基于三柱結(jié)構(gòu)的股骨頭壞死病理和顯微形態(tài)學(xué)研究

陳逸煒 繆語 朱斌 劉可心 薛峰 李廣翼 張長青

股骨頭缺血性壞死(ONFH)是由股骨頭血供受損或中斷所致。缺血早期出現(xiàn)骨細(xì)胞和骨髓成分死亡[1-2]，繼而發(fā)生軟骨下骨折而導(dǎo)致股骨頭塌陷，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的髖關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)功能障礙[3-4]。我國大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查顯示，非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者人數(shù)達812萬[5]。ONFH潛伏期較長，病情進程較為緩慢，但不及時治療甚至可導(dǎo)致終身殘疾[6]。晚期ONFH患者大多只能選擇全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(THA)[7]，這給整個社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[8-9]。

股骨頭形態(tài)獨特，骨小梁結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不均勻[10]。股骨頭塌陷是影響ONFH預(yù)后的關(guān)鍵因素，塌陷后關(guān)節(jié)軟骨和股骨頭形態(tài)都將受到不可逆破壞，錯失保髖治療的最佳時機[11]。目前主要是根據(jù)股骨頭壞死灶的位置和大小預(yù)測股骨頭塌陷風(fēng)險，基于壞死區(qū)分布的三柱分類系統(tǒng)在ONFH相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床評估中廣泛使用[12-13]。該分類系統(tǒng)將股骨頭分為3個部分，其中內(nèi)側(cè)柱、中心柱和外側(cè)柱分別占30%、40%和30%的股骨頭。根據(jù)壞死灶受累部位，ONFH可分為內(nèi)側(cè)型（僅累及內(nèi)側(cè)支柱）、中央型（累及內(nèi)側(cè)和中央支柱）和外側(cè)型（累及外側(cè)支柱）。該分級方法認(rèn)為，股骨頭外側(cè)柱是股骨頭塌陷進展的關(guān)鍵因素[14]。

本研究以主要壓力骨小梁（PCT）為標(biāo)志，將股骨頭分為內(nèi)側(cè)區(qū)、中間區(qū)和外側(cè)區(qū)，探討不同區(qū)域的顯微結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)學(xué)特征的差異。微計算機斷層掃描(micro-CT)已被用于詳細(xì)評估股骨頭壞死的三維顯微結(jié)構(gòu)。然而，既往研究大多只是從股骨近端特定區(qū)域中選擇性提取小直徑的標(biāo)本[15]，缺少對股骨頭整體顯微結(jié)構(gòu)的研究。本研究使用micro-CT和脫鈣骨組織切片評估股骨頭內(nèi)側(cè)、中間和外側(cè)的骨小梁顯微結(jié)構(gòu)和組織病理學(xué)改變，旨在加深對ONFH發(fā)展過程中顯微組織形態(tài)學(xué)和病理學(xué)改變的理解，更準(zhǔn)確地評估疾病嚴(yán)重程度，進一步為ONFH治療方案的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及資料收集

收集2015年9月至2019年10月于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院因ONFH行THA的股骨頭標(biāo)本，共計23例(男17例，女6例)，按病因分為激素性O(shè)NFH（11例）、酒精性O(shè)NFH（7例）、創(chuàng)傷性O(shè)NFH（3例）、特發(fā)性O(shè)NFH（2例）。其中右髖12例，左髖11例，平均年齡49.43歲（41～59歲）。所有患者均為國際骨微循環(huán)研究協(xié)會（ARCO）Ⅲ期[16]。

1.2 標(biāo)本準(zhǔn)備及micro-CT掃描分析

THA后取股骨頭標(biāo)本，保存于-80℃冰箱。然后使用高分辨率micro-CT系統(tǒng)（Scanco Medical，瑞士）進行掃描。通過內(nèi)置軟件對股骨頭定位調(diào)整，之后進行感興趣區(qū)域分割，測量各區(qū)域骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)。所有股骨頭的方向均以股骨頭凹和PCT為解剖標(biāo)志進行調(diào)整（圖1）[10,17]。根據(jù)壞死病灶的邊界，沿上、下方向?qū)⒐晒穷^分為壞死區(qū)、交界反應(yīng)區(qū)2個主要區(qū)域；參照PCT，沿內(nèi)、中、外側(cè)方向?qū)⒐晒穷^分為內(nèi)側(cè)區(qū)、中間區(qū)（主要受壓小梁區(qū)）和外側(cè)區(qū)3個主要區(qū)域。最終選擇6個感興趣區(qū)域：內(nèi)側(cè)壞死區(qū)、中間壞死區(qū)、外側(cè)壞死區(qū)、內(nèi)側(cè)交界區(qū)、中間交界區(qū)和外側(cè)交界區(qū)。在每個感興趣區(qū)域中，設(shè)置1個圓柱形樣本（高度5 mm，直徑5 mm）進行顯微結(jié)構(gòu)分析（圖2、3）。

圖1 股骨頭不同感興趣區(qū)域的定位和分割 a. 股骨近端冠狀位CT圖像中黑色虛線中間區(qū)域為主要PCT b. 大體切片中黑色虛線中間區(qū)域為主要PCT

掃描后得到的圖像分別采用Skyscan NRecon、Dataviewer軟件重建、調(diào)整，之后用 Skyscan CTAn軟件對圖像進行二值化處理、分析。根據(jù)圖像灰度直方圖分析及經(jīng)驗觀察，將礦化骨組織的閾值區(qū)間設(shè)定為90～255，用以與軟組織進行區(qū)分[18-20]。然后通過內(nèi)置軟件分析骨組織的三維顯微結(jié)構(gòu)。根據(jù)X線衰減系數(shù)值，制作出彩色圖像，其代表小梁內(nèi)的礦化分布(圖2、3)。測量參數(shù)：骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨表面積與體積比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、各向異性度(DA)、連通性密度(Conn.D)[21]。

圖2 股骨頭壞死區(qū)不同位置的micro-CT重建圖像 a、b. 外側(cè)壞死區(qū) c、d. 中間壞死區(qū) e、f. 內(nèi)側(cè)壞死區(qū) 注：a、c、e為二維重建圖像；b、d、f為三維重建圖像

1.3 組織病理學(xué)切片

Micro-CT掃描后，將所有股骨頭沿冠狀面分成前、后兩半球。然后從每個股骨頭半球中切取10 mm厚的冠狀骨組織標(biāo)本，用于后續(xù)組織學(xué)檢查。所有標(biāo)本先在4%多聚甲醛溶液中固定2周，然后予以EDTA微波脫鈣3周，接著經(jīng)75%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水和二甲苯透明處理，最后石蠟包埋，待后續(xù)切片。切片為5 μm厚，行常規(guī) HE 染色，光鏡下觀察各區(qū)域的病理學(xué)改變。

圖3 股骨頭交界區(qū)不同位置的micro-CT重建圖像 a、b. 外側(cè)交界區(qū) c、d. 中間交界區(qū) e、f. 內(nèi)側(cè)交界區(qū) 注：a、c、e為二維重建圖像；b、d、f為三維重建圖像

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。壞死區(qū)和交界區(qū)的內(nèi)側(cè)區(qū)、中間區(qū)和外側(cè)區(qū)之間的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

標(biāo)本的骨組織切片顯示，股骨頭關(guān)節(jié)面塌陷。內(nèi)部結(jié)構(gòu)可分為壞死區(qū)、交界反應(yīng)區(qū)和正常區(qū)。骨折多出現(xiàn)在軟骨下骨區(qū)域，可見骨小梁連續(xù)性中斷，壞死區(qū)為淡黃色致密組織,骨小梁形態(tài)紊亂；交界反應(yīng)區(qū)可見肉芽組織、纖維組織及硬化的松質(zhì)骨，部分標(biāo)本可見囊性變；正常區(qū)骨小梁形態(tài)規(guī)則，方向齊整。

2.2 壞死區(qū)骨計量學(xué)分析

在壞死區(qū)，不同區(qū)域的BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.Sp、DA、Conn.D無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），僅Tb.N、SMI存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。內(nèi)側(cè)壞死區(qū)Tb.N顯著低于中間壞死區(qū)和外側(cè)壞死區(qū)，內(nèi)側(cè)壞死區(qū)SMI顯著高于中間壞死區(qū)和外側(cè)壞死區(qū)（表1）。

表1 壞死區(qū)骨計量學(xué)參數(shù)分析結(jié)果

2.3 交界區(qū)骨計量學(xué)分析

在交界反應(yīng)區(qū)，不同區(qū)域的BV/TV、BS/BV、Tb.Th、SMI存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而Tb.Sp、Tb.N、DA、Conn.D則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。內(nèi)側(cè)交界區(qū)的BV/TV顯著低于中間交界區(qū)和外側(cè)交界區(qū)，內(nèi)側(cè)交界區(qū)的BS/BV、SMI顯著高于外側(cè)交界區(qū)，內(nèi)側(cè)交界區(qū)的Tb.Th顯著低于外側(cè)交界區(qū)（表2）。

表2 交界區(qū)骨計量學(xué)參數(shù)分析結(jié)果

2.4 交界區(qū)組織學(xué)評估

在交界反應(yīng)區(qū)，可見血管豐富的肉芽組織。單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞大量浸潤在纖維組織周圍，尤其在外側(cè)區(qū)域。雖然血管可以穿透纖維化包膜，但在壞死灶邊界，血管生成被阻斷，修復(fù)性纖維血管組織不能穿透壞死區(qū)骨髓腔。在疾病中末期，由于成骨細(xì)胞活動增強，交界區(qū)部分區(qū)域新生骨組織增多，尤其是外側(cè)交界區(qū)，但這些交界區(qū)的成骨活動都無法完全修復(fù)壞死的骨組織。與內(nèi)側(cè)交界區(qū)相比，外側(cè)交界區(qū)的血管生成也更加豐富(下頁圖4)。

圖4 股骨頭標(biāo)本交界反應(yīng)區(qū)域HE染色觀察（從左至右放大倍數(shù)分別為×40和×200） a. 內(nèi)側(cè)壞死區(qū) b. 內(nèi)側(cè)交界區(qū) c. 中間壞死區(qū)d. 中間交界區(qū) e. 外側(cè)壞死區(qū) f. 外側(cè)交界區(qū)

3 討論

在股骨頭壞死發(fā)生發(fā)展的過程中，塌陷是最為重要的病理改變，它的發(fā)生是骨修復(fù)過程與生物力學(xué)共同作用的結(jié)果[22-23]。有研究對股骨頭壞死標(biāo)本中的骨小梁進行分析，發(fā)現(xiàn)壞死區(qū)的BV/TV顯著降低；交界反應(yīng)區(qū)的BV/TV增加，骨小梁增粗，結(jié)構(gòu)改變；而正常區(qū)的骨小梁結(jié)構(gòu)完整，分布較為均勻[24]。但該研究未對不同部位（內(nèi)、中、外側(cè)）的壞死區(qū)和交界反應(yīng)區(qū)進一步比較分析。在本實驗中，我們同時分析了ARCO Ⅲ期的股骨頭壞死標(biāo)本不同區(qū)域的顯微結(jié)構(gòu)和組織學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)ONFH中壞死區(qū)的顯微結(jié)構(gòu)相似，而交界反應(yīng)區(qū)的顯微結(jié)構(gòu)存在顯著區(qū)域差異，即與內(nèi)側(cè)交界區(qū)相比，外側(cè)交界區(qū)表現(xiàn)出更致密的顯微結(jié)構(gòu)。

內(nèi)、外側(cè)交界區(qū)的區(qū)域差異性很可能是骨組織內(nèi)相關(guān)細(xì)胞對生物應(yīng)力反應(yīng)不同所致[25]。在外側(cè)交界區(qū)，相較于骨吸收，骨生成活動可能占據(jù)主導(dǎo)地位，進而導(dǎo)致外側(cè)區(qū)域有更加硬化的顯微結(jié)構(gòu)[26]。此外，骨折常發(fā)生在壞死區(qū)和交界區(qū)[23]。這些區(qū)域所繼發(fā)的病理改變?nèi)缬不蚰倚宰兊榷伎赡芨淖兩飸?yīng)力分布[26-27]，同時骨代謝失衡可能通過多種方式促進骨壞死進展，進而導(dǎo)致軟骨下骨折發(fā)生，最終引起股骨頭塌陷[28]。軟骨下板骨折常始于交界區(qū)附近的骨吸收區(qū)[29]。有研究表明，在ONFH早期，等效應(yīng)力和剪切應(yīng)力均集中在壞死病灶的外側(cè)邊界，同時可見硬化改變[30]；在ONFH晚期，塌陷常發(fā)生于外側(cè)邊界的軟骨下骨[22-23]。當(dāng)外側(cè)柱受累時，95.3%的股骨頭在半年內(nèi)塌陷[31]，因此有學(xué)者認(rèn)為外側(cè)柱保存是預(yù)防股骨頭塌陷的關(guān)鍵。

在組織學(xué)上，交界反應(yīng)區(qū)是破碎的骨小梁、軟骨與修復(fù)組織的混合物，包括反應(yīng)性編織骨、化生性軟骨、血管化纖維和肉芽組織[32]。軟骨內(nèi)骨化是骨折端血管化良好時的生理性成骨方式[33]，這在交界反應(yīng)區(qū)也可觀察到。Phemister等創(chuàng)造了“爬行替代”一詞來表示無菌性死骨的緩慢替代[34]。有研究推測，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的改變導(dǎo)致機械強度降低，并最終導(dǎo)致股骨頭塌陷[35]。因此，有研究提出可以在早期干預(yù)ONFH，促進成骨細(xì)胞活性，抑制破骨細(xì)胞活性，以防止股骨頭塌陷[36]。交界反應(yīng)區(qū)同時發(fā)生骨重建[32]：在原位成骨的積累過程中，成骨細(xì)胞通常發(fā)生在死亡的骨小梁上；破骨吸收過程經(jīng)常發(fā)生在反應(yīng)界面及其附近。血管生成是壞死后修復(fù)反應(yīng)的重要組成部分[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，外側(cè)交界區(qū)界面的血管生成更加豐富，這表明該部位的修復(fù)反應(yīng)更加活躍。

綜上所述，ONFH中壞死區(qū)在不同部位表現(xiàn)出相似的顯微結(jié)構(gòu)特征，而在交界反應(yīng)區(qū)，外側(cè)交界區(qū)存在更致密的顯微結(jié)構(gòu)。在組織病理學(xué)方面，外側(cè)交界區(qū)的血管浸潤也更為豐富。本研究有助于更好地理解股骨頭壞死不同區(qū)域的顯微結(jié)構(gòu)及病理組織形態(tài)改變，為進一步完善ONFH的診療方案提供理論依據(jù)。