• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      西藏地區(qū)牦牛源沙門菌分離鑒定、血清分型及致病性研究

      2022-07-22 06:53:14李天嬌班馬澤郎李登宇張開琴趙曉慧王保寧索朗斯珠
      四川大學學報(自然科學版) 2022年4期
      關(guān)鍵詞:都柏林沙門血清型

      李天嬌,班馬澤郎,李登宇,張開琴,趙曉慧,王保寧,2,索朗斯珠

      (1.西藏農(nóng)牧學院動物科學學院,林芝 860000;2.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院,成都 610041)

      1 引 言

      沙門菌(Salmonella)為革蘭氏陰性短小桿菌,腸桿菌科沙門菌屬[1].據(jù)國內(nèi)外研究報道,沙門菌在多種動物中均有發(fā)現(xiàn),在動物相關(guān)副產(chǎn)品及食材中也常有檢出,所以沙門菌也是食源性疾病中最常見的病原菌之一,動物感染沙門菌時,常引起胃腸炎及局部炎癥,嚴重時會引起不同程度的敗血癥[2-4].成牛感染時臨床表現(xiàn)為水樣或血樣腹瀉,嚴重時表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病或流產(chǎn);犢牛感染時死亡率高于成牛[5].牦牛是生長在我國高海拔地區(qū)的特有物種,西藏作為我國牦牛主產(chǎn)地之一,牦牛更是當?shù)啬撩竦闹匾?jīng)濟來源之一[6].自關(guān)龍伏等人[7]于1985年首次報道從青海牦牛源中分離出沙門菌后;張斌等[8]、柏雪等[9]和馮蘭等[10]也陸續(xù)報道了青海、四川等地牦牛源沙門菌相關(guān)研究,說明沙門菌在高海拔牧區(qū)長期處于流行狀態(tài).加之,沙門菌主要以糞-口傳播,牧區(qū)養(yǎng)殖模式又以放牧為主,利于沙門菌的傳播,嚴重影響當?shù)仃笈pB(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.

      沙門菌血清型多達2500種,常見血清型均具有一定致病性,同時根據(jù)宿主的感染范圍不同,血清型也會有所不同,致病性也有所差異[11].牛沙門菌病可由多種血清型引起,都柏林沙門菌為其中最主要的血清型,牛作為其天然宿主極易被感染,沙門菌也易導致母牛流產(chǎn),犢牛死亡.了解宿主的優(yōu)勢血清型及致病性強弱,有助于為相關(guān)疫病提出較為針對性的防控管理措施.

      目前,國內(nèi)外針對牦牛源沙門菌的研究較少,西藏地區(qū)沙門菌感染情況、菌株的分離鑒定和優(yōu)勢血清型等相關(guān)方面的研究更甚.因此,本研究通過采集西藏拉薩市、林芝市、昌都市和山南市等西藏全部七地市牦牛源腹瀉樣品,對樣品中的沙門菌進行分離鑒定及血清型分型,旨在了解西藏各地區(qū)牦牛源沙門菌感染情況及優(yōu)勢血清型分布情況,同時隨機選取本試驗中優(yōu)勢血清型沙門菌一株進行動物試驗和病變組織切片,旨在了解其菌株的致病性強弱.為后續(xù)相關(guān)方面深入研究提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持.

      2 材料與方法

      2.1 材 料

      牦牛源新鮮腹瀉糞便,采集自西藏拉薩市、林芝市、昌都市和山南市等七地市,共199份,樣品具體分布情況見表1.樣品采集后及時編號,保存至-20 ℃冰箱.

      表1 樣品分布情況

      BPW培養(yǎng)基、MRSV培養(yǎng)基購自美國BD公司;LB培養(yǎng)基、TTB培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司;革蘭氏染色試劑盒購自青島海博生物技術(shù)有限公司;TR101沙門菌屬診斷血清試劑盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)、DL 2000 DNA marker購自大連寶生物有限公司.試驗動物為SPF級,4~6周年齡、體重18~20 g的KM小鼠72只,購自成都達碩實驗動物有限公司.

      2.2 方 法

      2.2.1 細菌分離培養(yǎng) 將采集的樣品參照GB4789.4-2010[12]和Liu等人[13]的方法進行分離培養(yǎng).將樣品接種于BPW培養(yǎng)液中,進行前期預增菌;將上述增菌液接種在MRSV半固體培養(yǎng)基上,進行初篩;初篩后的菌液在SS、XLT4選擇性培養(yǎng)基上復篩;篩選出的單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢;并將符合形態(tài)特征的菌落接種于TTB培養(yǎng)液進行純化.

      2.2.2 生化試驗 將TSI固體培養(yǎng)基制成斜面培養(yǎng)基,將純培養(yǎng)菌液在TSI培養(yǎng)基上進行斜面穿刺,37 ℃培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果.

      2.2.3 PCR鑒定 利用高溫裂解法提取菌株的DNA,并利用PCR技術(shù)檢測菌株的特異性鑒定基因invA[14],引物序列:5′-GTGAATTATCGCACGTTCGGCAA-3′;5′-TCATCGCACGTCAAAGGAACC-3′.將引物序列送至上海生工生物科技有限公司合成.

      反應總體系25 μL,其中:DNA模板2 μL,Premix TaqTM12.5 μL,上下游引物各1 μL,ddH2O補充至25 μL.退火溫度為61 ℃,共35個循環(huán).PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并將擴增產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司測序.

      2.2.4 血清型鑒定 將TSB中純培養(yǎng)菌液接種于營養(yǎng)瓊脂上,37 ℃培養(yǎng)12 h.將培養(yǎng)基中的單菌落在玻片上與TR101沙門菌屬血清診斷試劑盒(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)中的血清混合,觀察凝集的情況并記錄凝集情況,血清凝集結(jié)果根據(jù)Kauffman-white[15]標準進行分析.

      2.2.5 測定菌株LD50從此次菌株優(yōu)勢血清型(Salmonelladublin)中隨機選取一株沙門菌,該菌株編號為H42,測定其LD50.將馴養(yǎng)后的KM小鼠隨機分成7組試驗組,1組對照組,1組空白組,每組各8只小鼠.

      表2 試驗組小鼠注射菌量

      2.2.6 病理切片 將攻毒后24 h內(nèi)(急性)死亡小鼠,72 h后(慢性)死亡小鼠立即解剖后,取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、胃組織、腸組織于無菌生理鹽水洗滌后,用4%多聚甲醛進行固定,并將組織委托成都里來生物有限公司制作HE切片進行觀察,并記錄結(jié)果.

      3 結(jié) 果

      3.1 細菌分離純化

      將疑似菌落接種于SS固體培養(yǎng)基和BS固體培養(yǎng)基上,菌株在SS平板上生長出透明且中心帶黑點的圓形單菌落,在BS平板上生長出黑褐色且?guī)в薪饘俟鉂傻膱A形單菌落,將疑似單菌落染色鏡檢后,顯微鏡油鏡下觀察為粉紅色短小桿菌.以上特征均符合沙門菌生長特性及形態(tài)學特征,結(jié)果見圖1.

      圖1 分離菌株的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果

      分離菌株均能與TSI反應生成H2S黑色沉淀,且分解TSI中葡萄糖,使斜面變紅,表面氧化后則變黃,符合沙門菌生化特性.

      疑似沙門菌的單菌落進行特異性基因invA檢測顯示,分離菌株目的條帶約為284 bp,與預期條帶大小相似,結(jié)果見圖2.將PCR結(jié)果結(jié)合培養(yǎng)特性、形態(tài)學特征及生化特性結(jié)果顯示:西藏7地市共分離出50株沙門菌,檢出率為25.13%(50/199).其中拉薩19株,檢出率為32.20%(19/57);林芝9株,檢出率為19.57%(9/46);那區(qū)7株,檢出率為19.44%(7/36);日喀則2株,檢出率為20.00%(2/10);山南4株,檢出率為28.57%(4/14);阿里2株,檢出率為13.34%(2/15);昌都7株,檢出率36.84%(7/19).本次分離結(jié)果中,拉薩、昌都和山南三地分離率相較于其他四地較高,阿里地區(qū)的分離率最低.

      圖2 牦牛源沙門菌invA基因PCR結(jié)果

      3.4 血清型鑒定

      本次血清型分型結(jié)果顯示:50株沙門菌共分屬B群、C1群、C2群、D群4種血清群,含都柏林沙門菌、傷寒沙門菌、阿邦尼沙門菌等血清型共18種.按血清群統(tǒng)計結(jié)果顯示:4種血清群中,以D群所占血清菌株最多,為常見血清群,含5種血清型,共20株分離菌;其次是B群含8種血清型,共19株菌;C1群占3種血清型,共9株菌;C2群占2種血清型,共2株菌,具體結(jié)果詳見圖3.

      圖3 50株牦牛源沙門菌所占血清群比例

      從18種血清分型結(jié)果顯示:西藏地區(qū)沙門菌的優(yōu)勢血清型為都柏林沙門菌共10株,占總分型菌株的20.00%(10/50);其次是傷寒沙門菌和阿邦尼沙門菌個7株,占總分型菌株的14.00%(7/50);接著是丙型副傷寒沙門菌共6株,占總分型菌株的12.00%(6/50),血清型統(tǒng)計結(jié)果詳見圖4.

      圖4 50株牦牛源沙門菌血清型分布情況

      從各地沙門菌血清分型結(jié)果顯示:各地所占血清群、血清型數(shù)量均不相同.其中,拉薩市共有10種血清型,且4種血清群均有分布,以都柏林沙門菌和傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清群;林芝市共5種血清型2種血清群,以都柏林和阿邦尼沙門菌為優(yōu)勢血清型;那曲市共5種血清型,以丙型副傷寒、傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型;日喀則兩株分離菌均為伯里沙門菌;昌都市共包括6種血清型,以阿邦尼沙門菌為優(yōu)勢血清型;阿里和山南分離菌株均為不同血清型,具體結(jié)果詳見表3.

      表3 西藏各地市牦牛源沙門菌血清分型情況(單位:株)

      3.5 牦牛源Salmonella Dublin感染小鼠的LD50

      LD50試驗結(jié)果(詳見表4),經(jīng)SPSS 21.0軟件分析,牦牛源都柏林沙門菌對感染小鼠的LD50為0.368×108CFU/mL,95%置信區(qū)間為0.311×108~0.434×108CFU/mL.

      表4 各組小鼠感染牦牛源都柏林沙門菌死亡情況

      3.6 病理切片

      光鏡下觀察小鼠組織病理切片結(jié)果顯示:急性(24 h內(nèi))死亡組小鼠的心臟、腸組織和胃組織相關(guān)細胞結(jié)構(gòu)完整清晰無明顯病變,肝臟、脾臟和肺臟相關(guān)細胞出現(xiàn)輕微壞死和變性.慢性(72 h后)死亡組小鼠心臟間質(zhì)輕微炎細胞浸潤,以淋巴細胞為主;脾臟相較于急性組較為嚴重,白髓和紅髓細胞變性、壞死且細胞邊緣基本消失,免疫細胞聚集增多;肺泡上皮細胞也相較于急性組嚴重,出現(xiàn)上皮細胞慢性壞死;腸組織黏膜層結(jié)構(gòu)模糊,大面積溶解壞死,腸腔壞死區(qū)域細胞大量壞死,部分區(qū)域出現(xiàn)輕微充血擴張;胃部黏膜層也壞死溶解明顯,結(jié)果詳見圖5.

      圖5 牦牛源都柏林沙門菌感染小鼠各病變組織病理切片

      4 討 論

      沙門菌作為一類重要的食源性病原菌,宿主眾多,可感染各個年齡段的牛只,以犢牛最為常見[17].李慧明等人[18]對四川省牦牛群調(diào)查結(jié)果顯示,沙門菌引起的的牦牛發(fā)病率2.76%~34.82%,死亡率高達4.61%~47.32%.隨著研究深入,國內(nèi)各地有關(guān)牦牛源沙門菌的相關(guān)報道也逐步增多,說明沙門菌在牦牛群中處于長期流行狀態(tài),且死亡率也較高,但針對西藏牦牛源沙門菌相關(guān)研究報道卻較為少見.本次研究中,西藏地區(qū)牦牛源沙門菌總分離率為25.13%,與逯玉等人[19]從青海犢牛腹瀉樣品的分離率24.00%結(jié)果相似.本次研究結(jié)果確定沙門菌在西藏牦牛源中存在,七地市均有分離說明該細菌在西藏存在一定的流行趨勢.

      目前,高原草場超載、礦元素缺乏等問題普遍存在于青藏高原等高海拔地區(qū),這些原因可直接影響牦牛生長發(fā)育、機能維持等方面[20].而西藏整體處于該情況,加之牛群結(jié)構(gòu)不合理、養(yǎng)殖模式單一,牛群常有未淘汰的老牛、未及時發(fā)現(xiàn)的病牛和抵抗力較弱的犢牛,導致牛群極易感染各類病原菌;并且在放牧情況下,病牛和隱性感染牛不易發(fā)現(xiàn),污染放牧環(huán)境,加大牛群患病機率[21].本次研究結(jié)果提示我們需改善養(yǎng)殖方式和加強監(jiān)管措施,減少感染機率,尤其分離率高的地區(qū)更應引起重視.同時,分離率最高的拉薩、昌都、山南三地,環(huán)境相似,海拔較為接近,但感染率高是否與海拔存在相關(guān)性,還需深入研究.

      沙門菌對人和溫血動物致病的血清型主要集中于A~F血清群,朱曉霞等人[22]針對四川藏區(qū)沙門分群中血清型也主要集中于B群、D群中,與本次試驗中常見血清群結(jié)果相似,說明牦牛雖產(chǎn)地不同,但高海拔地區(qū)也存在一定的相似性.沙門血清根據(jù)宿主感染不同,存在專嗜性、偏嗜性、泛嗜性.牛沙門菌病可由多種血清型引起,都柏林沙門菌為牛源最主要的血清型,其次是鼠傷寒沙門菌,本次研究中以上兩種血清型均有分離,都柏林沙門菌更是西藏牦牛源優(yōu)勢血清型[23].李慧明等人[18]針對四川牦牛源沙門菌鑒定結(jié)果顯示,菌株中21.87%為都柏林沙門菌;20世紀80年代陳含義等人[24]和滕振光等人[25]分別從青海兩地牦牛源中分離出的沙門菌也均為都柏林沙門菌;國外也曾有牛群感染都柏林沙門菌的報道.

      本次試驗中牦牛源都柏林沙門菌感染KM小鼠的半數(shù)致死結(jié)果為0.368×108CFU/mL,相較于馮蘭等[10]感染小鼠的半數(shù)致死結(jié)果1.2×107CFU/mL較高,屬于強致死性菌株.隨后觀察病變組織切片發(fā)現(xiàn)此株都柏林沙門菌可引起宿主全身性感染,心臟組織心肌纖維變性壞死,肝臟組織肝細胞變性壞死、肝竇淤血擴張,脾臟組織淋巴細胞減少、壞死、白髓萎縮、脾血竇淤血,肺臟組織支氣管脫落、肺泡上皮細胞變性壞死、水腫、炎細胞浸潤、出血,腸組織黏膜層變性壞死、充血,胃組織黏膜層變性壞死等病理改變,與對照組相比,急性組和慢性組均可見不同程度病理改變,且慢性組整體病理程度重于急性組,其中脾臟、肺臟、腸和胃組織病變程度較重.因此,我們需重視S.Dublin引起的危害,及時制定有針對性的防控管理措施.同時此次沙門血清分型種類較多,我們也需考慮存在多種血清型引起牛只患病的情況,需要我們提高對牛群沙門菌感染情況的重視.

      此次牦牛源沙門菌中還分離出鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌,這兩種血清型具有泛嗜性,擁有廣泛感染的宿主譜,可引起人和多種動物相關(guān)沙門菌病,具有重要的公共衛(wèi)生學意義[26].乙型、丙型副傷寒沙門菌主要造成人類食物中毒,孔雪英等人[27]曾從牦牛肉中檢出這兩種副傷寒沙門菌,說明牦牛在屠宰過程中可能感染沙門菌,而人類食用牦牛肉時,也存在一定的感染風險.因此我們需加強在牛只屠宰到銷售過程中的監(jiān)管環(huán)節(jié),降低副產(chǎn)品被污染的機率.同時,病牛沙門菌作為罕見的非傷寒沙門菌,和紐波特沙門菌,在研究報道中主要是食物污染而引起的食物中毒,也需引起相關(guān)監(jiān)管部門的重視[28,29].阿邦尼沙門菌毒性也較強,孫陽陽等人[30]曾在驢源中分離,陳俊等人[31]人則從鴨源中分離得到奧斯陸沙門菌,而本次牦牛源沙門分型結(jié)果中均分離得到這兩種血清型,需考慮這兩種血清型可能存在多種動物間交叉感染的情況.而伯里、阿雷查瓦萊塔、里森、塔西、仙臺等血清型相關(guān)研究報道較少,是否具有較強毒性和致病性還需進一步研究.本次分型結(jié)果中沙門菌血清型種類較多,優(yōu)勢血清型特點突出,部分血清型宿主廣泛、危害較大,提示我們需引起高度重視,也可針對相關(guān)優(yōu)勢血清型進行深入研究.

      5 結(jié) 論

      目前,國內(nèi)外針對牦牛源沙門菌研究較少,有關(guān)全區(qū)牦牛源沙門菌的研究更少.本次實驗針對西藏全區(qū)牦牛源沙門菌進行分離鑒定,確定沙門菌在西藏牦牛源中確實廣泛存在,且具有一定流行趨勢;本次試驗也確定了西藏地區(qū)的常見血清群和優(yōu)勢血清型;確定了牦牛源S.Dublin具有較強的致病性.為以后相關(guān)方面深入研究提供理論基礎(chǔ),也為相關(guān)部門防治提供數(shù)據(jù)支撐.

      猜你喜歡
      都柏林沙門血清型
      都柏林的午后
      英語世界(2023年6期)2023-06-30 06:28:48
      愛爾蘭都柏林一日游
      英語世界(2023年6期)2023-06-30 06:28:44
      都柏林的靜默行者
      英語世界(2023年6期)2023-06-30 06:28:40
      都柏林的一個夏日(節(jié)選)
      英語世界(2023年6期)2023-06-30 06:28:32
      一株雞白痢沙門菌噬菌體的發(fā)酵及后處理工藝研究
      中國飼料(2022年5期)2022-04-26 13:42:36
      沙門菌噬菌體溶菌酶LysSHWT1的制備及抑菌活性分析
      2013-2017年北京市順義區(qū)腹瀉病例中沙門菌流行特征
      通遼地區(qū)牛肉與牛肉制品沙門氏菌血清型調(diào)查
      食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:44
      廣東地區(qū)水禽大腸桿菌血清型鑒定
      肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學檢測方法
      通化市| 禄丰县| 胶南市| 开封市| 博爱县| 柳河县| 濮阳县| 福安市| 信丰县| 汾阳市| 嵩明县| 河津市| 东阿县| 德保县| 永吉县| 永善县| 济源市| 桐乡市| 竹溪县| 五寨县| 屏东县| 新疆| 清涧县| 平遥县| 三台县| 南宁市| 泽州县| 全椒县| 淮滨县| 海城市| 通化县| 新宁县| 临沭县| 临猗县| 正蓝旗| 文昌市| 宣汉县| 兴文县| 浦县| 霍城县| 南澳县|