聯(lián)合用藥對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥性影響研究進(jìn)展

趙海晴 李耘 梁嚴(yán)內(nèi) 劉哲 任亞林 李金娟

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，為嗜溫且可運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性菌，其不僅廣泛存在于水產(chǎn)品及水體養(yǎng)殖環(huán)境中，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成威脅，同時(shí)還是人畜共患的病原菌，可寄生于人類(lèi)腸道，嚴(yán)重時(shí)可引起人類(lèi)及動(dòng)物的敗血癥、腹瀉以及腸炎等疾?。?-2］。隨著抗生素、抗菌藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中普遍使用，不同來(lái)源的嗜水氣單胞菌對(duì)內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性（drug resistance，DR），并呈現(xiàn)多重耐藥且耐藥譜廣的特點(diǎn)［3-8］（表1）。

表1 不同地區(qū)嗜水氣單胞菌的耐藥流行性情況Table 1 Drug resistance profile of Aeromonas hydrophila in different areas

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，除通過(guò)加強(qiáng)健康養(yǎng)殖管理、提高技術(shù)人員診斷和治療水平、規(guī)范藥物使用和投喂劑量以及加強(qiáng)污水處理等措施延緩耐藥性外［23-24］，還可將抗生素、抗菌藥物、噬菌體以及抗菌肽等進(jìn)行聯(lián)用［25-30］。但相對(duì)其他領(lǐng)域（人類(lèi)臨床診斷、畜牧養(yǎng)殖等），由于開(kāi)放式的養(yǎng)殖環(huán)境，藥物直接作用于宿主靶點(diǎn)難以實(shí)現(xiàn)，以及藥物使用成本相對(duì)高昂等，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大范圍推廣聯(lián)合用藥（combination therapy，CT）至今仍相對(duì)困難，研究進(jìn)展和應(yīng)用實(shí)踐也相對(duì)滯后。但合理的CT仍具有潛在的優(yōu)越性，同時(shí)會(huì)隨著不同水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的推廣和研發(fā)呈現(xiàn)巨大的潛在價(jià)值和發(fā)展前景。

1 聯(lián)合用藥應(yīng)用原則及關(guān)注方向

耐藥性可分為天然耐藥和獲得性耐藥，其中獲得性耐藥是耐藥產(chǎn)生的主要原因，盡管其突變概率很低（菌群濃度達(dá)到1×1010CFU/mL左右），但耐藥風(fēng)險(xiǎn)依然不容忽視。長(zhǎng)期且不當(dāng)?shù)厥褂每股鼗蚩咕幬锏?，?dāng)其達(dá)到最小抑菌濃度（the minimum inhibitory concentration，MIC）時(shí)，絕大多數(shù)菌株被殺滅或抑制，少部分菌株會(huì)突變并獲得選擇性富集擴(kuò)增，而只有高于突變預(yù)防濃度（the mutant prevention concentration，MPC）才可以防止第一步耐藥突變菌株選擇性增殖［31］，但是抗生素的使用濃度超過(guò)MPC則會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生毒性效應(yīng)。在MIC與MPC之間的濃度范圍叫突變選擇窗口期（the mutant selection window，MSW），在該范圍內(nèi)耐藥菌株呈現(xiàn)高度選擇性富集風(fēng)險(xiǎn)，且MSW越寬，越容易出現(xiàn)耐藥菌株［32］。所以針對(duì)人體、畜禽、水產(chǎn)等疾病防治，臨床用藥原則上盡量選用MSW窄的抗菌藥。

藥物-藥物相互效應(yīng)（drug-drug interactions，DDIs）是指一種藥物對(duì)另一種藥物產(chǎn)生藥動(dòng)學(xué)或藥效學(xué)影響，進(jìn)而改變單一藥物對(duì)宿主（活體、細(xì)胞或細(xì)菌層面）的影響［33］，如細(xì)菌對(duì)一種藥物產(chǎn)生的耐藥性會(huì)增加或降低其對(duì)另一種藥物的敏感性［34］。DDIs主要包括了協(xié)同效應(yīng)、相加效應(yīng)以及拮抗效應(yīng)等［30，35］（圖1-a），上述效應(yīng)可通過(guò)最經(jīng)典的濃度加和模型（concentration addition，CA）和獨(dú)立作用模型（independent addition，IA）進(jìn)行預(yù)測(cè)和估計(jì)［36］，在混合物聯(lián)合毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)中，CA模型適用于作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)相同的混合物體系，而IA模型則適用于作用模式及機(jī)制不同的混合物體系［37］。盡管CA模型及IA模型的應(yīng)用在國(guó)際上較為常見(jiàn)，但在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)發(fā)現(xiàn)，在某些情況下CA模型及IA模型的預(yù)測(cè)值可能會(huì)高于或低于實(shí)際值，因此人們?cè)诖嘶A(chǔ)上優(yōu)化并發(fā)展起來(lái)綜合疊加模型（integrated addition model，IAM）、綜合疊加聯(lián)合建模（integrated addition and interaction model，IAI）［38］和 高 階 總風(fēng)險(xiǎn)概率模型（improved overall risk probability，IORP）［39］等模型來(lái)進(jìn)行混合物聯(lián)合毒性效應(yīng)的合理預(yù)測(cè)和估計(jì)，為聯(lián)合用藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要參考。

圖1 藥物相互作用在濃度空間中模式及聯(lián)合用藥應(yīng)用場(chǎng)景Fig.1 Mode of drug interaction in concentration space and application scenarios of combination therapy

最初聯(lián)合用藥（CT）主要利用細(xì)菌上位性所呈現(xiàn)的協(xié)同效應(yīng)促使藥物在低劑量水平下實(shí)現(xiàn)菌群抑制的同時(shí)還能盡可能減小MSW，并阻控細(xì)菌耐藥性尤其多重耐藥性的產(chǎn)生［32，40］，如圖1-b，協(xié)同作用的MIC及MPC線呈現(xiàn)凹形，即意味著相較于圖1-c中拮抗作用所呈現(xiàn)的凸形線，要達(dá)到等同抑菌水平，協(xié)同效應(yīng)CT組合所需的藥物濃度更小，因此在以往研究中，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)的CT組合及其機(jī)制備受關(guān)注。2018年Nature發(fā)表了一項(xiàng)史上最復(fù)雜的CT研究（3 000余項(xiàng)二元CT組合），該研究從抗生素、人類(lèi)靶向藥物及食品添加劑中篩選藥物并進(jìn)行二元CT組合，作用于革蘭氏陰性病原體、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌等6類(lèi)菌株，數(shù)據(jù)利用Bliss模型模擬窄譜（減小MSW）治療的潛能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)75%的二元CT組合表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)，且三元CT組合表現(xiàn)拮抗效應(yīng)的概率顯著大于二元組合［41-42］。然而近年報(bào)道表明，CT表現(xiàn)的協(xié)同效應(yīng)會(huì)加快細(xì)菌對(duì)藥物的適應(yīng)速度，盲目使用反而會(huì)使細(xì)菌抗性譜系的擴(kuò)大并增大突變選擇性?xún)?yōu)勢(shì)的可能，最終藥物失效［35，43-44］。正因?yàn)槿绱撕芏辔墨I(xiàn)將“細(xì)菌-藥物”之間的競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)為與人類(lèi)生存緊密相關(guān)的“軍備競(jìng)賽”［32，45］。另外，由圖1-b以及圖1-c可見(jiàn)，固定某類(lèi)藥物（藥物A或B）濃度為MIC時(shí)，可得出2條MPC線交匯于最小MSW區(qū)域，而MSW被廣泛認(rèn)為是誘發(fā)細(xì)菌耐藥突變的區(qū)域，其值的大小與耐藥菌進(jìn)化程度相關(guān)，在協(xié)同效應(yīng)CT組合中，MSW幾何面積較拮抗效應(yīng)CT組合的面積更大，即協(xié)同效應(yīng)CT組合更易產(chǎn)生耐藥突變，但很大程度與上位基因突變或耐藥機(jī)制無(wú)關(guān)［32］，而極可能主要由于拮抗效應(yīng)參與并發(fā)揮作用，同時(shí)CT組合的配比剛好作用于野生菌株與耐藥菌株（或該野生菌株突變菌株）的共生群落，該CT組合通過(guò)阻控耐藥菌株生長(zhǎng)而使敏感野生菌株群勢(shì)得以逆轉(zhuǎn)。該結(jié)論在一項(xiàng)針對(duì)CT阻控細(xì)菌耐藥性的Meta分析中得到證實(shí)［46］。2008年，PNAS等期刊相繼有報(bào)道認(rèn)為具有拮抗效應(yīng)的CT組合可減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生速率，且該組合對(duì)耐藥菌的阻控效果優(yōu)于敏感菌 株［32，35］。即如果CT組合呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)時(shí)，如細(xì)菌對(duì)一種藥物耐藥，則會(huì)促使一種藥物對(duì)另一種藥物的抑制作用降低，從而降低耐藥性突變速率，甚至促使菌群重新對(duì)藥物敏感［47］。由于以往研究更多關(guān)注協(xié)同效應(yīng)，因此現(xiàn)有可獲得的數(shù)據(jù)及研究結(jié)果納入?yún)f(xié)同效應(yīng)組合也就更多，在評(píng)價(jià)過(guò)程中，人為篩選過(guò)濾并主動(dòng)選擇協(xié)同效應(yīng)而規(guī)避拮抗效應(yīng)則帶來(lái)Meta分析結(jié)論存在顯著的偏倚性。但拮抗效應(yīng)也存在風(fēng)險(xiǎn)，最突出的問(wèn)題是提高環(huán)境中藥物殘留水平，藥物濃度過(guò)高短期抑制細(xì)菌耐藥性發(fā)生，但同時(shí)極大增加對(duì)宿主（人體或環(huán)境靶標(biāo)）產(chǎn)生聯(lián)合毒性效應(yīng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，這在聯(lián)合毒性效應(yīng)研究領(lǐng)域可見(jiàn)諸多報(bào)道［48］。因此從某種觀點(diǎn)來(lái)看，聯(lián)合效應(yīng)是聯(lián)合用藥的被動(dòng)結(jié)果，而聯(lián)合用藥是誘導(dǎo)聯(lián)合毒性的主動(dòng)誘因。

因此，探究藥物協(xié)同、相加或拮抗效應(yīng)需整體考察其表象及其背后的機(jī)制，尤其針對(duì)如此復(fù)雜的微生物群落，可能更需要在“和諧共生”科學(xué)指導(dǎo)下才能更好基于聯(lián)合用藥的手段來(lái)延緩耐藥性，而不是也不能完全阻止耐藥性的發(fā)生［49-50］?！拔⑸?人類(lèi)”同為生態(tài)系統(tǒng)中共生群體，人類(lèi)的可持續(xù)發(fā)展應(yīng)當(dāng)建立在生態(tài)系統(tǒng)總體平衡和可持續(xù)發(fā)展基礎(chǔ)上，這也是聯(lián)合用藥應(yīng)用于耐藥性緩解和阻控的根本原則。

2 聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)菌耐藥影響機(jī)制的研究現(xiàn)狀

耐藥性是微生物受不同因素（如抗生素等）影響下產(chǎn)生的一種防御機(jī)制，當(dāng)其基因發(fā)生耐藥突變或從外界獲得耐藥基因時(shí)，耐藥性產(chǎn)生［51］。細(xì)菌耐藥機(jī)制包括固有耐藥性和獲得耐藥性。固有耐藥性由細(xì)菌染色體上固有的耐藥基因引起，與抗菌藥物的使用無(wú)關(guān)，如嗜水氣單胞菌的細(xì)胞壁最外層由疏水性脂多糖形成，可阻止未被修飾的青霉素?cái)U(kuò)散，因而對(duì)青霉素具有固有抗性［1］。獲得耐藥性可通過(guò)基因的自發(fā)突變和水平基因轉(zhuǎn)移兩種方式形成，自發(fā)突變通過(guò)上調(diào)抗性基因或改變抗生素表達(dá)水平賦予細(xì)菌耐藥性［47］；細(xì)菌也可通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移獲得抗性基因，該轉(zhuǎn)移包括3種機(jī)制：轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化以及接合。一般通過(guò)獲得可轉(zhuǎn)移抗性質(zhì)?；蛲ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)座子、整合子等來(lái)捕獲抗性基因以獲得耐藥性［52］，如Hossain等［15］通過(guò)PCR 檢測(cè)出耐喹諾酮類(lèi)抗生素的基因qnrS即由質(zhì)粒介導(dǎo)?？剐曰蛲ㄟ^(guò)編碼相應(yīng)的抗生素降解酶、藥物外排泵，對(duì)藥物靶標(biāo)進(jìn)行修飾以及影響細(xì)胞膜形成及其通透性等而產(chǎn)生［53］。由于具有抗菌作用的藥物組合不計(jì)其數(shù)，大規(guī)模篩選強(qiáng)效的藥物組合耗時(shí)耗力，因此，了解藥物相互作用的潛在機(jī)制，探究協(xié)同作用的機(jī)理，在解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題上具有重大意義［30，54］。

2.1 抑制藥物外排泵的活性

藥物外排泵是存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上的一類(lèi)蛋白質(zhì)，可特異性識(shí)別抗生素等抗菌藥物并將其從胞內(nèi)排出，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［55-56］。一般認(rèn)為，與細(xì)菌外排系統(tǒng)相關(guān)的超家族有5個(gè)，分別為主要易化子超家族（major facilitator superfamily，MFS）、ATP結(jié)合盒超家族（ATP binding cassette，ABC）、耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化超家族（resistance nodulation cell division，RND）、小多重耐藥家族類(lèi)（small multi-drug resistance，SMR）和多種抗菌藥物排出轉(zhuǎn)運(yùn)分子家族（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）［57］。多重藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的晶體結(jié)構(gòu)為大腸桿菌AcrB RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在大腸桿菌中，膜融合蛋白AcrA在外膜通道蛋白TolC幫助下，通過(guò)相互作用形成AcrAB-TolC的外排泵系統(tǒng)，將抗菌藥物排至菌體外（作用機(jī)制如圖2所示）［58］。2008年已有研究指出RND家族的多藥外排系統(tǒng)AheABC參與了嗜水氣單胞菌耐藥性形成，且發(fā)現(xiàn)AheABC比AcrAB-TolC窄譜性范圍更?。?9］。在嗜水氣單胞菌耐藥性的防控上，CT作用其外排系統(tǒng)，可有效提升嗜水氣單胞菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，如連翹提取液與恩諾沙星聯(lián)用在一定程度上對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥性的阻控作用，主要依賴(lài)于連翹脂苷A對(duì)RND外排系統(tǒng)的抑制［60］。另有研究表明青蒿琥酯能增強(qiáng)氟喹諾酮類(lèi)藥物對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌作用，部分原因是青蒿琥酯抑制了RND外排系統(tǒng)的作用［61］。

圖2 藥物通過(guò)外排泵產(chǎn)生耐藥性機(jī)制簡(jiǎn)圖（根據(jù)Shi 等［58］繪制）Fig.2 Mechanism of drug resistance through efflux pump（Drawn according to Shi et al［58 ］）

2.2 影響DNA的編碼和轉(zhuǎn)錄翻譯

研究發(fā)現(xiàn)，所有致病菌、共生細(xì)菌以及環(huán)境細(xì)菌和噬菌體等均可形成抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）儲(chǔ)庫(kù)，病原菌可通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移從該庫(kù)中獲得抗性［62］，因此消除耐藥基因有利于提高嗜水氣單胞菌對(duì)藥物的敏感性，對(duì)耐藥性阻控具有重要意義，如acrA基因得到敲除后，能提高嗜水氣單胞菌對(duì)卡那霉素、羅紅霉素和巴洛沙星等的敏感性［63］。一些抗菌藥物具有消除耐藥基因或者抑制耐藥基因表達(dá)的功能，比如香豆素類(lèi)抗生素是DNA解旋酶抑制劑，影響質(zhì)粒復(fù)制［64］；氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物則阻礙DNA正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)與重組［65］；利福平通過(guò)與RNA聚合酶β亞單位結(jié)合以抑制RNA形成，阻斷RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程［66］。這為CT提供了新思路，即如果某藥物在一定程度上對(duì)促使細(xì)菌耐藥性形成的關(guān)鍵抗性基因表達(dá)發(fā)揮抑制作用，則有利于另一種藥物進(jìn)入菌內(nèi)并發(fā)揮其殺菌或抑菌功能，如β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和植物源性桑黃素可協(xié)同抑菌，其機(jī)理可能由于桑黃素通過(guò)抑制耐藥基因mecA編碼的抗性蛋白表達(dá)，恢復(fù)耐藥菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的敏感性而達(dá)到協(xié)同抑菌作用［67］。藥物之間的相互作用可能為分子層面直接的物理相互作用，比如達(dá)福普汀和泰妙菌素分別與核糖體的不同位點(diǎn)接合，從而達(dá)到抑制翻譯的目的［68］，而在植物乳桿菌素PlnEF與乳酸聯(lián)用時(shí)，嗜水氣單胞菌的能量代謝受干擾，DNA損傷修復(fù)因此受抑制，影響蛋白質(zhì)正確折疊，從而發(fā)揮協(xié)同的抑菌作用［69］。

2.3 促進(jìn)抗生素在胞內(nèi)的富集

研究指出，調(diào)節(jié)細(xì)菌的代謝環(huán)境可顯著影響抗菌藥物的抑菌能力，在細(xì)胞外環(huán)境中添加果糖、甘露醇或葡萄糖等代謝物會(huì)產(chǎn)生質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)（protonmotive force，PMF），從而使耐藥菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素（aminoglycosides，AGs）敏感［70］。有研究基于功能代謝組學(xué)分析表示，丙氨酸或葡萄糖通過(guò)底物促進(jìn)TCA循環(huán)，并導(dǎo)致NADH濃度升高，NADH通過(guò)電子傳遞鏈被氧化生成PMF，PMF可提高胞內(nèi)卡那霉素等抗生素濃度，有助于氨基糖苷類(lèi)抗生素的吸收，有效殺死耐藥菌（圖3）［71-72］。除加入外源性小分子外，外源性氨基酸與AGs聯(lián)用的抑菌效果也優(yōu)于單獨(dú)使用抗生素，如L-半胱氨酸可提高嗜水氣單胞菌對(duì)氟苯尼考的敏感性［73］。外源性氨基酸提高AGs抑菌效果的機(jī)理同樣也與PMF促進(jìn)抗生素在胞內(nèi)的富集相關(guān)，L-色氨酸可通過(guò)抑制鞭毛基因的表達(dá)來(lái)顯著降低細(xì)菌活性，以利于其被AGs殺死，更重要的是L-色氨酸可誘導(dǎo)產(chǎn)生NADH，從而促進(jìn)PMF生成，使AGs攝取量明顯增加，抗生素的抑菌力得以增強(qiáng)［74］；L-絲氨酸和L-賴(lài)氨酸可增加NAD+/NADH比率，破壞Fe-S團(tuán)簇并增加內(nèi)源活性氧的產(chǎn)生，從而促進(jìn)氨基糖苷類(lèi)藥物的殺菌 能力［75-76］。

圖3 丙氨酸和/或葡萄糖與抗生素聯(lián)合作用下的細(xì)胞殺傷機(jī)制Fig. 3 Cytotoxic mechanism of alanine and/or glucose combined with antibiotics

2.4 影響細(xì)胞膜的通透性

生物膜通常由胞外多糖、蛋白質(zhì)以及磷脂等組成，其作用之一是細(xì)菌內(nèi)外環(huán)境的隔離，作為屏障阻止高濃度抗菌藥物進(jìn)入胞內(nèi)，促使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［77］。在類(lèi)似嗜水氣單胞菌的革蘭氏陰性菌中，含有不對(duì)稱(chēng)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的外膜通道蛋白（outer membrane protein，OMP）和助膜融合蛋白（membrane fusion protein，MFP）（也稱(chēng)為周質(zhì)融合蛋白）發(fā)揮作用，藥物聯(lián)用可通過(guò)孔蛋白（親水小分子）、特異性通道以及脂質(zhì)雙層（如親脂分子）等一種或多種途徑進(jìn)入細(xì)菌（圖4），其中外膜蛋白在革蘭氏陰性菌的耐藥性中起至關(guān)重要的作用。Yao等［78］比較嗜水氣單胞菌中土霉素抗性菌株（OXY-R）與其原始對(duì)照菌株（OXY-O）外膜相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)如ΔAHA_4281、ΔAHA_2766、ΔAHA_2282、ΔAHA_1181以及ΔAHA_1280等突變體可促使嗜水氣單胞菌對(duì)抗生素敏感，而這些外膜蛋白的發(fā)現(xiàn)為闡述嗜水氣單胞菌耐藥性機(jī)制以及藥物靶點(diǎn)篩選提供理論基礎(chǔ)和研究載體。如果某種藥物增加菌膜對(duì)另一種藥物的滲透性，則產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，乳酸鏈球菌素與L-乳酸對(duì)嗜水氣單胞菌協(xié)同抑菌的機(jī)理即與之類(lèi)似。L-乳酸對(duì)嗜水氣單胞菌的外膜具有一定破壞作用，促進(jìn)乳酸鏈球菌素與細(xì)胞質(zhì)膜的接觸從而產(chǎn)生抑菌作用［79］，而氟苯尼考與甲砜霉素聯(lián)用，其可通過(guò)增加細(xì)胞膜通透性，使胞內(nèi)甲砜霉素濃度增加，從而促進(jìn)甲砜霉素發(fā)揮作用［80］，而甲砜霉素具有抑制肽?；D(zhuǎn)移酶活性，可阻止蛋白質(zhì)合成［81］。另外，香芹酚在亞抑制量下與迷迭香精油的主要成分1，8-桉葉素聯(lián)合作用于嗜水氣單胞菌30 min后，菌體的形態(tài)即發(fā)生明顯變化，在掃描電鏡和透射電鏡下可觀察到嗜水氣單胞菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破損，細(xì)胞膜通透性受到破壞，菌體死亡［82］。

圖4 抗菌藥物通過(guò)嗜水氣單胞菌細(xì)胞膜的流入和外排（根據(jù)Li［83］繪制）Fig. 4 Influx and efflux of antibiotics through the cell membrane of Aeromonas hydrophila（Drawn according to Li［83］）

3 聯(lián)合用藥對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥性影響

具有協(xié)同效應(yīng)的CT組合篩選及其窄譜性驗(yàn)證成為聯(lián)合用藥對(duì)耐藥性阻控研究領(lǐng)域最初也是主流的關(guān)注點(diǎn)。對(duì)于嗜水氣單胞菌耐藥性阻控的候選藥物篩選范圍也從抗生素、抗菌藥物擴(kuò)大至植物天然活性成分、小分子肽、群體感應(yīng)抑制劑等，在應(yīng)用上取得初步成效［84-86］。

3.1 植物活性組分與抗生素聯(lián)用

越來(lái)越多的研究表明植物活性組分與抗生素聯(lián)用對(duì)耐藥菌有協(xié)同的抑菌作用，不僅有助于降低抗生素的MIC，增強(qiáng)多重耐藥菌敏感性并緩減耐藥菌的產(chǎn)生［87］，更有利于降低抗生素的使用量，減少藥物在環(huán)境中的殘留［88］。我們首先比較了CA、IA以及CI等3種機(jī)制不同的模型在二元藥物組合對(duì)嗜水氣單胞菌抑制能力上的預(yù)測(cè)精度，從而證實(shí)嗜水氣單胞菌對(duì)不同濃度區(qū)間的不同CT組合在最終抑菌阻控上表現(xiàn)出復(fù)雜性；同時(shí)利用高內(nèi)涵篩選、成像流式細(xì)胞術(shù)以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等手段針對(duì)抗生素、抗菌藥物以及天然活性成分組成的62項(xiàng)CT組合進(jìn)行研究，篩選了“芳樟醇+土霉素”等在MIC范圍呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)的18項(xiàng)候選組合，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)藥物作用細(xì)菌靶點(diǎn)一致性可增強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)在MIC范圍內(nèi)出現(xiàn)的概率［84］。

Bandeira等［89］將天然植物活性成分香芹酚、檸檬醛、丁香酚、百里香酚和芳樟醇與抗生素氟苯尼考和土霉素聯(lián)用發(fā)現(xiàn)，其對(duì)耐藥氣單胞菌抑制產(chǎn)生相加或協(xié)同效應(yīng)，其中芳樟醇與氟苯尼考或與土霉素聯(lián)用的抑制效果最顯著，另外，有研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸和槲皮素對(duì)嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌具有顯著抑制作用，二者與恩諾沙星等抗生素聯(lián)用同樣具有相加或協(xié)同抑菌作用［90］；連翹和恩諾沙星的聯(lián)合使用較單獨(dú)作用相比可更大程度抑制耐藥嗜水氣單胞菌增殖并有利于減少抗生素用量及其在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)殘留，其中連翹可顯著影響嗜水氣單胞菌耐藥菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)生物學(xué)代謝過(guò)程［91］；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)天然活性成分蘆丁和肌醇與抗生素氟苯尼考連用不僅可有效抑制嗜水氣單胞菌增殖，提高宿主魚(yú)的機(jī)體免疫力，還可顯著提升已感染嗜水氣單胞菌魚(yú)的生存率［92-93］；槲皮素具有抗菌、抗炎等多種作用，在體外實(shí)驗(yàn)中，其與多種多酚酸聯(lián)用均具有協(xié)同效應(yīng)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的細(xì)菌如嗜水氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、愛(ài)德華氏菌均具有不同程度協(xié)同抑菌作用。上述研究為天然活性組分應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中氣單胞菌耐藥性阻控提供了候選方案，有望減輕水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素殘留負(fù)荷［94］。

3.2 小分子物質(zhì)與抗生素的聯(lián)用

細(xì)菌的代謝水平與抗菌藥物的敏感性存在相關(guān)性，添加外源小分子物質(zhì)可在一定程度上降低細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性［70］，基于功能代謝組學(xué)分析表示，小分子物質(zhì)與抗生素聯(lián)用，主要通過(guò)TCA循環(huán)增大PMF，從而提高進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的抗生素含量，而提高抗生素的抑菌活性（作用機(jī)制見(jiàn)圖3）。趙賢亮等［73］基于體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸可使氟苯尼考對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌率提高1.9-11.1倍，與劑量和時(shí)間呈現(xiàn)依賴(lài)性，同時(shí)通過(guò)魚(yú)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，二者聯(lián)用可大幅提升黃河鯉對(duì)嗜水氣單胞菌的抗感染能力，提高機(jī)體對(duì)病原菌的清除能力。不僅L-半胱氨酸可作為抗生素佐劑抑制嗜水氣單胞菌的耐藥性，L-色氨酸、L-絲氨酸和L-賴(lài)氨酸也可增加氨基糖苷類(lèi)抗生素的抑菌活性，降低耐藥菌對(duì)抗生素的耐藥性［74-76］。同時(shí)土霉素與外源小分子（蘋(píng)果酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸等）聯(lián)用可顯著降低耐藥嗜水氣單胞菌的存活率［95］。

3.3 抗生素與抗生素的聯(lián)用

抗生素作為一種相對(duì)快速有效的殺菌劑，當(dāng)單一藥物治療效果不佳時(shí)，最可能想到的是不同抗生素之間聯(lián)合使用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，孟思妤等［96］對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)的嗜水氣單胞菌進(jìn)行了抗生素藥物聯(lián)用試驗(yàn)，將鹽酸多西環(huán)素與煙酸諾氟沙星聯(lián)合作用于嗜水氣單胞菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)用后藥物的MIC顯著低于單一使用的MIC，且具有協(xié)同效應(yīng)。在對(duì)斑點(diǎn)氣單胞菌進(jìn)行聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)二元藥物組合可縮小氣單胞菌的MSW，有效地抑制斑點(diǎn)氣單胞菌生長(zhǎng)，其中利福平與鹽酸四環(huán)素的聯(lián)合效果更顯著［97］。還有研究將不同劑量頭孢噻肟和米諾環(huán)素聯(lián)合并作用于感染了嗜水氣單胞菌的小鼠，結(jié)果聯(lián)合藥物治療的小鼠存活率明顯高于單獨(dú)作用組［98］。任亞林［84］基于62對(duì)藥物組合對(duì)嗜水氣單胞菌的作用效果進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn) “甲砜霉素+恩諾沙星”等組合在不同物種間呈現(xiàn)高度保守性，即對(duì)氣單胞菌呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)的CT組合對(duì)弧菌卻可能表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。

4 討論與展望

由于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境及遺傳途徑具有高度復(fù)雜性，以及抗生素在生產(chǎn)中大量主動(dòng)使用（包括合理和違規(guī)使用）和被動(dòng)暴露（醫(yī)院生活廢水、畜禽養(yǎng)殖污水排放至養(yǎng)殖水體環(huán)境），處于MIC譜邊緣誘導(dǎo)抗生素耐藥性現(xiàn)象越來(lái)越普遍，直接和間接對(duì)人體健康產(chǎn)生危害［99］。而聯(lián)合用藥高效、簡(jiǎn)便以及相對(duì)低成本等優(yōu)勢(shì)在養(yǎng)殖業(yè)耐藥性控制上被逐步重視，未來(lái)針對(duì)水產(chǎn)行業(yè)嗜水氣單胞菌耐藥性削減有如下思考。

4.1 聯(lián)合用藥應(yīng)提升天然活性成分、生物制劑及新型納米材料等的價(jià)值

有研究發(fā)現(xiàn)噬菌體可通過(guò)破壞臨床分離到的嗜水氣單胞菌生物膜（biofilm）從而抑制其生長(zhǎng)并凈化水資源［100］，或通過(guò)控制運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥（MAS）等抑制嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)［101］?？咕目蓪?duì)抗嗜水氣單胞菌感染［102］，與氨芐西林聯(lián)用后可有效緩解副溶血弧菌耐藥性［103］。具有廣譜生物活性的香精油和金屬/金屬氧化物納米復(fù)合材料（因尺寸、表面積、活性和理化性質(zhì)不同而具有潛在抗氧化、抗癌和抗菌等功能）使用對(duì)阻控細(xì)菌耐藥性及替代療法開(kāi)發(fā)展示廣闊的發(fā)展前景［104］。因此，傳統(tǒng)抗生素和抗菌藥物聯(lián)用已不能滿(mǎn)足聯(lián)合用藥篩選庫(kù)的需求。天然活性成分（精油、多酚、萜類(lèi)、皂苷、生物堿等）、生物制劑（噬菌體、抗菌肽等）以及新型納米材料對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥性阻控和協(xié)防的價(jià)值應(yīng)被逐步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

4.2 聯(lián)合用藥應(yīng)建立在對(duì)耐藥機(jī)制及應(yīng)用場(chǎng)景全面研究基礎(chǔ)之上

聯(lián)合用藥的選擇取決于耐藥菌特定的遺傳學(xué)及抗性機(jī)制。一般而言，在無(wú)抗生素存在情況下，細(xì)菌群落共生協(xié)調(diào)，營(yíng)養(yǎng)供給平衡，菌體不同的組織結(jié)構(gòu)（例如DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁）合成速率保持穩(wěn)定，該微生物群體可快速增殖。而在DNA復(fù)制抑制劑（如環(huán)丙沙星）等存在情況下，蛋白質(zhì)合成不能充分下調(diào)，從而導(dǎo)致DNA表達(dá)與蛋白質(zhì)合成比例失衡。加入抑制DNA翻譯的藥物（如螺旋霉素）后則可降低蛋白質(zhì)合成速率，人為將DNA與蛋白質(zhì)比例恢復(fù)至最優(yōu)狀況，從而促使目標(biāo)菌群，如敏感細(xì)菌群勢(shì)得到恢復(fù)而削弱耐藥菌群，同時(shí)建立細(xì)菌種群耐藥性在體內(nèi)如何迅速響應(yīng)并抑制藥物變化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)聯(lián)合用藥的應(yīng)用推廣，這是利用聯(lián)合用藥機(jī)制解決耐藥性經(jīng)典且被證實(shí)的有效策略。但水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類(lèi)臨床應(yīng)用依然很大差異，水產(chǎn)品中嗜水氣單胞菌耐藥性阻控策略更多還需考慮應(yīng)用場(chǎng)景，包括養(yǎng)殖模式（開(kāi)放式還是部分開(kāi)放式等）以及開(kāi)放式養(yǎng)殖模式的周邊環(huán)境、養(yǎng)殖品種（餌料投喂及養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物的攝取方式），以及養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)附加值與聯(lián)合用藥投入比等。

4.3 聯(lián)合用藥應(yīng)合理且無(wú)偏倚利用協(xié)同效應(yīng)和拮抗效應(yīng)

聯(lián)合效應(yīng)機(jī)制在很大程度上仍未得到深入探索、臨床效果還有待證實(shí)，甚至與拮抗效應(yīng)相比，藥物之間的協(xié)同性還可能加快細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生速 度［35，105-106］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥呈現(xiàn)的拮抗效應(yīng)可通過(guò)對(duì)耐藥菌株控制從而促進(jìn)敏感菌株得以迅速增殖來(lái)保持和強(qiáng)化菌群整體敏感性，最終發(fā)揮緩解耐藥性的巨大優(yōu)勢(shì)［32，35，45，47］。但拮抗效應(yīng)的應(yīng)用可增加用藥劑量從而導(dǎo)致藥物對(duì)宿主產(chǎn)生毒性效應(yīng)，尤其對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖而言，還會(huì)提高用藥成本。所以選用拮抗效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng)綜合考慮。但對(duì)于集裝箱養(yǎng)殖模式、受控式流水池塘養(yǎng)殖模式的推廣，被忽視的拮抗效應(yīng)顯示出更為廣闊的應(yīng)用空間。

4.4 聯(lián)合用藥應(yīng)重視模型推演結(jié)合體外預(yù)測(cè)

通過(guò)微生物感染-增殖模型、動(dòng)力學(xué)模型和聯(lián)合效應(yīng)預(yù)測(cè)模型等可更好理解細(xì)菌菌群和藥物組合如何影響耐藥性控制的過(guò)程、現(xiàn)象及可能的結(jié)果。包括藥物互作的強(qiáng)度、易感和耐藥性亞群之間競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系及機(jī)制、細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)狀況等。對(duì)人體臨床應(yīng)用，幾乎所有具有協(xié)同和拮抗效應(yīng)的聯(lián)合用藥組通過(guò)體外或計(jì)算機(jī)模擬的方式進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)耐藥性的推演和模擬［107］。由于成本效益以及模擬難度較大，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)推廣依然存在巨大瓶頸，該瓶頸主要來(lái)自聯(lián)合用藥體現(xiàn)越來(lái)越顯著的個(gè)性化（即宿主的單一性），因此在“精準(zhǔn)醫(yī)療”大背景下，人類(lèi)臨床應(yīng)用的價(jià)值及其可推廣性尤為突出。而水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境的開(kāi)放性、水產(chǎn)動(dòng)物靶標(biāo)劑量難以控制以及使用劑量和藥物殘留之間難以平衡等帶來(lái)聯(lián)合用藥實(shí)際應(yīng)用具有障礙，但在高附加值水產(chǎn)動(dòng)物（海參、鮑魚(yú)、中華鱘等）的集裝箱養(yǎng)殖模式下也依然具有客觀的應(yīng)用前景。