口鼻部鱗狀細胞癌與癌旁組織拉曼光譜的差異研究

姚欣妤 鮑泳揚 楊揚 胡恩萍 王珮華

頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤，每年全球新增確診患者超過80 萬人，新增死亡人數(shù)超過40 萬，是第六大常見惡性腫瘤[1]。大多數(shù)被診斷的患者沒有惡性前病變的表現(xiàn)，目前還沒有任何篩查策略，臨床醫(yī)生的體格檢查仍然是早期發(fā)現(xiàn)病變的主要方法[2]。頭頸部鱗癌的原發(fā)灶診斷主要依賴腫塊活檢，病理診斷是該疾病診斷的金標準?；诮M織形態(tài)學的病理診斷主要依靠病理醫(yī)生的經(jīng)驗，術(shù)中切除范圍由手術(shù)醫(yī)生決定，如切緣腫瘤陽性會造成手術(shù)時間的延長。除此之外，在癌癥的治療中，準確的診斷和徹底的原發(fā)灶切除可以降低癌癥死亡率，延長患者生存時間。因此，探索一種客觀準確且快速的術(shù)中診斷方法或是更精準的篩查手段是研究者值得努力的方向，本次實驗對其進行探索。

拉曼光譜基于光子與目標材料的相互作用，運用非彈性散射探測與樣品中化學鍵相關(guān)的分子振動，以獲得有關(guān)分子結(jié)構(gòu)、組成和分子間相互作用的信息，產(chǎn)生樣品的高度詳細的生化“指紋”，具有高度特異性[3]。隨著相關(guān)技術(shù)及光學儀器的發(fā)展，拉曼光譜在醫(yī)學領(lǐng)域中的研究也取得了較大進展。許多實驗研究已經(jīng)證明了拉曼光譜在評估卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和皮膚癌等方面的能力[4-8]。本文對6 例口鼻部鱗癌患者的腫瘤細胞與癌旁組織細胞的拉曼光譜信息進行采集和比對，通過比較光譜的差異探索拉曼光譜在口鼻部鱗癌診斷過程中的價值。

資料與方法

1 臨床樣本

6 例就診于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔科及耳鼻喉科的口鼻部鱗癌患者，收集手術(shù)中新鮮切除的腫瘤組織，包括鼻背部1 例，上唇4例，舌1 例，涉及各種分化程度，低、中、高分化各2例。使用冷凍切片機（型號：LEICA CM 1950）將每個組織樣品進行連續(xù)的切片，切片厚度4μm，篩選包含腫瘤及癌旁組織的連續(xù)切片，每例樣本各選取兩張。其中一張切片用于蘇木精-伊紅染色（HE 染色）及細胞定位，即常規(guī)病理診斷的HE 切片，另一張切片不做染色直接用于拉曼光譜測量。由于石蠟切片在制作過程中會出現(xiàn)脂質(zhì)丟失的現(xiàn)象，為保留切片上的物質(zhì)信息，拉曼測量時采取未經(jīng)石蠟包埋的冷凍切片。本實驗樣本為常規(guī)病理診斷中產(chǎn)生的剩余廢棄切片，樣本已去標識化使不具個體識別性且無法溯源，征得豁免“受試者的知情同意”，本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（SH9H-2020-T74-1）。

2 測量儀器

本研究使用基于正置顯微鏡的XploRA PLUS共焦顯微拉曼系統(tǒng)（HORIBA Scientific, Japan）進行拉曼光譜的檢測。光譜分辨率為1cm-1，激發(fā)光源為532nm 半導體激光器，激光光斑直徑約為1μm。

3 測量方法

切片的連續(xù)性使未染色的冷凍切片與HE 染色片圖像上可對應(yīng)，依據(jù)癌巢形態(tài)的圖像特征（如癌巢輪廓及細胞分布形態(tài)等）使得HE 切片的圖像可用于癌巢及癌旁組織定位從而在顯微鏡下選擇冷凍切片的分析區(qū)域。然后，在冷凍切片上對應(yīng)區(qū)域內(nèi)的5 個或以上隨機位置，獲取癌及癌旁組織的拉曼光譜（圖1）。選擇拉曼光譜測量參數(shù)，激發(fā)功率大約為12.4mW，光譜的測量范圍為300~3500cm-1，數(shù)據(jù)采集積分時間10s，連續(xù)采集3 次，迭代降噪處理后獲得拉曼光譜。

圖1 HE 及冷凍組織切片的明場照片A：HE 染色的切片，經(jīng)NDP.view 2.6.13（Hamamatsu Photonics, Japan）組織切片軟件采集；B：無染色的相鄰切片，經(jīng)共焦顯微拉曼系統(tǒng)上的LabSpace6.0（HORIBA Scientific, Japan）軟件采集。

4 數(shù)據(jù)處理

使用LabSpace 6.0（HORIBA Scientific, Japan）進行包含光譜數(shù)據(jù)的平滑、基線校正、歸一化等預處理，以獲得切片上較真實的拉曼信號。使用Origin 2018b 軟件（OriginLab, USA）進行拉曼光譜的均值計算和主成分分析等統(tǒng)計學分析。

結(jié)果

在6 例口鼻部鱗狀細胞癌的組織切片上采集到34 條癌組織和36 條癌旁組織的拉曼光譜（圖2）。我們對這兩組光譜進行了統(tǒng)計學分析。

圖2 切片的拉曼平均譜A：口鼻部鱗狀細胞癌組織；B：口鼻部鱗狀細胞癌旁組織。陰影部分的上緣和下緣分別為拉曼位移波數(shù)（raman shift）對應(yīng)的拉曼信號最大值和最小值。

兩組織拉曼光譜的平均峰在形態(tài)上較近似，我們運用主成分分析法（PCA）對兩組光譜進行了分析。利用前兩個主要成份，即主成分1（PC1）和主成分2（PC2），作二維散點圖（圖3）。結(jié)果表明，主成分PC1（89.7%）可以有效地區(qū)分口鼻部鱗狀細胞癌和癌旁組織的拉曼光譜。

圖3 口鼻部鱗狀細胞癌及癌旁組織拉曼光譜經(jīng)PCA分析后的散點圖紅色標記癌旁組織，黑色標記癌組織，橢圓為95%置信區(qū)間

我們從PC1 中提取了5 個特征峰，它們累計貢獻了98.11%的差異特征（表1）。根據(jù)之前的研究[9，10]，我們進行了譜峰歸屬的標注。

表1 特征峰的拉曼光譜歸屬

特征峰的拉曼光譜歸屬表明，口鼻部鱗狀細胞癌及癌旁組織的核酸，蛋白質(zhì)及脂類物質(zhì)均有差異。以差異的貢獻程度看，脂類的差異比較明顯。

討論

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）起源于口腔、咽、喉和鼻竇等部位的上皮，侵襲性強，復發(fā)轉(zhuǎn)移率高，臨床預后預測較差。在細胞組織學上，上皮在經(jīng)過一系列有序的步驟后逐漸進展為侵襲性頭頸部鱗狀細胞癌，從上皮細胞增生開始，接著是不典型增生（輕度、中度和重度）、原位癌、最終是侵襲性癌。盡管有證據(jù)表明從細胞異型性到不同程度的異常增生，最終導致侵襲性頭頸部鱗狀細胞癌有一定的過程，但大多數(shù)患者就診時已經(jīng)為浸潤性癌，沒有明顯的惡性前體征。因此本次實驗我們對發(fā)生在口鼻部黏膜的鱗癌樣本進行癌巢及癌旁腫瘤未侵及的組織進行了拉曼光譜測量，通過光譜學改變的分析發(fā)現(xiàn)它們之間的差異。

拉曼效應(yīng)最早由拉曼教授發(fā)現(xiàn)，因此于1930年獲得諾貝爾獎[3]。它是一種無損、無試劑的振動光譜技術(shù)，提供了體內(nèi)或體外組織的快速分子表征檢測，可用于活檢、切緣判斷、治療評估或?qū)嶒炐枰８鶕?jù)每個樣品具有的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)攜帶的活性官能團的特征性光譜，對樣本組織類型進行評估、表征和區(qū)分。拉曼光譜可以從腫瘤組織的分子基礎(chǔ)出發(fā)，為診斷和治療過程提供客觀、可量化的光譜信息，以達到早期、快速和準確的診斷使患者受益匪淺。

以細胞株為實驗對象的拉曼光譜研究表明，相對正常人體口腔黏膜細胞而言，人舌鱗癌細胞的拉曼光譜存在差異，提示該類細胞有比較明顯的增殖活性[11，12]。我們本次研究采用臨床樣本進行研究，以自身未受腫瘤影響的癌旁組織為對照，經(jīng)過主成分分析及譜峰歸屬的標注，發(fā)現(xiàn)口鼻部鱗狀細胞癌及癌旁組織的脂、蛋白及核酸在光譜信息上均有差異，包括2927cm-1的（脂）芳香族內(nèi)C-H 伸展、2877cm-1的（脂）-CH3對稱伸縮、1654cm-1的（蛋白）I 型酰胺基團、1450cm-1（蛋白）生物分子中的亞甲基形變、1319cm-1（核酸）鳥嘌呤。此次實驗取樣方式及樣本制備方法與病理科診斷時樣本制備方法一致，依據(jù)常規(guī)耳鼻喉及口腔科手術(shù)術(shù)式，均按照臨床診療指南進行，為進一步的臨床運用研究提供思路。拉曼光譜以組織切片的形式使光斑可對應(yīng)到單個細胞，精確度更高，產(chǎn)生與細胞一一對應(yīng)的光譜對于后期術(shù)區(qū)切緣的把握更有意義，且病理切片是目前的診斷金標準，但其結(jié)果判讀具有個人經(jīng)驗性，會產(chǎn)生誤差，光譜可將組織中的信息以化學鍵產(chǎn)生的光譜如實記錄下來，實現(xiàn)細胞指紋圖譜的價值。隨著研究的進一步深入，這些光譜差異所提示的癌組織物質(zhì)變化，可能會為口鼻部鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展的機制研究提供線索。