HPLC-PDA法同時測定補腎強筋丸中5種成分

崔旭輝，李喜香，王雪梅，周婷婷，白兆娟

(1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院藥學部，甘肅 蘭州 730050)

補腎強筋丸由山茱萸、續(xù)斷、白芍、當歸等10味藥材組成，具有補益肝腎、強筋健骨功效，臨床上主要用于治療地方性骨質(zhì)疏松型氟骨癥，療效明顯[1-2]。方中山茱萸活性成分為馬錢苷、莫諾苷[3]，具有抑制軟骨細胞凋亡、促進細胞生長、延緩骨關(guān)節(jié)炎等[4-6]作用；白芍活性成分為芍藥苷[3]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗骨質(zhì)疏松等[7-9]作用；當歸活性成分為阿魏酸[3]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗成骨細胞凋亡等[10-11]作用；續(xù)斷活性成分為川續(xù)斷皂苷Ⅵ[3]，具有抗骨質(zhì)疏松、抗細胞凋亡等[12-13]作用。

研究表明，單一成分很難全面客觀評價中藥復方制劑質(zhì)量[14-15]，前期有學者采用HPLC法對歸柏化瘀膠囊中阿魏酸、芍藥苷，以及補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷含量進行測定[16-17]，但檢測指標仍較單一。目前，尚未建立補腎強筋丸質(zhì)量標準，故本實驗采用HPLC-PDA法同時測定該制劑中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ACQUITY ARC型高效液相色譜儀，配置四元溶劑管理器-R、樣品管理器FTN-R、2998PDA檢測器(美國Waters公司)；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SECURA125-1CN型十萬分之一天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；Elix Essential 5型純水機(德國默克密理博公司)。

1.2 試劑與藥物 補腎強筋丸由甘肅省中醫(yī)院制劑中心提供(40 g/瓶)，批號分別為 210405、210503、210606。山萸肉(批號200803)、當歸(批號190812)、白芍(批號191109)、續(xù)斷(批號200404)等藥材均購自甘肅康樂藥業(yè)有限責任公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李喜香主任中藥師鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》一部項下有關(guān)規(guī)定。馬錢苷(批號P22F10F81444，純度98%)、莫諾苷(批號P11M11F112846，純度97%)、阿魏酸(批號L03A9D57744，純度98%)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ(批號Z19J11L108584，純度98%)、芍藥苷(批號G17A11L111364，純度98%)對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純(德國默克公司)；其余試劑均為分析純；水為屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Sun Fire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～7 min，5%～6%A；7～8 min，6%～10%A；8～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～32 min，20%～27%A；32～40 min，27%～30%A；40～45 min，30%～34%A；45～50 min，34%～5%A；50～55 min，5%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫28 ℃；檢測波長212 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸對照品適量，置于5 mL量瓶中，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為5.231、2.802、0.360 mg/mL的溶液；精密稱取芍藥苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，置于2 mL量瓶中，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為9.306、9.416 mg/mL的溶液。將上述2種溶液混合于同一5 mL量瓶中，甲醇定容，即得(含0.912 mg/mL莫諾苷、0.502 mg/mL馬錢苷、1.745 mg/mL芍藥苷、0.036 mg/mL阿魏酸、1.788 mg/mL川續(xù)斷皂苷Ⅵ)。

2.2.2 供試品溶液 取研細的本品3 g，置于具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，甲醇補足減失的質(zhì)量，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝制得缺山茱萸、缺白芍、缺當歸、缺續(xù)斷的陰性樣品，按“2.3.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分分離度良好(均大于1.5)，峰形對稱，陰性無干擾。

1.莫諾苷 2.馬錢苷 3.芍藥苷 4.阿魏酸 5.川續(xù)斷皂苷Ⅵ1.morroniside 2.loganin 3.paeoniflorin 4.ferulic acid 5.asperosaponin Ⅵ圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液1.0 mL，甲醇稀釋5次，分別含莫諾苷28.5、57.0、114.0、228.0、456.0 μg/mL，馬錢苷15.7、31.4、62.8、125.5、251.0 μg/mL，芍藥苷54.5、109.1、218.1、436.3、872.5 μg/mL，阿魏酸1.12、2.24、4.50、9.00、18.00 μg/mL，川續(xù)斷皂苷Ⅵ 55.9、111.8、223.5、447.0、894.0 μg/mL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD分別為2.02%、2.11%、1.67%、1.95%、2.06%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD分別為1.88%、1.85%、1.72%、2.01%、2.12%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取本品(批號210503)6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量RSD分別為1.73%、1.44%、1.39%、1.56%、1.93%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品(批號210503)9份，每份1.5 g，每3份為1組，分別按80%、100%、120%水平加入對照品溶液適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均加樣回收率分別為97.61%、98.71%、99.92%、99.82%、97.66%，RSD分別為1.24%、1.45%、1.21%、1.44%、1.59%。

2.6 樣品含量測定 取3批樣品，每批3份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents (n=3)

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實驗采用190～400 nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)馬錢苷、莫諾苷在252 nm處有最大吸收，芍藥苷在230 nm處有最大吸收，阿魏酸在310 nm處有最大吸收，川續(xù)斷皂苷Ⅵ在212 nm處有最大吸收，但在212 nm處阿魏酸、芍藥苷峰面積相較于最大吸收并無明顯差別，而馬錢苷、莫諾苷峰面積略微減小，考慮到此處各成分陰性干擾小，可同時將5種成分全部分離，并且峰形良好，故選擇212 nm。然后，本實驗考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水等，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸洗脫時各成分分離效果較好，無拖尾，故以其為流動相。

3.2 供試品溶液制備方法 參考文獻[18]報道，本實驗首先考察了超聲提取、加熱回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者提取率無明顯差別，但前者效率更高，故選擇超聲提取。然后，考察了提取溶劑70%甲醇、80%甲醇、甲醇，發(fā)現(xiàn)含水甲醇提取時各成分色譜峰峰形較差，而且進樣前濾過困難，導致樣品損耗大，故選擇甲醇。最后，考察了提取時間30、40、60 min，發(fā)現(xiàn)提取30 min時提取率較低，提取40、60 min時無明顯差異，考慮到效率方面，故選擇40 min。

4 結(jié)論

本實驗首次采用HPLC-PDA法同時測定補腎強筋丸中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷、阿魏酸、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，該方法簡便可靠，重復性好，可用于該制劑質(zhì)量控制，并為提升其他醫(yī)院制劑質(zhì)量及二次開發(fā)提供依據(jù)。