不同組合菌種預(yù)處理對(duì)褐煤制生物甲烷的影響

王 磊，郭紅玉，趙樹(shù)峰，石尚威，趙國(guó)俊

(1.山西焦煤山煤國(guó)際大平煤業(yè)有限公司，山西 長(zhǎng)治 046200； 2.河南理工大學(xué) 能源科學(xué)與工程學(xué)院，河南 焦作 454000； 3.山西小回溝煤業(yè)有限公司，山西 太原 030400)

我國(guó)褐煤資源儲(chǔ)量豐富，尤其是內(nèi)蒙古自治區(qū)，占全國(guó)褐煤總儲(chǔ)量的77%，其次是云南省，占全國(guó)褐煤資源儲(chǔ)量的12.6%[1]。褐煤水分含量高、易風(fēng)化，難以洗選和儲(chǔ)存，目前以粉煤鍋爐燃燒為主，也有傳統(tǒng)的煉焦、氣化和液化等處理方式[2-6]。但這些方法存在利用率低、成本較高、環(huán)境污染等問(wèn)題，亟需一種清潔高效利用褐煤的方法。近年來(lái)，由于煤層氣生物工程的蓬勃發(fā)展[7]，人們對(duì)微生物增產(chǎn)煤層氣概念有了更加深入的了解，并且國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了現(xiàn)場(chǎng)生物增產(chǎn)煤層氣的許多試驗(yàn)，其中美國(guó)的Ciris Energy公司將營(yíng)養(yǎng)液加入至循環(huán)水中以刺激煤層中現(xiàn)存細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)煤炭進(jìn)行降解，產(chǎn)生甲烷。2010年現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，注入營(yíng)養(yǎng)液4個(gè)月后，煤層氣井甲烷產(chǎn)量迅速上升，相比注入前，產(chǎn)量提高了2～5倍[8]。我國(guó)華北油田公司，在山西晉城鄭1區(qū)塊煤層氣井鄭1-312開(kāi)展試驗(yàn)，煤層埋深780m，煤層溫度32℃。注入配液用煤層氣井排采水，2015年1月26日開(kāi)始現(xiàn)場(chǎng)施工，總注入量230m3，營(yíng)養(yǎng)劑關(guān)井反應(yīng)60d后煤層產(chǎn)出液菌群濃度與措施前相比較增加了2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，煤層營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，措施前平均日產(chǎn)氣16.81m3，措施后平均日產(chǎn)氣75.13m3，微生物措施起到了穩(wěn)產(chǎn)增氣的目的[9]。因此，微生物降解煤產(chǎn)生物甲烷，成了國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，由于其反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保、能耗低而備受關(guān)注[10-12]。

微生物降解煤產(chǎn)甲烷包括水解、產(chǎn)酸、產(chǎn)氫/產(chǎn)乙酸、產(chǎn)甲烷階段和多菌群的協(xié)同作用，而水解階段是整個(gè)過(guò)程中的限速階段[13]，預(yù)處理往往是解決限速階段的重要方法之一[14]。目前對(duì)煤進(jìn)行預(yù)處理的方法分為物理、化學(xué)和生物三大類。物理預(yù)處理主要采用物理方法(超聲波、溶脹等)，旨在促進(jìn)煤的溶解與降解過(guò)程[15，16]；化學(xué)預(yù)處理通過(guò)雙氧水、硝酸和高錳酸鉀等溶液打斷煤大分子間的化學(xué)鍵，將煤的復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)解聚成小分子，從而促進(jìn)煤的轉(zhuǎn)化[17，18]；生物預(yù)處理多采用細(xì)菌、放線菌、白腐菌、酵母菌等微生物對(duì)煤進(jìn)行降解處理，使煤從大分子結(jié)構(gòu)分解成小分子和酸類物質(zhì)，從而更好地被產(chǎn)甲烷菌利用，實(shí)現(xiàn)煤的高效產(chǎn)氣[19-22]。

由于生物預(yù)處理具有成本低、條件溫和、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，因此本文研究不同組合微生物處理褐煤對(duì)煤制生物甲烷的影響，對(duì)煤進(jìn)行不用組合菌種的預(yù)處理，在不同組合菌種處理下研究煤的生物產(chǎn)氣特征，并通過(guò)動(dòng)力學(xué)方程模擬不同組合菌預(yù)處理煤的最大甲烷產(chǎn)率和累計(jì)產(chǎn)氣潛力，以此探索提高褐煤生物產(chǎn)氣的新方法，為后續(xù)現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)煤樣

本實(shí)驗(yàn)煤樣采自內(nèi)蒙古西烏珠穆沁旗白音華礦的新鮮褐煤，采集之后迅速進(jìn)行密封處理，然后使用蒸餾水進(jìn)行沖洗，使用高壓滅菌鍋在121℃下處理20min進(jìn)行滅菌，再將處理后的煤樣放入60℃恒溫干燥箱中，等烘干至重量不變后將煤樣密封保存。實(shí)驗(yàn)前需將煤樣破碎篩分至60～80目，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015對(duì)煤樣進(jìn)行了工業(yè)分析和元素分析，分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)蒙古白音華褐煤樣品的基本性質(zhì) %

1.2 產(chǎn)甲烷菌的富集培養(yǎng)

1)礦井水的采集。礦井水采自焦作古漢山礦新鮮的煤層水，將礦井水迅速放入容器中并使用N2進(jìn)行密封，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入冰箱內(nèi)保存，設(shè)置溫度為4℃，以備后續(xù)生物產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)使用。

2)產(chǎn)甲烷菌群的富集培養(yǎng)。產(chǎn)甲烷菌群的培養(yǎng)基見(jiàn)表2。將礦井水和培養(yǎng)基的混合液pH值調(diào)為7.0，然后裝入無(wú)菌容器中，向其中充入氮?dú)?min，完成后迅速密封并放入恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度為35℃，然后在厭氧環(huán)境進(jìn)行為期4d的發(fā)酵，得到產(chǎn)甲烷菌群富集液。

1.3 預(yù)處理菌種的篩選與培養(yǎng)

1.3.1 菌種的篩選

目前可降解煤的微生物有許多種，包括細(xì)菌(如假單孢菌、巨大芽孢桿菌)、放線菌(如鏈霉菌)、酵母菌、真菌(如云芝、粉狀側(cè)孢菌、假絲酵母)等，總的來(lái)說(shuō)，真菌類占比較大[23-25]。為驗(yàn)證不同菌種的處理效果，同時(shí)滿足經(jīng)濟(jì)性、適用性、以及無(wú)污染性等特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)從細(xì)菌中選取假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，從放線菌中選取綠孢鏈霉菌(Streptomyces viridosporus)，從真菌中選取白腐菌(Phanerochaete ch-rysosporium)作為預(yù)處理菌種。菌種源是北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司和中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種基本信息見(jiàn)表3。

表2 產(chǎn)甲烷菌群培養(yǎng)基

表3 菌種基本信息

各菌種培養(yǎng)基的配制：

1)CM0841培養(yǎng)基：牛肉膏10g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，瓊脂15.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1L，pH=7.2。

2)0038 ISP-2培養(yǎng)基：麥芽提取物10g，葡萄糖4g，瓊脂15g，酵母提取物4g，蒸餾水1L，pH=7.3。

3)綜合馬鈴薯培養(yǎng)基：葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素0.008g，KH2PO43g，瓊脂15g，20%馬鈴薯汁1L，pH=6。

1.3.2 菌種的活化與培養(yǎng)

購(gòu)買菌種均為凍干管模式，存放在安瓿內(nèi)并處于密封狀態(tài)，該狀態(tài)不能直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，需要先對(duì)其進(jìn)行活化和富集，過(guò)程在固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行，在菌種活化富集完成后可進(jìn)行煤樣預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。

培養(yǎng)操作：首先使用無(wú)菌吸管吸取約0.3～0.5mL的菌種對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基(不添加瓊脂)，然后滴入安瓿內(nèi)，輕輕振蕩，直至凍干菌體溶解呈現(xiàn)出懸浮狀；之后吸取安瓿瓶?jī)?nèi)全部菌懸液，移入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)試管中，首次活化成功后不能直接用于實(shí)驗(yàn)，在培養(yǎng)箱中使其再進(jìn)行1～2次傳代以恢復(fù)活力，之后可對(duì)煤樣進(jìn)行預(yù)處理。

1.4 菌種生長(zhǎng)階段測(cè)定

論文選擇比濁法進(jìn)行各個(gè)菌種生長(zhǎng)階段的數(shù)據(jù)測(cè)量，該方法利用微生物懸液濃度與其渾濁度成正比的特性，使用分光光度計(jì)進(jìn)行各細(xì)菌懸液的光密度的測(cè)定，從而得到各菌液的濃度并繪制出生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。

圖1 菌種生長(zhǎng)曲線

由圖1可看出，假單胞菌、綠孢鏈霉菌和白腐菌三種菌的遲緩期為1～2d；對(duì)數(shù)期在2～3d，此時(shí)是所有菌種生長(zhǎng)速率最快的時(shí)期；在第4～5d，菌種生長(zhǎng)曲線有所下降；在第6d進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定期；在第15d后，菌種死亡率增加，菌種生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。為了提高菌種作用效果，選擇培養(yǎng)第2d(對(duì)數(shù)期)的菌種進(jìn)行預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。

1.5 煤樣生物預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)前將使用電磁礦石粉碎機(jī)將煤樣粉碎，并使用標(biāo)準(zhǔn)篩選取60～80目之間煤樣，置于干燥樣品袋內(nèi)保存。

在超凈工作臺(tái)進(jìn)行煤樣的預(yù)處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)選用篩分至60～80目的煤樣，實(shí)驗(yàn)前先對(duì)煤樣進(jìn)行滅菌處理，然后再進(jìn)行干燥，之后取10g煤樣放入無(wú)菌反應(yīng)瓶中，向反應(yīng)瓶中加入經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)的菌液，使菌液淹沒(méi)煤樣，然后用棉塞塞住瓶口，棉塞中加入醫(yī)用棉，以防止預(yù)處理實(shí)驗(yàn)中菌種被污染，并且使用棉塞能保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的有氧環(huán)境。不同組合菌種預(yù)處理煤樣見(jiàn)表4。

表4 生物預(yù)處理實(shí)驗(yàn)分組

1.6 氣體組分含量測(cè)定

采用安捷倫7890 GC型氣相色譜儀進(jìn)行氣體組分測(cè)定。采用進(jìn)樣針手動(dòng)進(jìn)樣，每次進(jìn)行體積為1mL，5A分子篩不銹鋼填充色譜柱，檢測(cè)溫度為100℃，載氣為氦氣，流速為30mL/min。

1.7 氣體體積測(cè)定

產(chǎn)氣量采用排水集氣法進(jìn)行測(cè)量，每3 d測(cè)量一次，氣體體積為集水瓶中排出水的體積。

2 產(chǎn)氣特征分析

2.1 生物預(yù)處理對(duì)煤制生物甲烷的影響

為了研究生物預(yù)處理對(duì)煤制生物甲烷的影響，將預(yù)處理煤樣與原煤樣進(jìn)行厭氧發(fā)酵生物產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，每3d測(cè)定各組煤樣產(chǎn)氣量直到無(wú)氣體生成，然后用氣相色譜儀對(duì)實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)氣體組分進(jìn)行測(cè)定。

2.1.1 不同組合菌種預(yù)處理對(duì)產(chǎn)氣量的影響

菌種預(yù)處理后煤樣累計(jì)產(chǎn)氣量如圖2所示。對(duì)照組Y-H總產(chǎn)氣量為151.50mL，其中甲烷產(chǎn)量為52.33mL，甲烷濃度為34.54%；生物預(yù)處理組J-L-H、J-B-H、L-B-H、L-J-H、B-J-H和B-L-H的總產(chǎn)氣量分別為180.50mL、187.50mL、285.50mL、196.50mL、175.50mL、278.50mL，相比于對(duì)照組Y-H分別增長(zhǎng)了19.14%、23.76%、88.45%、29.70%、16.23%和83.83%，各生物預(yù)處理組甲烷產(chǎn)量為68.50mL、96.30mL、106.49mL、89.15mL、82.71mL和118.98mL，相比于對(duì)照組分別增加了30.90%、84.02%、103.50%、70.36%、58.05%和127.36%。綜上，煤樣經(jīng)過(guò)不同組合菌種預(yù)處理后其總產(chǎn)氣量、甲烷生成量以及甲烷濃度比原煤樣均有不同程度的提高，推測(cè)菌種在預(yù)處理過(guò)程中改變了煤的結(jié)構(gòu)，使其更易向甲烷方向轉(zhuǎn)化。

圖2 菌種預(yù)處理后煤樣累計(jì)產(chǎn)氣量

2.1.2 不同組合菌種對(duì)階段產(chǎn)氣量的影響

煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后的階段產(chǎn)氣量如圖3所示。由圖3可知，煤制生物氣實(shí)驗(yàn)中，0～6d為產(chǎn)氣初期階段，此時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)氣速率普遍較低；6～12d為快速產(chǎn)氣階段，此階段是產(chǎn)氣量的主要來(lái)源，到第12d產(chǎn)氣基本停止，累計(jì)產(chǎn)氣量基本穩(wěn)定，只有L-B-H組(綠孢鏈霉菌+白腐菌+白音華原煤)和B-L-H組(白腐菌+綠孢鏈霉菌+白音華原煤)還繼續(xù)產(chǎn)氣，但產(chǎn)氣速率大幅降低；12～21d，L-B-H組和B-L-H組產(chǎn)氣逐漸停止，到第21d，所有實(shí)驗(yàn)組停止產(chǎn)氣。

圖3 煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后的階段產(chǎn)氣量

2.1.3 不同組合菌種預(yù)處理和產(chǎn)氣的關(guān)系

煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后產(chǎn)氣甲烷濃度如圖4所示，J-L-H組與J-B-H組相比，兩組產(chǎn)氣總量相近，但后者的甲烷生成量和產(chǎn)甲烷濃度更高，說(shuō)明假單胞菌+白腐菌的預(yù)處理順序比假單胞菌+綠孢鏈霉菌更好；L-B-H組與L-J-H組相比，前者的總產(chǎn)氣量和甲烷生成量高于后者，但產(chǎn)甲烷濃度低于后者；B-J-H組和B-L-H組相比，后者的總產(chǎn)氣量和甲烷生成量高于前者，但產(chǎn)甲烷濃度低于前者。

圖4 煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后產(chǎn)氣甲烷濃度

產(chǎn)氣量較高的是L-B-H組和B-L-H組，甲烷生成量較高的也是L-B-H組和B-L-H組，但B-L-H組的甲烷濃度和甲烷生成量略高于L-B-H組；經(jīng)過(guò)對(duì)比J-L-H組和L-J-H組，發(fā)現(xiàn)L-J-H組的產(chǎn)氣量、甲烷生成量和產(chǎn)甲烷濃度都高于J-L-H組，表明綠孢鏈霉菌+假單胞菌的預(yù)處理順序產(chǎn)氣效果較好；經(jīng)過(guò)對(duì)比J-B-H組和B-J-H組，發(fā)現(xiàn)J-B-H組的產(chǎn)氣量、甲烷生成量和產(chǎn)甲烷濃度都高于B-J-H組，表明假單胞菌+白腐菌的預(yù)處理順序產(chǎn)氣效果較好。推測(cè)綠孢鏈霉菌和白腐菌對(duì)煤樣預(yù)處理產(chǎn)氣效果較好，并且加入順序?qū)Ξa(chǎn)氣總量影響不大，但先加入白腐菌比先加入綠孢鏈霉菌甲烷濃度高，J-B-H組的甲烷濃度最高，可達(dá)到51.36%，是原煤樣所產(chǎn)甲烷濃度的1.49倍。

2.2 Gompertz模型產(chǎn)氣擬合

Gompertz模型建立在特定生長(zhǎng)率和種群密度之間的指數(shù)關(guān)系上，該模型被修改為用細(xì)菌生長(zhǎng)期期間的指數(shù)生長(zhǎng)率和滯后期 持續(xù)時(shí)間來(lái)描述細(xì)胞密度的函數(shù)[26]。

實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)Gompertz方程進(jìn)行甲烷產(chǎn)生的模擬，對(duì)其產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)作出評(píng)估。

y=ae-e[-k(x-xc)]

(1)

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合的R2值作為Gompertz方程的參數(shù)來(lái)源，見(jiàn)表5，擬合結(jié)果如圖5所示。

表5 Gompertz方程的參數(shù)

圖5 微生物預(yù)處理煤樣模擬累計(jì)產(chǎn)氣量

由表5和圖5可知，Gompertz方程的擬合度較高。相比于原煤樣Y-H，菌種預(yù)處理煤樣的最大產(chǎn)氣甲烷率都有不同程度的增加，J-L-H組增長(zhǎng)29.35%，J-B-H組增長(zhǎng)103.07%，L-B-H組增長(zhǎng)50.77%，L-J-H組增長(zhǎng)81.05%，B-J-H組增長(zhǎng)64.80%，B-L-H組增長(zhǎng)98.10%；菌種預(yù)處理煤樣的累計(jì)產(chǎn)氣潛力相比于原煤樣也有一定的增加，J-L-H組增長(zhǎng)28.88%，J-B-H組增長(zhǎng)86.85%，L-B-H組增長(zhǎng)108.21%，L-J-H組增長(zhǎng)73.19%，B-J-H組增長(zhǎng)61.67%，B-L-H組增長(zhǎng)132.40%。由此可知，菌種預(yù)處理對(duì)煤制生物氣的產(chǎn)生具有明顯的促進(jìn)作用，可推斷煤樣經(jīng)菌種預(yù)處理后，在生物產(chǎn)氣過(guò)程中將具有更大的最大甲烷產(chǎn)率和累計(jì)產(chǎn)氣潛力。

3 結(jié) 論

1)不同菌種兩兩組合按照不同順序進(jìn)行預(yù)處理后，褐煤的產(chǎn)氣效果提高且各不相同，改進(jìn)的Gompertz方程擬合發(fā)現(xiàn)，不同菌種預(yù)處理后的褐煤將具有更大產(chǎn)氣潛力。

2)不同類型的微生物對(duì)煤的降解機(jī)理不同，為掌握更多微生物降解轉(zhuǎn)化煤炭的機(jī)理和規(guī)律，需要對(duì)降解產(chǎn)物的組成、理化性質(zhì)等特性進(jìn)行更全面的研究。