普通小麥4個主要矮稈基因的分子檢測

牟麗明，田秀苓，劉 丹，董亞超，何中虎

(1. 甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,甘肅定西 743000; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所,北京 100081)

株高是影響小麥生產(chǎn)潛力的重要農(nóng)藝性狀，適當(dāng)降低株高能夠增強小麥的抗倒伏能力，有助于提高收獲指數(shù)，促進高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[1]。20世紀60年代，矮稈基因Rht1和Rht2的應(yīng)用，促使了矮稈和半矮稈小麥品種的選育和推廣，極大地促進了全球小麥產(chǎn)量的增長[2-3]。

小麥中正式命名的矮稈基因有25個，但應(yīng)用到育種中的卻很少，其中Rht1、Rht2、Rht8和Rht24應(yīng)用最為廣泛[4-9]。Rht1和Rht2屬于赤霉素遲鈍型基因，來自于Norin10，降低株高15%，增產(chǎn)24%左右[5]。Rht1和Rht2分布廣泛，世界上70%的育成品種中至少含有其中一個矮稈基因[10]。Rht8和Rht24都屬于赤霉素敏感基因，其中Rht8來自于日本品種Akakomugi，降低株高10%，對產(chǎn)量無不利影響[11-14]；Rht24起源較早，在Norin10和Akakomugi中都能檢測到，降低株高6～8 cm，并且在世界小麥品種中分布廣泛，其中在國內(nèi)小麥品種(系)中分布頻率約為84%，國外小麥品種(系)中分布頻率約為67%[5]。

分子標(biāo)記輔助選擇是一種有效的技術(shù)手段，利用分子標(biāo)記對小麥品種(系)進行分子檢測是開展分子育種工作的基礎(chǔ)。矮稈基因Rht1和Rht2已經(jīng)通過同源克隆的方法被克隆，Ellis等[15]開發(fā)具有互補性質(zhì)的STS標(biāo)記，但在實際應(yīng)用中因其特異性不足，并不能夠有效區(qū)分矮稈基因型和高稈基因型；隨著高通量KASP檢測平臺的建立，Rasheed等[16]根據(jù)Rht1和Rht2的基因序列開發(fā)KASP高通量功能標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測育種材料；隨后Tian等[5]也根據(jù)Rht1和Rht2的基因序列開發(fā)了檢測效果更好的CAPS功能標(biāo)記。矮稈基因Rht8近期已被克隆，最初SSR標(biāo)記Xgwm261常被用做檢測Rht8的有效分子標(biāo)記，但該標(biāo)記距離Rht8較遠且檢測出的變異類型較多[17-20]；隨著對Rht8研究的深入，Gasperini等[12]開發(fā)與Rht8共分離的分子標(biāo)記DG273，擴增條帶391 bp代表矮稈類型， 421 bp代表高稈類型。Tian等[21]通過圖位克隆的方法克隆了矮稈基因Rht24并開發(fā)功能標(biāo)記，可利用該CAPS標(biāo)記TaCRY2對Rht24進行檢測。

為更好的了解現(xiàn)有小麥品種和骨干親本中矮稈基因分布，本試驗利用目前發(fā)布的最有效的矮稈基因分子標(biāo)記對312份小麥材料進行檢測，為雜交組合的配制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間種植

共檢測小麥品種(系)312份，包括40份北部冬麥區(qū)材料、229份黃淮麥區(qū)材料和43份國外材料，其中63份材料于2018-2019和2019-2020年度種植于北京，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所東圃場，2 m行長，2行區(qū)，均勻撒播；將149份材料于2018-2019和2019-2020年度種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花所安陽試驗站，2 m行長，2行區(qū)，均勻撒播(附表1)。所有材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 DNA提取

取苗期幼嫩的葉片0.2 g左右放入提前裝有鋼珠的2 mL離心管中，液氮迅速冷凍并用研磨儀(德國RETSCH MM400型)進行磨樣。采用CTAB法提取小麥基因組DNA[22]，利用紫外分光光度計檢測DNA濃度并調(diào)整至50 ng/μL，轉(zhuǎn)移至96孔中保存待用。

1.3 KASP檢測

矮稈基因Rht1和Rht2采用Rasheed等開發(fā)的KASP標(biāo)記進行檢測(表1)。KASP標(biāo)記共3條引物A、B和C，其中C為共用引物，A帶Fam熒光基團，激發(fā)藍光，檢測野生型，B帶Hex熒光基團，激發(fā)紅光，檢測突變類型。KASP反應(yīng)體系為5 μL，主要包括DNA 1 μL(45 ℃烘干)，2.5 μL Master Mix (LGC，北京)，1.444 μL去離子水，0.056 μL混合引物(100 μmol/L的A、B、C工作原液按照A∶B∶C∶ddH2O = 12∶12∶ 30∶46的比例混合)。KASP反應(yīng)程序采用Touchdown程序，起始退火溫度設(shè)定為65 ℃，每個循環(huán)下降0.8 ℃。采用KASP熒光掃描儀(Pherastar，LGC)進行結(jié)果掃描，用Kluster caller軟件進行基因分型。

1.4 PCR檢測

利用各分子標(biāo)記對312份供試材料進行基因型檢測。矮稈基因Rht8采用共分離標(biāo)記DG273進行檢測，Rht24采用CAPS標(biāo)記TaCRY2進行檢測(表1)。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括1.5 μL模板DNA，7.5 μL 2×TaqPCR Mix(天維，北京)，10 μmol/L上下游引物各1 μL，4 μL去離子水。PCR反應(yīng)在BioRad公司(http://www.bio-rad.com)MyCycler PCR儀上完成，其反應(yīng)程序為標(biāo)準(zhǔn)程序，DG273和TaCRY2的退火溫度分別為58 ℃和67 ℃。對TaCRY2標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進行酶切，酶切體系為10 μL，包括5 μL PCR產(chǎn)物，1 μL 10×緩沖液，0.2 μL限制性內(nèi)切酶DpnⅡ(NEB，北京)，3.8 μL去離子水，37 ℃孵育3 h。在20 g/L瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳，200 V電泳45 min，在凝膠成像系統(tǒng)中波長為254 nm的紫外燈下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在小麥成熟期，分別測量安陽試驗點149份材料和北京試驗點63份材料的株高，株高為莖基部到穗頂端的距離(芒除外)。采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。

表1 檢測矮稈基因的分子標(biāo)記序列Table 1 Sequences of molecular markers for detection of dwarfing genes

2 結(jié)果與分析

2.1 4個主要矮稈基因檢測結(jié)果

利用Rht1和Rht2位點的KASP標(biāo)記對供試材料進行檢測，若檢測結(jié)果是藍色(Fam)類型，則材料中含有高稈等位基因；若檢測結(jié)果是紅色(Hex)類型，則材料中含有矮稈等位基因；若檢測是粉色則代表無信號，針對粉色結(jié)果，進行二次檢測(圖1-A和1-B)。檢測結(jié)果顯示：在312份小麥品種(系)中，294份材料都至少含有一個“綠色革命”基因Rht1或Rht2，7份同時含有矮稈基因Rht1和Rht2，18份不含有這2個矮稈基因(表1)。

圖A和B分別為 Rht1和 Rht2位點檢測結(jié)果；黑點代表對照水，紅點代表矮稈等位基因類型，藍點代表高稈等位基因類型，粉色代表無信號；圖C和D分別為 Rht8和 Rht24位點檢測結(jié)果；M代表DL 2 000，泳道1～10分別是‘良星66’‘北京0045’‘中麥415’‘中麥996’‘泛麥8號’‘濟麥20’‘泛育麥17’‘CA14043’‘農(nóng)大212’‘中麥895’

利用與Rht8共分離標(biāo)記DG273對供試材料進行檢測，若擴增片段為421 bp，則表示該品種(系)含有Rht8矮稈等位基因；若擴增片段為391 bp，則表示該品種(系)含有Rht8高稈等位基因(圖1-C)。利用與Rht24緊密連鎖的CAPS標(biāo)記TaCRY2對供試品種(系)進行檢測，含有Rht24矮稈等位基因品種(系)的擴增條帶275 bp會被酶切成233 bp和42 bp兩個條帶；不含有矮稈基因Rht24的品種(系)的擴增條帶275 bp不會被酶切開(圖1-D)。

2.2 4個矮稈基因及其組合分布頻率

在供試的312份品種(系)中，Rht1、Rht2、Rht8和Rht24的分布頻率分別為18.9%、 77.6%、50.0%和91.3%。在國內(nèi)品種(系)中，Rht24的分布頻率(98.1%)最高，Rht2的分布頻率(83.6%)次之；在國外品種(系)中，Rht8的分布頻率(55.8%)高于Rht24(48.8%)、Rht1(39.5%)和Rht2(39.5%)。

大多數(shù)品種(系)中至少含有2個或2個以上的矮稈基因。2個矮稈基因組合分析結(jié)果顯示：Rht2+Rht24的分布頻率(73.4%)最高，隨后依次是Rht8+Rht24(45.5%)、Rht2+Rht8(35.9%)、Rht1+Rht24(15.7%)、Rht1+Rht8(12.2%)和Rht1+Rht2(2.2%)。在3個矮稈基因的組合中，Rht2+Rht8+Rht24分布頻率最高(33.7%)，然而，只有4份材料同時含有4個矮稈基因(表2)。

表2 312份品種(系)中矮稈基因及其組合分布頻率Table 2 Distribution frequency of dwarfing genes and their combinations in 312 varieties

2.3 不同麥區(qū)4個矮稈基因及其組合分布頻率

在本研究選用的國內(nèi)276份冬小麥品種(系)中，北部冬麥區(qū)材料40份，黃淮麥區(qū)229份。Rht1在北部冬麥區(qū)的分布頻率(55.0%)高于黃淮麥區(qū)(8.7%)，Rht2在黃淮麥區(qū)的分布頻率(91.7%)高于北部冬麥區(qū)(37.5%)，Rht8在北部冬麥區(qū)的分布頻率(72.5%)高于黃淮麥區(qū) (45.0%)，值得注意的是，Rht24在2個麥區(qū)的分布頻率都是最高的，其中40份北部冬麥區(qū)的品種(系)含有Rht24的品種(系)有39份；229份黃淮麥區(qū)品種(系)中，含有Rht24的品種(系)有225份。

由于Rht1+Rht2同時存在的頻率很低，因此不再分析該組合類型。在含不同矮稈基因組合中，Rht2+Rht24在黃淮麥區(qū)的分布頻率最高，占90.8%，Rht8+Rht24在北部冬麥區(qū)的分布頻率最高，占70.0%。由于Rht1在北部冬麥區(qū)的分布頻率高，而Rht2在黃淮麥區(qū)的分布頻率高，因此在矮稈基因的組合分布頻率中表現(xiàn)為Rht1+Rht8、Rht1+Rht24和Rht1+Rht8+Rht24在北部冬麥區(qū)的分布頻率高于黃淮麥區(qū)，而Rht2+Rht8、Rht2+Rht24和Rht2+Rht8+Rht24在黃淮麥區(qū)的分布頻率均高于北部冬麥區(qū)(圖2)。

2.4 不同矮稈基因及其組合對株高的影響

通過對供試材料4個主要矮稈基因(Rht1，Rht2，Rht8和Rht24)的檢測，結(jié)合兩年度其株高表型數(shù)據(jù)，對不同基因及組合對株高的效應(yīng)進行了解析。不同矮稈基因和組合的株高在2個試驗點表現(xiàn)出類似的趨勢。在安陽試驗點149份材料中，Rht2的降稈效應(yīng)最強，平均株高84.5 cm，Rht1的平均株高為90.2 cm；在含有2個矮稈基因的材料中，Rht2+Rht24的材料株高最矮，平均株高84.5 cm，Rht1+Rht24的材料株高最高，平均株高91.8 cm；含有3個基因時，Rht2+Rht8+Rht24材料的平均株高矮于Rht1+Rht8+Rht24的材料，這也反映出Rht2的降稈效應(yīng)強于Rht1。在北京試驗點的63份材料中，在含有一個矮稈基因的材料中，Rht2的株高最低，為75.4 cm，Rht8的株高最高，為78.7 cm；在含有兩個矮稈基因的材料中，Rht2+Rht24組合類型株高最矮，為75.4 cm，Rht1+Rht8組合類型株高最高，為78.5 cm；在含有3個矮稈基因的材料中，Rht2+Rht8+Rht24組合類型的株高為 76.2 cm，低于Rht1+Rht8+Rht24組合類型，與安陽試驗點材料表現(xiàn)一致(表3)。

NCPWWR=Northern China Plain Winter Wheat Region; YHRVFWWR=Yellow & Huaihe River Valley Facultative Winter Wheat Region

表3 各基因型材料平均株高Table 3 Plant height under dwarf genes and their combinations cm

3 討 論

312份材料分子檢測結(jié)果分析表明，Rht24的分布頻率最高，廣泛存在于國內(nèi)外小麥品種中，其次分別為Rht2、Rht8和Rht1。前人研究對黃淮麥區(qū)129份小麥材料進行分子標(biāo)記檢測，發(fā)現(xiàn)含Rht8的材料最多(89份)，含Rht2的材料73份，含Rht1的材料37份。這與本研究結(jié)果略有不同，可能與供試材料的遺傳背景及分布區(qū)域有關(guān)[23]。在中國，來自不同麥區(qū)的冬小麥品種(系)矮稈基因的分布頻率不同，主要體現(xiàn)在Rht1、Rht2和Rht8上，此外，Rht1在北部冬麥區(qū)的分布頻率高，而Rht2在黃淮麥區(qū)的分布頻率高，這種現(xiàn)象可能與不同麥區(qū)最初所用的矮源有關(guān)。

在分析這4個矮稈基因的效應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，單獨含有某一矮稈基因的材料較少，很難對其進行單獨分析，各矮稈基因大多以組合的形式存在，這一方面是由于不同品種(系)所含矮稈基因類型和數(shù)目不同所造成的，另一方面可能與同一麥區(qū)矮稈背景相似有關(guān)[10]。同時，發(fā)現(xiàn)矮稈基因的降稈效應(yīng)存在疊加特性，育種利用時需注意選配矮稈基因組合。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)矮稈基因Rht2無論是單獨存在，還是與其他基因互作，其降稈效應(yīng)都稍強于其他幾個矮稈基因，這4個矮稈基因的降稈效應(yīng)由強到弱依次為Rht2>Rht24>Rht8>Rht1,在前人研究中，Rht1和Rht2的降稈效應(yīng)相差不大[24]，這可能與供試材料的遺傳背景相關(guān)，Rht8的降稈效應(yīng)與前人研究相似[25]。另外，含有矮稈基因越多的材料其株高不一定最矮，譬如Rht1+Rht8+Rht24基因型材料的平均株高為84.1 cm，均高于這3個基因單獨存在時的株高，一方面可能與材料有關(guān)，另一方面可能由于矮稈基因間產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致株高發(fā)生變化。

分子標(biāo)記開發(fā)是分子標(biāo)記輔助選擇育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。隨著標(biāo)記開發(fā)技術(shù)的不斷發(fā)展，標(biāo)記類型也不斷更新，由最初的STS和SSR標(biāo)記逐漸發(fā)展為通量高、價格低的KASP標(biāo)記。檢測Rht1和Rht2的標(biāo)記，有最初的STS基因特異標(biāo)記，也有后來開發(fā)的KASP和CAPS基因功能標(biāo)記。針對同一基因開發(fā)不同類型的多個標(biāo)記不僅為大家的檢測提供了多種選擇也可以使標(biāo)記間得到相互驗證。