/L脂肪酸（C12： 0、C14：0、C16：0、C18：0、C18：1）的SCU液體培養(yǎng)基中，并添加0.1% Triton X-100溶解脂肪酸。30℃震蕩培養(yǎng)48 h，使用分光光度計(jì)測(cè)量菌體密度，推測(cè)HaLACS1催化反應(yīng)的底物偏好性［23］。

1.2.6 酵母細(xì)胞油脂的檢測(cè) 利用蘇丹黑B染色法［24］分析轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞中的油脂含量（脂肪粒散布在細(xì)胞質(zhì)中，可被蘇丹黑B氧化成黑藍(lán)色，在580 nm波長(zhǎng)下酵母細(xì)胞油脂含量與吸光值呈線性關(guān)系）。首先用無(wú)菌水懸浮收集半乳糖誘導(dǎo)后的酵母菌體，將OD600處菌液濃度調(diào)為0.5，5 000 r/min離心10 min收集菌體。用0.3%的蘇丹黑（蘇丹黑0.3 g，70%乙醇100 mL）染色15 min后，棄去染料，用70%酒精懸浮菌體漂洗3次后懸浮于無(wú)菌水， 測(cè)OD580。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)和分析 采用SPSS 26.0（one-way ANOVA）和Duncan法對(duì)qRT-PCR和底物偏好性進(jìn)行單因素方差和多重比較分析（P＜0.05）。使用SPSS 26.0和Turkey’s法對(duì)中性油脂含量進(jìn)行單因素方差和多重比較分析。所有數(shù)據(jù)均用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并使用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 HaLACS1的克隆及序列分析

以向日葵cDNA為模板，擴(kuò)增得到了1 980 bp的HaLACS1完整開放閱讀框（圖1-A）。該基因編碼659個(gè)氨基酸，分子量為74.672 kD，等電點(diǎn)為5.82，與擬南芥AtLACS1蛋白的同源性為64%，與萵苣（Lactuca sativa）LsLACS1的同源性為79%。通過(guò)染色體定位發(fā)現(xiàn)其位于第4染色體63 100 598-63 107 432基因座，具有19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子（圖1-B）。將HaLACS1編碼的氨基酸序列與其他5個(gè)植物L(fēng)ACS氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果（圖2）顯示，向日葵HaLACS1蛋白序列中含有高度保守的AMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（AMP-binding domain）和ACS信號(hào)結(jié)構(gòu)域（ACS signature domain），同時(shí)HaLACS1還含有LACS酶特異的LACS特異的連接域（LACS-specific linker domain）。不同植物中LACS連接域的氨基酸序列相似性差異較大。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，HaLACS1具備LACS家族蛋白的共同特征，可以確定所克隆的基因?yàn)橄蛉湛鸏ACS基因。

圖1 向日葵HaLACS1的克隆（A）及染色體定位分析（B）Fig. 1 Cloning（A）and chromosome location（B）of the HaLACS1 gene in H. annuus

圖2 不同植物L(fēng)ACS1蛋白序列多重比對(duì)結(jié)果Fig. 2 Multiple alignment results of LACS1 proteins from different plants

2.2 HaLACS1啟動(dòng)子序列分析

從向日葵基因組數(shù)據(jù)中獲得了HaLACS1開放閱讀框（ORF）上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列，利用在線軟件PlantCARE與TBtools對(duì)HaLACS1啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析（圖3）。發(fā)現(xiàn)含有TATAbox（RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合位點(diǎn)，可以保證轉(zhuǎn)錄精確起始）、參與厭氧誘導(dǎo)的ARE元件（AAACCA）、參與水楊酸反應(yīng)的TCA元件（CCATCTTTTT）；另外還發(fā)現(xiàn)了GARE-motif（TCTGTTG）赤霉素、TGAelement（AACGAC）生長(zhǎng)素及CGTCA-motif茉莉酸甲酯響應(yīng)元件；除此之外，還發(fā)現(xiàn)低溫響應(yīng)元件LTR（CCGAAA）和一個(gè)參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)元件MBS（CAACTG）。結(jié)果表明，HaLACS1可能通過(guò)激素調(diào)控來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的作用。

圖3 向日葵HaLACS1啟動(dòng)子的順式作用元件Fig. 3 Cis-acting elements of the H. annuus HaLACS1 gene promoter

2.3 HaLACS1蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖4）表明，向日葵HaLACS1與擬南芥AtLACS1的同源性為64%，與萵苣LsLACS1同源性最高（79%）。HaLACS1與芝麻SiLACS1、蓖麻RcLACS1、花生AhLACS1、大豆GmLACS1等雙子葉植物L(fēng)ACS1在同一進(jìn)化支上，與單子葉植物水稻、玉米、小麥的LACS蛋白同源關(guān)系較遠(yuǎn)。而釀酒酵母與三角褐指藻的LACS蛋白序列聚為另一分支上，親緣關(guān)系較近。

圖4 向日葵HaLACS1蛋白與其他植物L(fēng)ACS1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 4 Phylogenetic relationships of the HaLACS1 protein in H. annuus with other plant LACS1

2.4 HaLACS1的亞細(xì)胞定位分析

PCR擴(kuò)增HaLACS1的編碼區(qū)，經(jīng)SpeⅠ和NcoⅠ 雙酶切、測(cè)序、連接、轉(zhuǎn)化，獲得HaLACS1與綠色熒光蛋白（GFP）融合的表達(dá)載體pAN580-HaLACS1-eGFP。通過(guò)與攜帶紅色熒光蛋白（RFP）的mCherry-HDEL-RFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察定位情況。結(jié)果（圖5）表明，攜帶有GFP的HaLACS1與攜帶RFP的mCherry-HDEL-eRFP在共聚焦顯微鏡下可以共定位，表明HaLACS1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

圖5 HaLACS1在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of the HaLACS1 protein in the protoplasts of Arabidopsis

2.5 HaLACS1組織特異性表達(dá)分析

使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)HaLACS1在向日葵各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖6）表明，HaLACS1在向日葵根、莖、葉、子葉、花和種子中均有表達(dá)，在花和種子發(fā)育初期（10 DAF）表達(dá)量較高，其中，在種子發(fā)育早期表達(dá)量最高，是根中表達(dá)量的17倍，隨后表達(dá)量下降，推測(cè)HaLACS1參與向日葵種子的油脂積累，且發(fā)揮作用的時(shí)段主要為早期，同時(shí)該基因可能還與向日葵花器官中的油脂積累有關(guān)。

圖6 HaLACS1在不同組織中的表達(dá)Fig. 6 Tissue expression analysis of the HaLACS1 gene

2.6 HaLACS1對(duì)非生物脅迫和外源ABA的響應(yīng)

向日葵是一種抗旱、耐鹽堿的作物，為了明確向日葵HaLACS1對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)，采用qRTPCR方法分析HaLACS1在2種脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果（圖7）表明，HaLACS1響應(yīng)干旱和鹽脅迫，且不同組織（根、莖、葉）具有不同的響應(yīng)模式。在干旱脅迫下（圖7-A），HaLACS1在莖和葉中的表達(dá)量呈“升-降-升”的趨勢(shì)，莖中的表達(dá)量在干旱處理1 h時(shí)達(dá)到最高，為對(duì)照的2倍左右，葉中表達(dá)量在處理12 h時(shí)達(dá)到最高，為對(duì)照的3倍左右。根中的表達(dá)量在處理后先降低，在3 h處其表達(dá)量開始升高，于12 h處達(dá)到最高，為對(duì)照的3倍左右。

用不同濃度NaCl（0、150、200和300 mmol/L）處理向日葵幼苗，處理24 h后檢測(cè)HaLACS1的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖7-B）表明，供試組織（根、莖、葉）在150 mmol/L NaCl處理下，HaLACS1的表達(dá)較對(duì)照顯著上調(diào)，在根、莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照的8-10倍。隨著NaCl濃度的升高，HaLACS1在莖、葉中的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，而在200 mmol/L NaCl脅迫后，在根中的表達(dá)下調(diào)，300 mmol/L NaCl脅迫后又顯著升高，表明HaLACS1受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)。

圖7 向日葵在干旱（A）和鹽（B）脅迫下不同組織中HaLACS1的表達(dá)分析Fig. 7 Relative expressions of the HaLACS1 gene in H. annuus tissues under drought（A）and salt stresses（B）

ABA處理后（圖8），HaLACS1在根中的表達(dá)在處理1 h時(shí)下調(diào)，然后持續(xù)上調(diào)，在12 h表達(dá)量最高，約為對(duì)照的2倍；HaLACS1在莖中的表達(dá)較對(duì)照顯著上調(diào)，在莖中12 h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的5倍左右，在24 h時(shí)略有下調(diào)。在葉的表達(dá)量在ABA處理后出現(xiàn)“升-降-升”趨勢(shì)，在12 h時(shí)表達(dá)量最高，約為對(duì)照的3倍，表明HaLACS1受ABA 誘導(dǎo)。

圖8 向日葵在ABA處理下不同組織中HaLACS1的表達(dá)分析Fig. 8 Expression pattern of HaLACS1 in H. annuus tissues under ABA treatment

2.7 酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)及底物偏好性分析

為明確HaLACS1是否具有LACS酶活性，構(gòu)建pYES2-HaLACS1酵母表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至LACS缺陷型釀酒酵母菌株YB525中，置于以脂肪酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。YB525為酵母LACS缺陷型菌株，不能在含有脂肪酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)［25］。在培養(yǎng)基里添加不同鏈長(zhǎng)的外源脂肪酸作為底物，根據(jù)酵母生長(zhǎng)情況確定HaLACS1是否具有LACS酶活性，并探究HaLACS1的底物偏好性，以轉(zhuǎn)pYES2空載體的菌株為對(duì)照。結(jié)果（圖9）表 明，30℃震蕩培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)化pYES2-HaLACS1的酵母彌補(bǔ)了該突變菌株不能在以脂肪酸為唯一碳源的SCU培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)的缺陷，恢復(fù)了其正常生長(zhǎng)速率，說(shuō)明HaLACS1具有LACS酶活性。并且轉(zhuǎn)基因酵母在棕櫚酸（C16：0）和油酸（C18：1）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率更快，說(shuō)明HaLACS1對(duì)底物 C16：0和C18：1脂肪酸具有偏好性。

圖9 重組酵母的生長(zhǎng)狀況Fig. 9 Growth status of recombinant yeast cells

2.8 轉(zhuǎn)基因酵母油脂含量分析

半乳糖誘導(dǎo)48 h后的陽(yáng)性酵母菌用于轉(zhuǎn)基因酵母的油脂檢測(cè)，通過(guò)蘇丹黑B染色法檢測(cè)酵母細(xì)胞油脂含量，結(jié)果（圖10）顯示，pYES2-HaLACS1的酵母轉(zhuǎn)化子中蘇丹黑B染色程度較對(duì)照顯著升高（P＜0.01），表明pYES2-HaLACS1的酵母轉(zhuǎn)化子相較于對(duì)照含有更高的油脂，說(shuō)明HaLACS1可以提高酵母油脂含量。

圖10 重組酵母細(xì)胞的蘇丹黑B染色Fig. 10 Sudan black B staining of recombinant yeast cells

3 討論

LACS基因家族在高等植物中廣泛分布，在植物甘油酯的合成與分解、角質(zhì)和蠟質(zhì)合成、逆境響應(yīng)等多個(gè)過(guò)程中具有重要作用。已有研究表明，高等植物L(fēng)ACS家族蛋白定位于不同的細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［26］、葉綠體［27］、過(guò)氧化物酶體［26-28］和質(zhì)膜［15，25］。前期研究發(fā)現(xiàn)，向日葵基因組中具有13個(gè)LACS基因家族成員，本研究從向日葵基因組中克隆了一個(gè)HaLACS1基因，與擬南芥AtLACS1具有較高的相似性。構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體在擬南芥原生質(zhì)體中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HaLACS1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這與擬南芥同源蛋白AtLACS1的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致［11］。前人也報(bào)道了向日葵中的2個(gè)LACS基 因［29］，本研究對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的這兩個(gè)向日葵LACS基因與擬南芥AtLACS8和AtLACS9的相似性較高，其中向日葵HaLACS8蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，HaLACS9蛋白定位于葉綠體。并且研究表明，位于不同細(xì)胞器中的LACS蛋白具有不同的生物學(xué)功能。位于質(zhì)體中的LACS蛋白與質(zhì)體中從頭合成的長(zhǎng)鏈脂肪酸的激活有關(guān)，并參與質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的脂質(zhì)運(yùn)輸［26］。定位于過(guò)氧化物酶體的AtLACS6、AtLACS7和一種大豆蛋白GmLACS2參與脂肪酸的降解［26-27］。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4和AtLACS8參與脂質(zhì)的合成［12］。本研究發(fā)現(xiàn)HaLACS1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，推測(cè)該蛋白可能與擬南芥中定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的LACS蛋白具有相似的脂質(zhì)合成功能。

研究表明，擬南芥AtLACS基因家族成員可在根、莖、葉、花和種子等多個(gè)器官中高表達(dá)［12-13］，其表達(dá)模式上的多樣化也印證了AtLACS基因功能的多樣化。其中，AtLACS1在擬南芥莖、葉表皮細(xì)胞、花和發(fā)育的種子中高表達(dá)，參與擬南芥表皮蠟和角質(zhì)、花粉外壁脂質(zhì)和種子TAG的合成等多個(gè)生物過(guò)程［12］。AtLACS1突變體導(dǎo)致莖和葉的C16角質(zhì)單體分別減少了37%和22%，同時(shí)，AtLACS1具有超長(zhǎng)鏈脂肪酸（C20-C30）合成酶活性，尤其對(duì)C30脂肪酸具有高活性，在擬南芥表皮蠟質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用［14］。AtLACS1和AtLACS4雙突變體導(dǎo)致花粉敗育，花粉外壁脂質(zhì)顯著降低［30］。AtLACS1和AtLACS9雙突變體的研究表明，二者在籽粒TAG的合成功能上存在部分冗余［13］，此外，AtLACS2、AtLACS4和AtLACS8也在擬南芥種子中高表達(dá)，在TAG的合成中發(fā)揮重要作用［15］。研究表明，HaLACS9在向日葵種子發(fā)育前期有較高的表達(dá)，HaLACS8主要在種子發(fā)育后期表達(dá)［29］。本研究克隆的HaLACS1在向日葵花和種子發(fā)育的前期（花后10 d）表達(dá)量較高。HaLACS1和HaLACS9雖然定位于不同的細(xì)胞器，但都在種子發(fā)育前期表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性，說(shuō)明其在向日葵種子TAG的合成功能上存在部分冗余，這與報(bào)道的擬南芥AtLACS1和AtLACS9相似［13］。而HaLACS8雖然定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但在向日葵種子發(fā)育后期表現(xiàn)出高活性，推測(cè)這些基因的表達(dá)在種子發(fā)育過(guò)程中受到不同機(jī)制的調(diào)控。本研究結(jié)果推測(cè)HaLACS1參與向日葵花和種子中脂質(zhì)的積累過(guò)程，尤其參與向日葵種子TAG合成早期的調(diào)控。

植物角質(zhì)層的主要成分是超長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物［31］，是隔離外界的天然屏障，具有防止植物非氣孔性失水、抵御病蟲害和非生物逆境等多種功能［32］。從蘋果中鑒定了11個(gè)MdLACS，其中多個(gè)MdLACS在ABA處理后表達(dá)上調(diào)，并且MdLACS1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了蘋果愈傷組織對(duì)PEG、ABA和NaCl的耐受性，表明MdLACS1是響應(yīng)非生物脅迫的重要調(diào)節(jié)因子［33］。異源表達(dá)2個(gè)蘋果LACS基因（MdLACS2和MdLACS4）導(dǎo)致擬南芥表皮細(xì)胞的滲透性降低，減少了水分散失，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性［34］。這些結(jié)果表明LACS在植物角質(zhì)合成中的作用增強(qiáng)了植物的抗旱性。向日葵作為一種耐鹽堿、抗旱性較強(qiáng)的油料作物，在我國(guó)西北地區(qū)廣泛種植，探究向日葵的抗逆機(jī)制具有重要意義。在擬南芥中的研究表明，干旱、鹽和ABA均可誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的MYB41高表達(dá)，而且可通過(guò)MYB41的下游調(diào)控基因AtLACS2來(lái)調(diào)控角質(zhì)的合成，從而提高擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性［35］。本研究證實(shí)，ABA、PEG和NaCl脅迫均能誘導(dǎo)HaLACS1在向日葵莖、葉中的表達(dá)上調(diào)，并且該基因上游啟動(dòng)子序列中包含MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，因此，猜測(cè)HaLACS1受MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控參與向日葵角質(zhì)的合成，與向日葵的耐逆代謝有關(guān)，具體功能有待進(jìn)一步深入研究。

盡管擬南芥LACS酶是個(gè)小的多基因家族，但對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸具有明顯的底物偏好性差異，這與其功能差異和亞細(xì)胞定位是相一致 的［12，15］。棉花（Gossypium hirsutum）GhACS1偏好長(zhǎng)鏈脂肪酸作為底物，尤其是油酸（C18：1）［28］。油菜（Brassica napus）BnLACS2參與種子油脂的合成，偏好肉蔻酸（C14：0）、軟脂酸（C16：0）、硬脂酸 （C18：0）、油酸（C18：1）和芥酸（C22：1）為底 物［5］。這些研究表明，LACS酶在高等植物中的功能較為保守。但由于種子油脂組分和脂質(zhì)代謝過(guò)程在不同植物中具有多樣性的特點(diǎn)，LACS酶的底物偏好性在不同的植物中是不同的。為了明確向日葵HaLACS1的活性和底物偏好性，將HaLACS1轉(zhuǎn)入LACS缺陷型酵母細(xì)胞YB525中進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)，結(jié)果證明HaLACS1能夠補(bǔ)償酵母突變體YB525的生長(zhǎng)缺陷，證實(shí)了HaLACS1具有長(zhǎng)?；o酶A合成酶活性。通過(guò)在不同脂肪酸培養(yǎng)基中測(cè)定酵母的生長(zhǎng)速率來(lái)間接分析其底物偏好性，結(jié)果表明，HaLACS1偏好軟脂酸和油酸等長(zhǎng)鏈脂肪酸作為底物。在對(duì)酵母油脂含量的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母的油脂含量顯著升高，結(jié)合HaLACS1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分析結(jié)果，說(shuō)明HaLACS1參與了向日葵的油脂合成過(guò)程中軟脂酸和油酸的活化。

4 結(jié)論

成功克隆了一個(gè)向日葵長(zhǎng)鏈?；o酶A合成酶基因HaLACS1，該基因全長(zhǎng)1 980 bp，編碼659個(gè)氨基酸，分子量為74.672 kD，等電點(diǎn)為5.82。HaLACS1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。該蛋白序列具有典型的酰基輔酶A合成酶特征。HaLACS1主要在向日葵種子發(fā)育早期高表達(dá)，可能參與向日葵種子油脂積累，并響應(yīng)干旱、高鹽和ABA的調(diào)控。HaLACS1可能參與了向日葵油脂的合成代謝，并對(duì)軟脂酸和油酸具有偏好性。