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    食管癌組織LOC100130476 基因的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性分析

    2022-07-22 03:05:06耿錦楠張雅青
    衛(wèi)生職業(yè)教育 2022年16期
    關(guān)鍵詞:反義癌基因甲基化

    耿錦楠,張雅青,張 煦,陸 濱

    (1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000;2.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部,甘肅 蘭州 730030;3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;4.蘭州市第二人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000)

    食管癌(Esophageal Carcinoma,EC)是在世界范圍最常見、多發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,有調(diào)查顯示,其致死率僅次于胃癌[1-2]。該病發(fā)病有明顯地區(qū)差異,約80%的食管癌發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家[3]。我國(guó)是EC 高發(fā)國(guó)家,尤其多見于河南、山西、河北等省份,其中食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal Squamous Cell Cancer,ESCC)占EC 的90%以上[4]。該病預(yù)后較差,病情進(jìn)展至中晚期后患者的5 年生存率為10%~15%[5]。因此有必要尋找新的適用于ESCC 早期診斷及治療的分子靶點(diǎn),以提高生存率,改善預(yù)后。LOC100130476 基因是一類位于人染色體6q23.3 的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA),師雅斌等[6]對(duì)其在ESCC 中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,LOC100130476 在ESCC 中呈異常低表達(dá),可能與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但目前有關(guān)LncRNA LOC100130476 在ESCC中具體作用及其與預(yù)后的關(guān)系,國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本研究采用RT-PCR 法檢測(cè)ESCC 患者癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本LOC100130476 的表達(dá)水平,進(jìn)一步探討LOC100130476 在ESCC 組織中的表達(dá)情況、與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性,旨在為ESCC 的診斷和治療提供依據(jù)。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 對(duì)象

    1.1.1 一般資料 選取2014 年10 月—2016 年12 月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院收治的食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)手術(shù)患者70 例,均取原發(fā)灶及癌旁組織(距原發(fā)灶邊緣≥5 cm)標(biāo)本,標(biāo)本留取后于30 min 內(nèi)置于液氮中并轉(zhuǎn)運(yùn)至冰箱保存,經(jīng)HE 染色確定為食管鱗狀細(xì)胞癌組織,癌旁組織未見癌細(xì)胞浸潤(rùn)。手術(shù)切除采集組織標(biāo)本后一部分于新鮮狀態(tài)下置于液氮冷藏,后入-80 ℃冰箱保存,供提取組織總RNA 及DNA,行RT-PCR 檢測(cè);另一部分組織標(biāo)本以10%福爾馬林固定并制作蠟塊保存,行HE 染色后觀察組織形態(tài)。70 例患者中男49 例,女21 例,年齡44~80歲,平均(61.59±10.32)歲。參考2017 年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)發(fā)布的食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)(第7 版)[7]進(jìn)行分期,依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]確定分化程度(1 級(jí):高度分化;2 級(jí):中度分化;3 級(jí):低度分化)。以病歷回顧或電話隨訪等形式獲取所有患者臨床和預(yù)后資料。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),且患者對(duì)實(shí)驗(yàn)知情并簽署同意書。

    1.1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)70 例患者經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為ESCC,行根治或姑息性切除術(shù);(2)均為原發(fā)性食管鱗癌,術(shù)前未接受放化療治療;(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)食管腺癌(EAC)患者;(2)心、肝、腎等重要臟器功能不全者;(3)合并自身免疫疾病或精神疾病者;(4)并發(fā)其他惡性腫瘤者。

    1.2 方法

    1.2.1 主要儀器、試劑 實(shí)驗(yàn)儀器:PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI 公司GeneAMP PCR)、微型離心機(jī)(賽洛捷克掌上離心機(jī))、快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司,型號(hào):XK96-A 型)、低溫冷凍離心機(jī)(上海精密儀器有限公司,型號(hào):DL-6000B 型)、冷凍存貯冰箱(青島海爾,型號(hào):HYC-940 型)、超低溫冰箱(青島海爾,型號(hào):DW-86L386 型)等。實(shí)驗(yàn)試劑:試劑(美國(guó)Invitrogen Life Technologies 公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司)、SYBR Real-Time PCR 試劑盒(美國(guó)Thermo 公司)、PCR 引物(上海生工技術(shù)有限公司)、蛋白酶K(美國(guó)Ambion 公司)、胎牛血清(美國(guó)BI 公司)等。

    表1 RT-PCR 引物序列及擴(kuò)增條件

    1.2.3 隨訪 出院后以上門和電話等形式隨訪,隨訪截止日期為2019 年12 月20 日。以手術(shù)開始至局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或末次隨訪時(shí)間定義為無病生存期(Disease Free Survival,DFS),失訪或死亡為刪失值,以手術(shù)開始至任何原因死亡或末次隨訪時(shí)間定義為總生存期(Overall Survival,OS),分析其術(shù)后生存情況。

    1.3 觀察指標(biāo)

    (1)組織標(biāo)本HE 染色后觀察組織形態(tài);(2)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC100130476 基因在ESCC 及癌旁組織中的表達(dá)水平;(3)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC100130476 基因表達(dá)與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系分析;(4)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC100130476 基因表達(dá)與ESCC 患者生存情況的關(guān)系分析;(5)ESCC 不良預(yù)后危險(xiǎn)因素分析。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 組織標(biāo)本HE 染色結(jié)果

    HE 染色結(jié)果顯示,所采集腫瘤標(biāo)本均為ESCC 組織,其對(duì)應(yīng)癌旁組織無癌細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1~2)。

    圖1 正常食管鱗狀上皮組織(HE 200×)

    圖2 ESCC 組織(HE 200×)

    2.2 LOC100130476 在ESCC 及癌旁組織中的表達(dá)水平

    RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,ESCC 組織中LOC100130476 相對(duì)表達(dá)量下調(diào),其表達(dá)量(0.79±1.62)顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織(2.89±2.77),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.475,P=0.000),見圖3。

    圖3 LOC100130476 在ESCC 組織中表達(dá)明顯下調(diào)

    2.3 LOC100130476 表達(dá)與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

    ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)與腫瘤分化程度、T 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),見表2。

    表2 LOC100130476 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

    2.4 LOC100130476 表達(dá)與ESCC 患者生存情況的關(guān)系

    術(shù)后隨訪3 年,70 例患者生存29 例,占41.43%,死亡41例,占58.57%。LOC100130476 低表達(dá)組生存率低于高表達(dá)組(P<0.05),患者DFS 和OS 均短于高表達(dá)組(P<0.05),見表3。

    表3 LOC100130476 表達(dá)與ESCC 患者生存情況的關(guān)系

    2.5 危險(xiǎn)因素分析

    COX 多因素回歸分析顯示,LOC100130476 表達(dá)水平是影響ESCC 不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表4。

    表4 影響ESCC 患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素

    3 討論

    3.1 LncRNA 通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展乃至浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移

    LncRNA 是指長(zhǎng)度在200~100 000 nt 之間,具有調(diào)控基因表達(dá)作用非編碼RNA 分子,其不編碼蛋白質(zhì),多以RNA 形式通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展乃至浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。目前人類已發(fā)現(xiàn)的LncRNA 多達(dá)11 萬種[9],其在多種常見惡性腫瘤組織及細(xì)胞中呈異常表達(dá)(上調(diào)或下調(diào)),在ESCC 中異常表達(dá)的LncRNA 包括HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA、肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1、前列腺癌上調(diào)長(zhǎng)鏈非編碼RNA1、肝細(xì)胞核因子1 同源異形盒反義RNA1、邊緣系統(tǒng)相關(guān)膜蛋白反義RNA3、FOXC1 基因啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄體、尿路上皮癌胚抗原1、ENST000005479631.1 等。其中HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA 被證實(shí)在絕大多數(shù)ESCC 中呈異常表達(dá),是癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力得以增強(qiáng)的重要驅(qū)動(dòng)因素,同時(shí)也是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。

    3.2 LncRNA LOC100130476 基因在多種腫瘤組織中發(fā)揮抑癌基因作用

    LncRNA LOC100130476 是LncRNA 的重要成員,其位于染色體6q23.3,現(xiàn)有研究證實(shí)該基因有3 個(gè)CpG 島,長(zhǎng)度分別為224、768、151 bp。師雅斌等[6]對(duì)LncRNA LOC100130476 在ESCC 中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,LOC100130476 在ESCC 組織中的表達(dá)量明顯低于正常組織,提示其可能在ESCC中發(fā)揮抑癌基因的作用。此后相繼有研究發(fā)現(xiàn),LncRNA LOC100130476 在胃賁門腺癌組織和腎細(xì)胞癌原發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)低于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織[11-12],這進(jìn)一步提示LncRNA LOC100130476 可能在多種腫瘤組織中發(fā)揮抑癌基因作用,但其在ESCC 組織中的表達(dá)及導(dǎo)致其表達(dá)異常的機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),ESCC 組織中LOC100130476 的表達(dá)顯著低于癌旁組織,提示其在ESCC 患者癌組織中表達(dá)下調(diào),可能發(fā)揮抑癌基因作用,與既往研究結(jié)論一致[6]。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),ESCC組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)與腫瘤分化程度、T 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),即低分化、T3 期和出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的ESCC 組織LncRNA LOC100130476 的表達(dá)水平相對(duì)更低,而LOC100130476 基因表達(dá)下調(diào)可能是ESCC 發(fā)生的機(jī)制之一,推測(cè)其作用機(jī)制與DNA 甲基化有關(guān)[13-15]。通常認(rèn)為在腫瘤形成過程中包含遺傳學(xué)機(jī)制和表觀遺傳學(xué)機(jī)制,這兩種機(jī)制共同影響腫瘤形成,且相互交叉存在。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)常見修飾形式,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用?;騿?dòng)子區(qū)及第一外顯子區(qū)含CpG 島豐富的部位易出現(xiàn)甲基化,甲基化發(fā)生后可改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),影響DNA 構(gòu)象及穩(wěn)定性,導(dǎo)致基因表達(dá)沉默,致抑癌基因表達(dá)下調(diào),促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化,誘發(fā)腫瘤。

    3.3 LncRNA LOC100130476 基因作為抑癌基因參與了ESCC 的發(fā)生發(fā)展

    既往研究證實(shí),結(jié)腸癌中抑癌基因表達(dá)下調(diào),而恢復(fù)其表達(dá)可致腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。一方面,ESCC 中抑癌基因表達(dá)下調(diào)可能是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制;另一方面,抑癌基因可能作為判斷腫瘤患者預(yù)后的重要標(biāo)記。Fan 等[17]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)骨髓異常綜合征患者SOX7 基因啟動(dòng)區(qū)CpG 島的甲基化率(達(dá)58.1%)顯著高于正常對(duì)照組,而該病進(jìn)展至晚期后SOX7 甲基化率也顯著高于早期患者,認(rèn)為SOX7 的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)可能作為此類患者預(yù)后預(yù)測(cè)因子。師雅斌等[6]經(jīng)研究指出ESCC 中LOC100130476 的甲基化可能是該病的特異性標(biāo)志物,采用藥物改變其第一外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)有望成為臨床治療該病的一種可行性策略。鑒于此,我們推測(cè)ESCC 組織中LOC100130476 可能也與患者預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),ESCC 組織中LOC100130476 低表達(dá)組生存率、DFS 和OS 均較高表達(dá)組差(P<0.05),且其表達(dá)水平是影響患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),推測(cè)LncRNA LOC100130476 低表達(dá)可能預(yù)測(cè)ESCC 預(yù)后不良。因此LOC100130476 可能在ESCC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,且可作為預(yù)測(cè)臨床預(yù)后的分子指標(biāo)。

    3.4 LncRNA LOC100130476 基因可能是影響ESCC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

    綜上所述,LncRNA LOC100130476 在ESCC 組織中較癌旁組織顯著下調(diào),表達(dá)下調(diào)可能是ESCC 的發(fā)病機(jī)制之一,提示其可能作為抑癌基因參與了ESCC 的發(fā)生發(fā)展;LncRNA LOC100130476 在ESCC 組織中的表達(dá)水平是影響ESCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究主要存在以下不足:(1)樣本量較少,未就ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 基因甲基化狀態(tài)開展研究,這可能是闡述ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制;(2)ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達(dá)下調(diào)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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