同位素異位體溯源土壤N2O的方法、技術(shù)和展望①

徐 錦，曹亞澄,2*，溫 騰,3,4,5*，張珮儀，張金波,3,4,5，蔡祖聰,3,4,5

同位素異位體溯源土壤N2O的方法、技術(shù)和展望①

徐 錦1，曹亞澄1,2*，溫 騰1,3,4,5*，張珮儀1，張金波1,3,4,5，蔡祖聰1,3,4,5

(1 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 210023；2 中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；3 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023；4 虛擬地理環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京師范大學(xué))，南京 210023；5 江蘇省地理環(huán)境演化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育建設(shè)點(diǎn)，南京 210023)

土壤是N2O的重要排放來源之一。土壤中N2O產(chǎn)生途徑眾多、受多種因素調(diào)控，深入分析土壤N2O產(chǎn)生途徑才能采取針對(duì)性的減排策略。穩(wěn)定同位素技術(shù)已廣泛用于研究土壤N2O排放，N2O同位素異位體法是近年來新興的研究方法。該研究方法通過測(cè)定土壤N2O的同位素組成(15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O)分析N2O排放貢獻(xiàn)，因無需添加標(biāo)記物、對(duì)土壤系統(tǒng)干擾小、成本低，適合在野外田間研究N2O排放，是15N標(biāo)記方法的有力補(bǔ)充。本文詳細(xì)介紹了N2O同位素異位體法的原理、質(zhì)譜測(cè)定方法、定量分析方法、影響該方法的因素及其應(yīng)用前景。

N2O同位素異位體；位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)值；N2O排放貢獻(xiàn)；同位素比值質(zhì)譜

鑒于對(duì)全球氣候變化的關(guān)注日益增加，促進(jìn)溫室氣體減排已成為熱點(diǎn)研究問題。氧化亞氮(N2O)作為《京都協(xié)定書》規(guī)定的6種溫室氣體之一，不但會(huì)進(jìn)入平流層破壞臭氧層[1]，還會(huì)吸收紅外線造成溫室效應(yīng)[2]，等摩爾濃度N2O的增溫潛勢(shì)是二氧化碳的298倍[3]，且以每年0.73 nmol/mol的速率增加[4]。N2O在大氣中的存在壽命約為118 ～ 131 a[5]，對(duì)全球增溫具有長期潛在深遠(yuǎn)的影響。據(jù)報(bào)道，目前全球的總N2O排放量為17.9 Tg/a，在眾多N2O排放源中，農(nóng)業(yè)管理以及自然植被下的土壤構(gòu)成了全球最主要的N2O來源，其中自然植被土壤N2O 排放量為6 ～ 7 Tg/a，占自然來源的60%，農(nóng)田土壤N2O排放量為4.3 ～ 5.8 Tg/a，占人為來源的69%[5]。因此，準(zhǔn)確估算土壤N2O排放量對(duì)于實(shí)現(xiàn)全球范圍內(nèi)N2O的減排具有重要意義。但是土壤N2O排放受多種微生物和非微生物途徑的影響，時(shí)空異質(zhì)性顯著，土壤氮轉(zhuǎn)化過程極其復(fù)雜并具有多種N2O產(chǎn)生途徑[6]，只有深入溯源分析土壤N2O產(chǎn)生途徑才能采取針對(duì)性的減排策略，減少大尺度N2O排放量估算的不確定性[7]。

N2O的主要產(chǎn)生過程有反硝化、羥胺氧化、硝化細(xì)菌反硝化等[7]。反硝化過程是在無氧或者微氧的條件下，微生物將NO3–、NO2–或者N2O還原為、NO2–、NO、N2O或N2，N2O是反硝化過程的中間產(chǎn)物，在某些條件下是主要最終產(chǎn)物(如：真菌反硝化過程)[8]。羥胺氧化過程中N2O是不同形態(tài)氮氧化形成NO3–的副產(chǎn)物，包括自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)硝化，其中自養(yǎng)硝化主要由氨氧化細(xì)菌、亞硝態(tài)氮氧化細(xì)菌驅(qū)動(dòng)[9]，將NH4+或NH3經(jīng)過NO2–氧化為NO3–的過程；異養(yǎng)硝化主要是由一些具有異養(yǎng)硝化能力的真菌和細(xì)菌，將有機(jī)氮或者NH4+氧化為NO3–的過程。硝化細(xì)菌反硝化也是由氨氧化細(xì)菌驅(qū)動(dòng)，但有別于自養(yǎng)硝化，是NH4+氧化產(chǎn)生的NO2–進(jìn)一步還原為N2O和N2[7]。此外，硝酸鹽異化還原為銨過程(DNRA)、化學(xué)反硝化過程也產(chǎn)生N2O[10]，但一般認(rèn)為這些過程對(duì)于全球N2O排放的貢獻(xiàn)較小[6]。

迄今為止，不少科學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于土壤N2O產(chǎn)生途徑的區(qū)分和溯源研究中，主要包括15N通量法[11]、抑制劑法以及穩(wěn)定同位素法。其中通量法和抑制劑法最早用于區(qū)分N2O產(chǎn)生來源，但通量法無法明確N2O產(chǎn)生的過程[2]，抑制劑法常常因?yàn)槲⑸锼幧L階段不同而無法完全抑制。近年來穩(wěn)定同位素技術(shù)發(fā)展迅速，同位素標(biāo)記技術(shù)(15N標(biāo)記)和自然豐度技術(shù)(18ON2O、15ObulkN2O)開始被廣泛用于區(qū)分土壤N2O產(chǎn)生途徑[12-14]。15N標(biāo)記與數(shù)值模型的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)于土壤N2O產(chǎn)生途徑的量化研究，它能同時(shí)結(jié)合土壤氮轉(zhuǎn)化過程初級(jí)轉(zhuǎn)化速率和含氮?dú)怏w排放的計(jì)量變化，全面研究土壤氮轉(zhuǎn)化和N2O產(chǎn)生途徑。近期開發(fā)的土壤–植物15N示蹤模型，更能為量化土壤–植物系統(tǒng)的氮轉(zhuǎn)化過程和氮轉(zhuǎn)化率問題提供可靠方法。與同位素標(biāo)記技術(shù)相比，自然豐度技術(shù)也早已用于土壤氮素轉(zhuǎn)化過程的研究[15]，但在復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中應(yīng)用15N自然豐度法，易受到氮在庫與庫之間轉(zhuǎn)化過程中的同位素分餾作用的限制，其定量程度處于較低水平[2]。近年來，一種通過測(cè)定N2O同位素異位體及兩個(gè)N原子間15N位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)值(SP: site preference,15OSPN2O)的新方法[16]，已被廣泛應(yīng)用于土壤、海洋的N2O溯源分析。與15N標(biāo)記法和抑制劑法相比，它對(duì)原有系統(tǒng)的干擾小，更適合用于野外大尺度研究；與傳統(tǒng)自然豐度技術(shù)相比，它在N2O產(chǎn)生過程中不受底物的同位素組成影響。而且不同的N2O產(chǎn)生過程，15OSPN2O具有一定的差異性[16-17]；15OSPN2O與18ON2O、15ObulkN2O值結(jié)合，還能為N2O產(chǎn)生途徑的溯源分析提供更多信息，在適合的同位素?cái)?shù)值模型輔助下，可實(shí)現(xiàn)大田和區(qū)域尺度上量化土壤N2O各產(chǎn)生途徑的排放貢獻(xiàn)。

1 N2O的同位素異位體和位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)值

國際純粹應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(The International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)于2011年將一組被重同位素取代的數(shù)量不同或者被重同位素取代的位置不同的分子，定義為同位素異位體(isotopocule)，它是“isotopically substituted molecules”的縮寫。因?yàn)槊糠N元素往往有不止一種穩(wěn)定同位素，所以一種化合物通常具有多種不同的同位素異位體[18]。N2O分子是一個(gè)由一個(gè)O原子和兩個(gè)N原子形成的三原子非對(duì)稱直線型結(jié)構(gòu)，其中N元素有14N、15N兩種穩(wěn)定同位素；O元素有16O、17O、18O三種穩(wěn)定同位素，理論上，N2O分子有12種同位素，但實(shí)際上自然豐度表現(xiàn)出明顯差異的同位素異位體僅5種[19]。

由于N2O是一個(gè)不對(duì)稱分子，位于中心和末端的N原子被稱為α-N和β-N[18]或者1-N和2-N[20]，也有用456和546來表示N2O的兩個(gè)重要的同位素異位體14N15N16O和15N14N16O[21]。在N2O形成過程中，兩個(gè)NO–會(huì)結(jié)合形成次硝酸鹽狀中間體(–O–N=N–O–)[17]，隨后一側(cè)的N–O鍵斷裂形成N2O分子，斷鍵側(cè)的N原子位于β位，未斷鍵側(cè)的N原子位于α位；而在N2O還原為N2的過程中另一側(cè)的N–O鍵也斷裂形成N2。由于較重的同位素原子移動(dòng)性較弱具有較高的結(jié)合能(如15N–16O鍵相較于14N–16O鍵結(jié)合能更高，所以14N–16O鍵更易斷裂)，且土壤微生物和酶對(duì)于N–O鍵的斷裂也有影響，所以在N2O的產(chǎn)生和還原過程中兩次斷鍵的差異，可能會(huì)導(dǎo)致15N在兩個(gè)N原子上的分布差異[22]，這個(gè)差異就稱為位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)值。在N2O分子中15Nα、15Nβ、15Nbulk和15OSPN2O值之間的換算關(guān)系如下[18]：

式中：15Nbulk表示兩個(gè)N原子上的15N豐度的平均值；15Nα和15Nβ分別表示中心和末端N原子上的15N豐度。

在生成N2O的過程中，由于各個(gè)途徑受到不同微生物和酶調(diào)控的影響，產(chǎn)生的15OSPN2O值也會(huì)存在差異，這些差異可為溯源分析土壤N2O產(chǎn)生途徑提供理論基礎(chǔ)。

2 同位素異位體方法溯源N2O產(chǎn)生途徑的基本原理

穩(wěn)定同位素方法進(jìn)行溯源研究的主要依據(jù)是，任何一種元素的同位素組成都可以提供來源和形成過程信息。有關(guān)來源的信息往往依賴于元素本身獨(dú)特的同位素組成，所以在傳遞過程中具有特征性，而包含形成過程的信息往往受同位素分餾作用的影響在傳遞過程中容易丟失而喪失過程特征性[22]。但是，體現(xiàn)N2O分子中15N在兩個(gè)N原子上分布差異的15OSPN2O不受基質(zhì)同位素組成的影響，且在N2O產(chǎn)生過程中15OSPN2O可以保持不變，這一特點(diǎn)使得15OSPN2O成為溯源N2O產(chǎn)生途徑的一個(gè)重要指標(biāo)[23]。

Sutka等[24]率先通過純培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自養(yǎng)硝化過程和細(xì)菌反硝化過程產(chǎn)生N2O的15OSPN2O存在特征性且差異明顯，這一發(fā)現(xiàn)在野外和土壤培養(yǎng)試驗(yàn)中多次被證實(shí)。之后，又發(fā)現(xiàn)真菌反硝化和細(xì)菌反硝化的15OSPN2O也存在明顯差異[25]。表1是目前基于純培養(yǎng)試驗(yàn)得到的不同產(chǎn)生途徑N2O的15NbulkN2O、18ON2O和15OSPN2O值，可以發(fā)現(xiàn)不同N2O產(chǎn)生途徑的15OSPN2O值大致可以分為兩大類：第一類是硝化細(xì)菌反硝化和反硝化途徑(簡稱N2OD)，數(shù)值較小，一般在–5.4‰ ～ 2.2‰；第二類是自養(yǎng)硝化、真菌反硝化、化學(xué)反硝化和AOA等途徑(簡稱N2ON)，數(shù)值較大，一般在28.8‰ ～ 36.8‰[16]。15OSPN2O值的這種差異與N2O產(chǎn)生過程的酶調(diào)控機(jī)制有關(guān)。以NH2OH氧化還原酶(HAO)和NO還原酶(NOR)為例，二者都包含血紅素或非血紅素鐵(Fe)原子的催化中心。HAO酶具有一個(gè)中心Fe原子[36]，在N2O形成過程中NH2OH分子順序與同一個(gè)Fe原子中心結(jié)合，最終產(chǎn)物N2O中的中心(α)和末端(β)N原子分別來自第二個(gè)和第一個(gè)結(jié)合的NH2OH分子，因同位素分餾效應(yīng)，第二個(gè)結(jié)合的NH2OH分子中15N較第一個(gè)結(jié)合的NH2OH分子富集，因此該過程產(chǎn)生N2O的15OSPN2O值較大。然而細(xì)菌NOR酶具有兩個(gè)Fe原子(雙核中心)且酶之間具有相似性[37]，兩個(gè)NO分子可同時(shí)與之結(jié)合形成次硝酸鹽狀中間體(–O–N=N–O–)，因產(chǎn)生N2O分子的兩個(gè)N原子幾乎同時(shí)形成，15OSPN2O值接近于零。真菌NOR酶(P405)的催化中心僅具有單個(gè)Fe原子[37]，兩個(gè)NO分子只能順序與催化中心結(jié)合，因此存在與HAO酶類似的現(xiàn)象，N2O的兩個(gè)N原子上的15N差異明顯，15OSPN2O值較大[17]。

表1 不同N2O產(chǎn)生途徑的δ15NbulkN2O、δ18ON2O和δ15OSPN2O值

注：異養(yǎng)硝化的數(shù)值來源為本課題組純培養(yǎng)試驗(yàn)未發(fā)表數(shù)據(jù)。

3 N2O同位素異位體的δ15NSPN2O、δ18ON2O和δ15NbulkN2O值的質(zhì)譜測(cè)定方法

N2O同位素異位體的測(cè)定方法早在1974年就有研究涉及，隨后Yoshida[6]首次全面描述了質(zhì)譜測(cè)定N2O同位素異位體的方法。質(zhì)譜分析法是運(yùn)用質(zhì)譜儀器分析某種元素穩(wěn)定同位素比值特征的方法，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境和生態(tài)等領(lǐng)域的研究中。質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子接收器、真空系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)組成。樣品氣體在離子源中被燈絲發(fā)射的慢電子轟擊后，電離形成具有一定能量的離子束，在加速電壓作用下，帶電離子(帶電的原子、分子或分子碎片)以一定速度進(jìn)入質(zhì)量分析器的磁場(chǎng)，根據(jù)洛倫茲定律，在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的共同作用下，帶電離子因質(zhì)量數(shù)和所帶電荷數(shù)之比()不同而分離，被對(duì)應(yīng)法拉第杯接收后，根據(jù)檢測(cè)到的離子類型和束流強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品氣體某種元素的同位素比值及其組成的測(cè)定。

N2O同位素異位體的測(cè)定，可通過在質(zhì)譜儀上配備能同時(shí)接收為44的[14N14N16O]+，為45的 [14N15N16O]+、[15N14N16O]+、[14N14N17O]+和為46 的[14N14N18O]+等分子離子，以及為30的 [14N16O]+和為31的[14N17O]+、[15N16O]+等碎片離子的接收杯(圖1)，實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣在NO和N2O兩種模式得到15N、18O和31NO的值，再經(jīng)一系列換算，計(jì)算得到15Nα、15Nβ和15OSPN2O[17-18]。

圖 1 五杯模式的穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀示意圖

3.1 質(zhì)譜離子源工作條件優(yōu)化

N2O氣體在離子源中，經(jīng)慢電子轟擊后，主要形成[N2O]+分子離子和少量以NO+為主的碎片離子。由于這兩類離子所需的最優(yōu)離子源條件可能不同，NO+的產(chǎn)率不高([NO]+/[N2O]+=1/3)，為保證測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和精密度，需優(yōu)化離子源條件，來適當(dāng)提高NO+的產(chǎn)率，保證測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和精密度。改變質(zhì)譜儀器的聚焦參數(shù)、離子源的電子能量和電離室內(nèi)的氣壓強(qiáng)等可以調(diào)整離子源的工作條件。質(zhì)譜儀器的聚焦參數(shù)可通過儀器的自動(dòng)聚焦(autofocus)功能實(shí)現(xiàn)，也可手動(dòng)調(diào)節(jié)離子源的emission、trap等參數(shù)。電子能量變化對(duì)[N2O]+分子離子和NO+碎片離子的產(chǎn)率均有顯著影響(表2)，而且不同質(zhì)譜儀器上電子能量的高低對(duì)N2O氣體的離子譜影響并不一致：Toyoda和Yoshida[18]發(fā)現(xiàn)MAT-252質(zhì)譜儀上，測(cè)定NO+離子的最優(yōu)電子能量為70 ～ 86 eV，而本課題組使用的是Delta V Plus質(zhì)譜儀，當(dāng)電子能量低于100 eV會(huì)導(dǎo)致NO+的產(chǎn)率過低(表2)，造成測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確(表3)。

3.2 重排因子測(cè)定

N2O在離子源中會(huì)發(fā)生重排，所形成的[NO]+離子的N原子主要來自α-N，部分來自β-N[18]，引起這種重排效應(yīng)的原因目前尚不明確，推測(cè)與N2O+受電子轟擊后形成NO+的途徑有關(guān)。準(zhǔn)確測(cè)定N2O的同位素異位體，需要確定重排因子，它通常不受樣品濃度和豐度影響，取決于所使用的質(zhì)譜儀器和離子源條件，同一臺(tái)質(zhì)譜儀器在離子源條件發(fā)生變化后(如：更換燈絲)需要重新測(cè)定重排因子。Toyoda和Yoshida[18]、Westley等[38]發(fā)現(xiàn)在MAT-252、253質(zhì)譜儀上重排因子大約為0.07 ～ 0.09，即[NO]+離子中有7% ～ 9% 是來自β-N；而Sutka等[24,26]發(fā)現(xiàn)IsoPrime質(zhì)譜儀的重排因子可達(dá)19.5%。

表2 電子能量變化對(duì)離子流強(qiáng)度的影響

注：信號(hào)衰減率均以124 eV的離子流強(qiáng)度為基準(zhǔn)計(jì)算。

表3 電子能量變化對(duì)N2O同位素異位體測(cè)定值的影響

質(zhì)譜儀器重排因子的測(cè)定一般可通過NH4NO3熱解法和標(biāo)記氣體混合法實(shí)現(xiàn)[18]。NH4NO3熱解法是將不同豐度的NH415NO3和15NH4NO3加熱分解生成不同豐度的N2O氣體，由于分解形成的N2O中α-N都來自NO3-N，β-N都來自NH4-N，因此可制得一系列已知豐度的15NNO和N15NO氣體。將這些氣體在質(zhì)譜儀上的測(cè)定值與其理論值繪制成一條直線，直線的斜率即為重排因子。標(biāo)記氣體混合法是通過購買市售的高豐度高純15NNO和N15NO氣體(>99 atom%)，將其與自然豐度的工作標(biāo)準(zhǔn)N-2O氣體(0.3663 atom%)混合，即可制得一系列已知豐度的15NNO和N15NO氣體，再將測(cè)定得到31R值與45R值繪制成一條直線，斜率即為重排因子。這兩種方法中，NH4NO3熱解法得到的重排因子更為準(zhǔn)確，但操作非常繁瑣，需使用特制的熱解裝置，而標(biāo)準(zhǔn)氣體混合法操作相對(duì)簡單，目前大部分研究人員仍然選擇使用標(biāo)準(zhǔn)氣體混合法測(cè)定重排因子[39–41]。本課題組使用的Delta V Plus質(zhì)譜儀，通過標(biāo)記氣體混合法測(cè)定的重排因子為0.085，這一結(jié)果與Toyoda和Yoshida[18]、Well等[40]、 Mohn等[42]報(bào)道過的結(jié)果(0.08 ～ 0.09)一致。

3.3 N2O工作標(biāo)準(zhǔn)氣體的校準(zhǔn)

由于長期缺乏N2O國際標(biāo)準(zhǔn)氣體，如何在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)準(zhǔn)確校準(zhǔn)N2O工作標(biāo)準(zhǔn)氣體，一直是困擾研究人員的難題。雖然NH4NO3熱解生成的已知豐度的N2O氣體能夠?qū)崿F(xiàn)工作標(biāo)準(zhǔn)氣體的校準(zhǔn)，但這一方法操作較繁瑣，還需要特殊的熱解裝置，很難在每個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)單獨(dú)實(shí)現(xiàn)。在國外學(xué)者的努力下，美國地質(zhì)勘探局2016年開始提供USGS51和USGS52兩種國際標(biāo)準(zhǔn)品(表4)，研究者可直接購買標(biāo)準(zhǔn)品完成工作標(biāo)準(zhǔn)氣體的校準(zhǔn)。需要注意的是，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)USGS51和USGS52的比對(duì)測(cè)定結(jié)果顯示，15OSPN2O值的測(cè)定誤差較大，因此在日常測(cè)定工作中應(yīng)采用兩點(diǎn)校正，減少測(cè)定誤差[42]?？梢灾苯邮褂肬SGS51和USGS52進(jìn)行兩點(diǎn)校正，也可以使用能覆蓋樣品15OSPN2O值范圍的實(shí)驗(yàn)室自制標(biāo)準(zhǔn)氣體進(jìn)行兩點(diǎn)校正。

表4 N2O國際標(biāo)準(zhǔn)品USGS51和USGS52(‰)

注：表中數(shù)據(jù)來源于https://isotopes.usgs.gov/lab/referencematerials.htm。

3.4 其他測(cè)定問題

N2O同位素異位體的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)質(zhì)譜儀器的穩(wěn)定性要求較高。在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，極少量溶于水的CO2會(huì)生成[CO]+，干擾[NO]+的準(zhǔn)確測(cè)定，因此需經(jīng)常更換微量預(yù)濃縮裝置中的除水和CO2的化學(xué)阱，也可將化學(xué)阱分成除水、除CO2兩部分，分別單獨(dú)更換，既節(jié)約試劑又提高效率。樣品氣體中如果雜質(zhì)太多，會(huì)在色譜柱中逐漸累積，干擾測(cè)定結(jié)果，加大烘烤色譜柱的頻率，或在樣品測(cè)定完成后反吹色譜柱，有助于去除雜質(zhì)。對(duì)于和N2O信號(hào)過于靠近的雜質(zhì)峰，可通過降低流速和色譜柱溫度，實(shí)現(xiàn)有效分離。使用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定N2O同位素異位體時(shí)，N2O樣品的信號(hào)高低，直接影響NO+碎片離子的產(chǎn)率，非線性問題會(huì)顯著影響測(cè)定結(jié)果，常規(guī)的線性測(cè)試是通過一系列不同信號(hào)的矩形信號(hào)峰完成，而樣品峰是瞬時(shí)信號(hào)，要準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品峰的線性校正，需要用同樣峰形的標(biāo)準(zhǔn)氣體，可通過在每一天運(yùn)行樣品N2O的前后，分別運(yùn)行一組接近樣品最高和最低濃度的N2O標(biāo)準(zhǔn)氣體，標(biāo)準(zhǔn)氣體盡量使用與樣品同一體積的樣品瓶，完成線性校正。

4.1 同位素指標(biāo)的選擇

4.2 二源同位素混合模型

N2O的同位素組成指標(biāo)結(jié)合同位素混合模型，可分析不同來源途徑N2O的排放貢獻(xiàn)。線性同位素混合模型，尤其是二源線性同位素混合模型(two- endmember isotope mixing model)是最常用的方法，它可用線性方程= a+ b表示，其中=15NSPN2O，=18ON2O。在二源同位素混合模型中，兩個(gè)途徑對(duì)N2O的排放貢獻(xiàn)可通過同位素混合方程sample途徑1×途徑1途徑2×途徑2計(jì)算，途徑1和途徑2的值根據(jù)文獻(xiàn)中不同N2O產(chǎn)生途徑的純培養(yǎng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到相應(yīng)范圍，途徑1和途徑2表示兩個(gè)途徑對(duì)N2O的貢獻(xiàn)率，途徑1+途徑2=1[44,46](圖2)。二源同位素混合模型一次只能考慮兩個(gè)來源[47]，無法將所有N2O產(chǎn)生途徑放入模型同時(shí)運(yùn)行，需要對(duì)各途徑兩兩進(jìn)行場(chǎng)景假設(shè)分別定量分析。因?yàn)楦鳟a(chǎn)生途徑的15NSPN2O可分為N2OD和N2ON兩大類，可分別從兩類中選擇一個(gè)途徑進(jìn)行兩兩分析。

但是，在反硝化過程中，N2O會(huì)消耗還原為N2，隨著還原進(jìn)程的進(jìn)行，15NSPN2O因分餾效應(yīng)發(fā)生變化，需對(duì)這一過程進(jìn)行校正，才能準(zhǔn)確計(jì)算排放貢獻(xiàn)[16]。N2O還原過程中15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O的同位素效應(yīng)變化較一致，分餾系數(shù)比率(red15Nsp/red18O或red15Nsp/red15N)十分穩(wěn)定，可作為校正N2O還原過程影響的指標(biāo)[40, 43-44]。首先，根據(jù)需要分析的兩種N2O產(chǎn)生途徑的15NSPN2O和18ON2O值，在樣品值散點(diǎn)圖上繪制出相應(yīng)的端元值范圍，運(yùn)用Monte Carlo采樣方法在取值范圍內(nèi)各取一個(gè)點(diǎn)連接得到混合曲線；其次以N2O還原為N2過程中15N和18O分餾因子的穩(wěn)定比值(red15Nsp/red18O)為斜率，經(jīng)過樣品值點(diǎn)繪制出還原曲線的取值范圍，再用Monte Carlo采樣方法在范圍內(nèi)取一條曲線即為該樣品點(diǎn)對(duì)應(yīng)的還原曲線，還原曲線與混合曲線的交點(diǎn)即可區(qū)分兩個(gè)途徑對(duì)樣品N2O的排放貢獻(xiàn)[39-40,43](圖2)。Lewicka-Szczebak等[41]和Wu等[48]發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際土壤中N2O還原為N2過程還存在兩種可能(圖3)：一是還原–混合過程(R-M)，即N2O先還原后混合的過程，首先細(xì)菌反硝化途徑產(chǎn)生的N2O部分還原為N2，剩余未還原的N2O與硝化、真菌反硝化途徑產(chǎn)生的N2O混合；二是混合–還原過程(M-R)，即N2O先混合后還原的過程，各個(gè)途徑產(chǎn)生的N2O先混合，接著部分N2O還原為N2。他們進(jìn)一步提出了Mapping approach校正N2O還原為N2過程的方法，假設(shè)該體系為封閉體系，根據(jù)Rayleigh分餾方程進(jìn)行校正(公式(10))。以第一種情況為例，在線性混合模型中還原曲線和混合曲線可分別用公式(3)、(4)表示，根據(jù)公式(5) ～ (7)代入兩個(gè)途徑的15NSPN2O和18O值后，可得還原曲線的截距bred、混合曲線的斜率amix和截距bmix。整合還原曲線和混合曲線的方程(公式(3)、(4))，可得到二者交點(diǎn)的15NSPN2O和18ON2O值(公式(8)、(9))。

圖 2 二源同位素混合模型概念圖

(場(chǎng)景1(藍(lán)色虛線)：混合–還原過程(M-R)；場(chǎng)景2(黃色虛線)：還原–混合過程(R-M)；a點(diǎn)截距：還原前各個(gè)途徑產(chǎn)生的混合N2O；b點(diǎn)截距：細(xì)菌反硝化途徑產(chǎn)生的N2O部分還原為N2后殘余的部分)

式中：ared是15NSPN2O值和18O的分餾系數(shù)之比(red15Nsp/red18O)，該比值穩(wěn)定在2.4 ～ 2.6；=15NSPN2O，=18ON2O；對(duì)于細(xì)菌反硝化過程，bD是細(xì)菌反硝化過程的15NSPN2O值，bD是細(xì)菌反硝化過程的18ON2O值，同理Ni/fD和Ni/fD分別是硝化或真菌反硝化過程的15NSPN2O和18ON2O值；int、int分別為還原曲線和混合曲線交點(diǎn)的18ON2O和15NSPN2O值。

最后，依據(jù)Rayleigh分餾方程，未還原的N2O比例(N2O)和細(xì)菌反硝化過程的貢獻(xiàn)(bD)可以通過公式(10)～(11)計(jì)算得出。

同理，第二種場(chǎng)景假設(shè)的計(jì)算方法與此類似，具體可參照Wu等[48]文章的附錄。對(duì)比預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一般來說還原–混合過程的場(chǎng)景假設(shè)其估計(jì)值和觀測(cè)值之間更加契合[39,48–50]，但也有研究對(duì)比標(biāo)記試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分土壤類型中混合–還原過程場(chǎng)景假設(shè)的結(jié)果與觀測(cè)值之間更加吻合[41,51]。

總之，二源同位素混合模型可針對(duì)場(chǎng)景假設(shè)中兩種N2O產(chǎn)生途徑計(jì)算相對(duì)貢獻(xiàn)，自此基于N2O同位素異位體同位素特征值的溯源分析方法開始向半定量化推進(jìn)。但是，簡單的二源同位素線性混合模型一次所能區(qū)分的N2O產(chǎn)生途徑有限，只能進(jìn)行多次場(chǎng)景假設(shè)，在樣本量和產(chǎn)生途徑較多的情況下難以兼顧數(shù)據(jù)源的不確定性，可能產(chǎn)生較大誤差。由于樣本的同位素特征值來自于試驗(yàn)測(cè)定，存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差和系統(tǒng)誤差。各N2O產(chǎn)生途徑的源數(shù)據(jù)整理自文獻(xiàn)中不同條件下的純培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，變化范圍較大，如果將整個(gè)范圍代入，與特定試驗(yàn)條件下的實(shí)際范圍相比也存在一定偏差。Buchen等[39]嘗試將源數(shù)據(jù)范圍全部代入計(jì)算，均發(fā)現(xiàn)結(jié)果的不確定性較大。這種情況下，使用二源同位素線性混合模型難以準(zhǔn)確量化N2O排放貢獻(xiàn)。

4.3 貝葉斯同位素混合模型

同位素混合模型不僅包括線性混合模型，也有近年來發(fā)展迅速的基于貝葉斯統(tǒng)計(jì)的同位素混合模型(如：SIAR、MixSIR等)，在R語言的輔助下，已逐漸應(yīng)用于生態(tài)、地質(zhì)等領(lǐng)域中食物貢獻(xiàn)率、水分貢獻(xiàn)率溯源分析。其中，SIAR發(fā)展最早，它能考慮多種來源數(shù)據(jù)的不確定性和先驗(yàn)信息，而MixSIR在樣品混合物取值非常穩(wěn)定時(shí)結(jié)果更可靠，但是樣品值的微小變動(dòng)容易引起貢獻(xiàn)率結(jié)果波動(dòng)[52]。2018年Stock等[47]綜合SIAR模型和MixSIR模型二者優(yōu)勢(shì)，在考慮多種源不確定性和先驗(yàn)信息基礎(chǔ)上，加入了隨機(jī)效應(yīng)分類變量、殘差和過程誤差等開發(fā)出了MixSIAR模型，已被認(rèn)為是最優(yōu)的貝葉斯混合模型。雖然目前應(yīng)用該模型的研究對(duì)象都不同，但均是用于量化不同源對(duì)于混合物(最終產(chǎn)物)的貢獻(xiàn)，該模型基于R語言實(shí)現(xiàn)，通過為每個(gè)源和混合物定義均值和方差參數(shù)，從而將源同位素值的不確定性納入模型[53]。2020年Lewicka-Szczebak等[51]首次提出基于貝葉斯的三源同位素值混合模型(3DI模型)，同時(shí)使用15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O三種同位素特征值，雖然15NbulkN2O值變異性很大但依然包含了重要信息，在同位素特征值個(gè)數(shù)不受限制的情況下，將其納入模型的同位素特征值數(shù)據(jù)中，可為N2O的溯源分析提供更多科學(xué)依據(jù)，有助于提高分析方法的定量化水平。該模型的核心基于Moore和Semmens等[53]的工作并進(jìn)行了進(jìn)一步擴(kuò)展，允許將輸入數(shù)據(jù)的不確定性包括到模型中，即假設(shè)來自4個(gè)N2O產(chǎn)生途徑(bD、nD、fD、和Ni)的源數(shù)據(jù)集(15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O值)正態(tài)分布，多次測(cè)量構(gòu)成單個(gè)樣本后對(duì)其進(jìn)行Monte Carlo積分，源數(shù)據(jù)的不確定性通過非歸一化似然計(jì)算中的方差輸入模型。3DI模型允許同時(shí)考慮N2O的4種產(chǎn)生途徑，使用基于貝葉斯框架的穩(wěn)定同位素混合模型確定最終貢獻(xiàn)比例的概率分布。Lewicka-Szczebak等[51]比較了3DI模型、SP/O圖(15NSPN2O–18ON2O)、SP/N圖(15NSPN2O–15NbulkN2O)以及N/O圖(15NbulkN2O–18ON2O)的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SP/O圖和3DI模型的結(jié)果較一致，且與15N標(biāo)記的試驗(yàn)結(jié)果較吻合，且在N2O還原作用的估算上更優(yōu)于15N標(biāo)記法；與SP/O圖相比，3DI模型結(jié)果中的相關(guān)性分析更能保證貢獻(xiàn)率結(jié)果的準(zhǔn)確性；SP/N圖則問題較大，輸出結(jié)果難以解釋。本課題在現(xiàn)有4個(gè)N2O產(chǎn)生途徑基礎(chǔ)上增加了異養(yǎng)硝化途徑，使用3DI模型分析得到的 N2O排放貢獻(xiàn)與15N標(biāo)記方法基本吻合(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，3DI模型能夠更加全面地估算各N2O產(chǎn)生途徑的貢獻(xiàn)和N2O殘余比例N2O[41]，可大幅提高基于自然豐度的土壤N2O溯源研究定量程度。

4.4 不同模型方法的優(yōu)勢(shì)與不足

在N2O同位素異位體方法的發(fā)展過程中，最初關(guān)注不同實(shí)驗(yàn)室間如何準(zhǔn)確測(cè)定N2O的一系列同位素特征值15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O，國際標(biāo)準(zhǔn)品USGS51和USGS52的出現(xiàn)解決了這一問題。隨著更多N2O產(chǎn)生途徑的同位素特征值的發(fā)現(xiàn)，研究人員重點(diǎn)關(guān)注如何定量不同N2O產(chǎn)生途徑的排放貢獻(xiàn)。從最初的僅根據(jù)N2O產(chǎn)生途徑端元值簡單劃分，發(fā)展到二源同位素混合模型(SP/O或SP/N同位素混合模型)以及最新的貝葉斯同位素混合模型(3DI模型)等研究方法。

二源同位素混合模型，解決了只能通過15NbulkN2O端元值定性判斷N2O排放來源問題，能半定量分析兩種N2O產(chǎn)生途徑的貢獻(xiàn)比例。因其核心是線性方程，僅考慮兩個(gè)N2O來源，在一定程度上限制了模型結(jié)果的準(zhǔn)確性。但基于SP/N的二源同位素混合模型仍然廣泛應(yīng)用于水生生態(tài)系統(tǒng)的N2O排放研究，基于SP/O的二源同位素混合模型則主要應(yīng)用在土壤生態(tài)系統(tǒng)中。不少研究人員開展了15N標(biāo)記試驗(yàn)作為對(duì)比，證明二源同位素混合模型可以準(zhǔn)確估算主要的N2O產(chǎn)生途徑，還能準(zhǔn)確量化N2O的還原比例[39, 48, 51]。

基于Python實(shí)現(xiàn)的3DI模型擺脫了N2O來源個(gè)數(shù)的限制，能同時(shí)對(duì)多個(gè)N2O產(chǎn)生途徑進(jìn)行定量分析，還提供了定量結(jié)果的不確定性分析，這也是運(yùn)用同位素異位體方法研究N2O排放貢獻(xiàn)的一大突破進(jìn)展。但是這一方法仍處于起步階段，還存在不足：①N2O產(chǎn)生途徑源數(shù)據(jù)的不確定性。目前異養(yǎng)硝化、協(xié)同反硝化、DNRA等N2O產(chǎn)生途徑的15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O值尚不明確，尤其是與有機(jī)氮庫有關(guān)的異養(yǎng)硝化途徑對(duì)土壤N2O的排放貢獻(xiàn)不可忽略，其在林地、草地和農(nóng)田土壤中貢獻(xiàn)率可達(dá)25% ～ 85%，已被證明是亞熱帶酸性森林土壤的主要N2O產(chǎn)生途徑[54]，亟需將其納入源數(shù)據(jù)中，才能準(zhǔn)確定量土壤N2O排放貢獻(xiàn)。而且現(xiàn)有的各N2O產(chǎn)生途徑源數(shù)據(jù)主要基于某幾類典型微生物純培養(yǎng)，在土壤微生物中所屬功能群的比例小，源數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性需要在不同類型土壤中反復(fù)驗(yàn)證。需要開展大量純培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，建立源數(shù)據(jù)庫，才能有助于評(píng)估不同生態(tài)系統(tǒng)、不同土壤類型中源數(shù)據(jù)的特點(diǎn)和差異。②定量方法的不確定性。土壤中N2O的各產(chǎn)生過程和N2O還原過程同時(shí)發(fā)生，二者之間存在復(fù)雜的相互作用[41,49]。在現(xiàn)有的同位素混合模型中，當(dāng)N2O潛在來源增加時(shí)，任何一個(gè)來源貢獻(xiàn)的不確定性也會(huì)增加[55]。不同類型土壤特點(diǎn)各異，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異大，15NbulkN2O和18ON2O值對(duì)不同反應(yīng)底物同位素特征的依賴性大[44]，3DI模型亟需在不同類型土壤中開展大量對(duì)比試驗(yàn)，通過15N標(biāo)記結(jié)合數(shù)值模型的方法檢驗(yàn)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，調(diào)整模型中的參數(shù)計(jì)算方法和假設(shè)條件，如：針對(duì)實(shí)際研究體系的18ON2O計(jì)算方法，以及N2O還原為N2過程的假設(shè)條件。

5 同位素異位體方法溯源土壤N2O的應(yīng)用和展望

基于N2O同位素異位體組成特征溯源土壤N2O排放貢獻(xiàn)，主要依據(jù)對(duì)N2O產(chǎn)生和還原過程的同位素效應(yīng)的理解[45]。從1999年Toyoda和Yoshida[18]建立質(zhì)譜測(cè)定N2O同位素異位體的方法后，該方法的技術(shù)已發(fā)展成熟。近年來，激光光譜儀測(cè)定N2O同位素異位體的方法發(fā)展迅速，雖然質(zhì)譜儀在18ON2O和15NbulkN2O的測(cè)定上有明顯優(yōu)勢(shì)，但光譜儀對(duì)15NSPN2O值的測(cè)定更為穩(wěn)定，且因其測(cè)定成本較低，適合野外實(shí)地工作，備受研究人員的青睞。但是，質(zhì)譜儀所需氣體量較小，可精確區(qū)分其他痕量氣體的影響，能準(zhǔn)確校正N2O濃度變化引起的非線性問題，所以目前仍然是主流測(cè)定方法。

許多學(xué)者已將同位素異位體方法應(yīng)用到不同領(lǐng)域的研究中，Koba等[44]首次使用15NSPN2O、15NbulkN2O值，結(jié)合二源同位素混合模型，分析溫帶針葉林地區(qū)地下水的N2O排放貢獻(xiàn)；Toyoda等[43]、Well等[40]在此基礎(chǔ)上提出利用分餾系數(shù)比率(red15NSP/red18O或red15NSP/red15N)校正N2O還原過程的影響，分析了不同施肥處理下各作物種植土壤的N2O排放貢獻(xiàn)；Zou等[46]運(yùn)用這一方法，研究了茶園土壤的N2O排放貢獻(xiàn)；Lewicka-Szczebak等[41]提出Mapping approach方法區(qū)分還原混合的先后過程，考察對(duì)N2O還原作用校正結(jié)果的影響；Buchen等[39]首次選擇15NSPN2O和18ON2O兩個(gè)指標(biāo)來區(qū)分不同來源N2O排放貢獻(xiàn)，指出土壤類型、處理?xiàng)l件等都會(huì)顯著影響N2O排放產(chǎn)生途徑的貢獻(xiàn)，在研究涉及的兩種土壤類型中，N2O還原為N2對(duì)同位素組成有不同影響，并據(jù)此對(duì)各個(gè)場(chǎng)景進(jìn)行分析，得到其計(jì)算方法存在不確定性的結(jié)論[39]。

綜上，N2O同位素異位體法可實(shí)現(xiàn)野外原位采集氣體樣品，經(jīng)質(zhì)譜儀或光譜儀分析得到數(shù)據(jù)，結(jié)合模型即能得到土壤N2O排放貢獻(xiàn)，與15N標(biāo)記方法相比受時(shí)空限制小，易于在大尺度的野外試驗(yàn)中推行，是極具潛力的新方法和新技術(shù)。雖然在定量分析上仍有不足，但經(jīng)過不斷完善發(fā)展，其已開始廣泛應(yīng)用于不同地區(qū)、不同土壤類型、不同處理?xiàng)l件下的N2O排放貢獻(xiàn)分析，所以這一新興的土壤N2O溯源分析方法的應(yīng)用前景十分廣闊。

1) 可與15N標(biāo)記方法互為補(bǔ)充。N2O的同位素異位體方法能在較大的時(shí)空尺度上半定量或定量評(píng)估N2O的排放貢獻(xiàn)，能區(qū)分細(xì)菌、真菌反硝化過程產(chǎn)生的N2O，還能定量N2O還原為N2的過程，有效彌補(bǔ)了15N標(biāo)記方法的不足之處。

2) 可與DNDC等模型相結(jié)合?；谶^程機(jī)理開發(fā)的DNDC生物地球化學(xué)模型被廣泛用于估算區(qū)域尺度的N2O排放，將N2O的15NSPN2O、18ON2O和15NbulkN2O值引入DNDC模型，比較實(shí)際測(cè)定值和模型估算值，能有效率定模型參數(shù)、驗(yàn)證模型結(jié)果，量化區(qū)域尺度的N2O排放，為制定合理、有效的N2O減排措施提供科學(xué)依據(jù)[56]。

3) 可為解析N2O產(chǎn)生途徑的生化機(jī)制提供信息。N2O的N、O同位素組成受其產(chǎn)生途徑的生化機(jī)制調(diào)控，15NSPN2O值體現(xiàn)N2O兩個(gè)N原子上的同位素組成差異，可作為N2O產(chǎn)生過程的分子機(jī)理的有力佐證。在細(xì)菌反硝化過程中，NOR酶如何催化產(chǎn)生N2O，曾有順式(cis)和反式(trans)兩種可能機(jī)制的爭(zhēng)論，其較低的15NSPN2O值(–10‰ ～ 0‰)表明兩個(gè)N原子上的15N組成差異不大，證明了反式機(jī)制的正確性[57-58]。這一發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了將N2O的同位素異位體(如：15N14N18O和14N15N18O)作為新型示蹤劑，深度解析并量化N2O產(chǎn)生途徑。

4)可嘗試進(jìn)一步建立更高精度的數(shù)值定量模型。目前的二源同位素混合模型在計(jì)算不同來源排放貢獻(xiàn)的過程中存在明顯局限性，如對(duì)源個(gè)數(shù)的限制等。而基于貝葉斯的數(shù)值模型能同時(shí)考慮N2O的不同產(chǎn)生和消耗途徑，兼顧土壤異質(zhì)性、土壤反應(yīng)過程速率差異性和底物同位素組成差異性，但模型結(jié)果的精度還有待進(jìn)一步提高，所以進(jìn)一步完善以及嘗試建立更高精度的數(shù)值模型將是該領(lǐng)域未來的研究重點(diǎn)之一。

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Isotopocule Analysis to Source Partition Soil Produced N2O: A Review

XU Jin1, CAO Yacheng1,2*, WEN Teng1,3,4,5*, ZHANG Peiyi1, ZHANG Jinbo1,3,4,5, CAI Zucong1,3,4,5

(1 School of Geography Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 3 Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application, Nanjing 210023, China; 4 Key Laboratory of Virtual Geographic Environment (Nanjing Normal University), Ministry of Education, Nanjing 210023, China; 5 State Key Laboratory Cultivation Base of Geographical Environment Evolution (Jiangsu Province), Nanjing 210023, China)

Soil is one of the important sources of N2O emissions. Soil N2O production pathway is numerous and regulated by variety of factors, in-depth analysis of soil N2O production pathway can adopt targeted emission reduction strategies. Stable isotope technology has been widely used to the study of soil N2O emissions, N2O isotope method is an emerging research method in recent years. This method analyzes N2O emission contribution by measuring the isotope composition of soil N2O (15NSPN2O,18ON2Oand15NbulkN2O), because not need to add markers, little interference to soil system and low in cost, it is suitable for field research on N2O emissions and is a powerful supplement to15N labeling method. This paper introduces in detail the principle of N2O isotope method, mass spectrometry method and quantitative analysis method, the factors affecting the method and its application prospect.

N2O isotopocules; Site preference; Source partitioning N2O; Isotope ratio mass spectrometry (IRMS)

S153

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.03.001

徐錦, 曹亞澄, 溫騰, 等. 同位素異位體溯源土壤N2O的方法、技術(shù)和展望. 土壤, 2022, 54(3): 425–436.

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41977084)資助。

(yccao@issas.ac.cn; wenteng@njnu.edu.cn)

徐錦(1998—)，女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事土壤氮轉(zhuǎn)化研究。E-mail: 201302014@njnu.edu.cn