納米抗體的穩(wěn)定性及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究進(jìn)展*

何曉婷 董潔嫻 沈 興 王 弘 沈玉棟 徐振林**

（1）華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2）深圳清華大學(xué)研究院抗腫瘤創(chuàng)新藥物研發(fā)中心，深圳 518057）

駝?lì)悇?dòng)物體內(nèi)含有3種不同亞型的抗體，分別是常規(guī)抗體IgG1、天然缺失輕鏈及CH1恒定域的重鏈 抗 體（heavy?chain antibody，HCAb） IgG2與IgG3。克隆并表達(dá)重鏈抗體可變區(qū)可得到一個(gè)晶體結(jié)構(gòu)為直徑2.5 nm、長(zhǎng)4 nm 的橢球形單域抗體（圖1），其分子質(zhì)量小到只有免疫球蛋白的1/10（～15 ku）卻保留了全部的抗原結(jié)合能力，因此也被稱為納米抗體（nanobodies，Nbs）或VHH 抗體（variable domain of the heavy chain of heavy?chain antibody）［1］。與傳統(tǒng)抗體片段如抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab） 和單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv）相比，Nbs具有多個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，比如免疫原性弱、生產(chǎn)成本低、水溶性好、組織滲透性好、穩(wěn)定性與親和力較高等［2］。正是這些優(yōu)良特性使得Nbs在生物技術(shù)方面得到了非常廣泛的應(yīng)用［3?6］。

對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用而言，穩(wěn)定性是制約抗體應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。一方面抗體在其生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存及使用的過(guò)程中容易發(fā)生多種物理和化學(xué)降解，另一方面抗體的不穩(wěn)定性聚集會(huì)潛在地影響產(chǎn)量、保質(zhì)期和免疫原性等應(yīng)用參數(shù)［7］。因此抗體的穩(wěn)定性不僅會(huì)影響其生物學(xué)和生化評(píng)估，還會(huì)影響純化、儲(chǔ)存以及配方設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。在各種類(lèi)型的抗體中，Nbs顯示出極好的溶解性，并且對(duì)高溫和化學(xué)變性具有顯著的抗性，可以很大程度地克服傳統(tǒng)抗體片段scFv 的聚集和降解等穩(wěn)定性問(wèn)題，是許多應(yīng)用的理想選擇。

Fig.1 Structures and molecular mass of three different subtypes of antibodies and antibody fragments in camelid animals圖1 駱駝科動(dòng)物體內(nèi)3種不同亞型抗體與其抗體片段的結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量大小

雖然Nbs與傳統(tǒng)抗體相比在穩(wěn)定性方面普遍具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是不同的Nbs 穩(wěn)定性差異較大，主要與其特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)。已經(jīng)有很多研究者基于共有序列的分析基礎(chǔ)上對(duì)Nbs進(jìn)行改造來(lái)進(jìn)一步提高穩(wěn)定性，同時(shí)也鑒定出降低Nbs聚集的共有結(jié)構(gòu)特征［8?11］。本文在前人對(duì)Nbs的穩(wěn)定性表征以及結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上對(duì)其在高溫、有機(jī)溶劑以及其他極端條件下的穩(wěn)定性表現(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)性總結(jié)，并結(jié)合穩(wěn)定性數(shù)據(jù)和序列信息揭示了高度穩(wěn)定的Nbs具有較高的凈電荷表面、限制構(gòu)象遷移的二硫鍵、親水氨基酸取代較多的框架區(qū)、保守的疏水性口袋以及高度相互作用的結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)特征?；谶@些結(jié)構(gòu)特征，本文還討論了幾種Nbs 的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略，包括共有序列驅(qū)動(dòng)的序列修復(fù)、替換易于修飾的氨基酸、凈蛋白質(zhì)電荷的改變、非天然二硫鍵的引入和互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region，CDR）的移植。值得注意的是，這些策略不是絕對(duì)通用的，有可能以犧牲親和力或者產(chǎn)量為代價(jià)，因此在進(jìn)行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)化時(shí)要綜合考慮穩(wěn)定性、親和力以及表達(dá)量等多方面的因素。

1 納米抗體結(jié)構(gòu)

Nbs 與常規(guī)抗體可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH）的空間結(jié)構(gòu)相似，其框架是由9個(gè)反向平行的β 折疊片層（A?B?C?D?E?F?G?H?I）通過(guò)鏈間氫鍵和二硫鍵連接在一起組成（圖2a）［12］。在此結(jié)構(gòu)中，3 個(gè)CDR 分別連接BC、DE和HI 鏈，并靠N 端形成連續(xù)表面，與抗原表位的表面互補(bǔ)［13］。連接CDR之間的氨基酸序列相對(duì)比較保守，稱為骨架區(qū)（framework region，F(xiàn)R）。幾乎所有Nbs 結(jié)構(gòu)都含有一個(gè)連接FR1（C23）和FR3（C104）的保守二硫鍵，該鍵跨越蛋白質(zhì)的內(nèi)部，將兩個(gè)β鏈連接起來(lái)，增加了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［11］。部分Nbs 還含有一個(gè)可限制CDR 環(huán)柔韌性和構(gòu)象自由度的額外二硫鍵［14］。

傳統(tǒng)抗體VH 和VL 通過(guò)疏水作用力來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并共同構(gòu)成抗原結(jié)合區(qū)。與之相比，Nbs僅含有3 個(gè)可變區(qū)，盡管與抗原結(jié)合界面的表面積減少，但其仍具有較高的穩(wěn)定性與親和力。它主要通過(guò)以下方式來(lái)適應(yīng)輕鏈的缺失：a.大量的親水性氨基酸取代先前與CH1、VL 結(jié)合界面的脂肪族殘基（L12S、V42F/Y、G49E、L50R/C、W52G/L），且部分FR2被拉伸扭轉(zhuǎn)的CDR3環(huán)覆蓋，避免與外界水環(huán)境的接觸［12，15］，從而防止Nbs 的二聚化，其CDR3 環(huán) 越 長(zhǎng)，Nbs 越 穩(wěn) 定［7，16?17］。另 外 還 可 在CDR3 末端形成疏水核心，有利于穩(wěn)定Nbs 的折疊結(jié)構(gòu)域［18］。b.Nbs 的CDR1 和CDR3 普遍比VH 的長(zhǎng)（圖2b），潛在地增加了互補(bǔ)位構(gòu)象的多樣性，從而以高度的形狀表面互補(bǔ)性與相應(yīng)的抗原結(jié)合，一定程度上彌補(bǔ)了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降以及因尺寸小而導(dǎo)致的潛在序列多樣性降低［19］。

Fig.2 Structure of Nbs圖2 Nbs的結(jié)構(gòu)

2 穩(wěn)定性表征

抗體的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的全面表征對(duì)于設(shè)計(jì)穩(wěn)定的抗體制劑以實(shí)現(xiàn)所需的功效和保質(zhì)期至關(guān)重要。在抗體的研究、生產(chǎn)與應(yīng)用中，誘導(dǎo)變性因素有很多，包括溫度、有機(jī)溶劑、壓力、化學(xué)試劑、酸堿環(huán)境以及蛋白酶等，可以基于這些因素采用互補(bǔ)或獨(dú)立的方法來(lái)表征Nbs的穩(wěn)定性。

2.1 熱穩(wěn)定性

Nbs的一個(gè)固有特性是其熱穩(wěn)定性，包括出色的熱展開(kāi)抗性以及變性后重新折疊的能力。部分Nbs可以在-20℃、4℃條件下保存幾個(gè)月，甚至在37℃條件下溫育幾個(gè)月到一年也不會(huì)丟失其抗原結(jié)合特性［8，20］，這種長(zhǎng)期穩(wěn)定性使其能在室溫下運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用。當(dāng)溫度逐漸升高時(shí)，抗體會(huì)趨于熱變性展開(kāi)，一般使用解鏈溫度（Tm）推斷抗體的展開(kāi)傾向。Nbs 的Tm覆蓋了50～80°C 的廣泛范圍，普遍顯示出對(duì)熱誘導(dǎo)具有較高的抵抗力［21］?？蛊咸亚蚓c毒素B的Nb A3是一個(gè)比較經(jīng)典的例子，其Tm高達(dá)85℃，是迄今為止報(bào)道的最高紀(jì)錄［22］。這種熱展開(kāi)抗性使得Nbs 可以應(yīng)用于相對(duì)較高的溫度中，比如在50℃條件下對(duì)Nb進(jìn)行放射性標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)［23］。

Fab和scFv等常規(guī)抗體片段的Tm測(cè)得值范圍基本與Nbs相似，說(shuō)明Nbs和常規(guī)抗體片段可能顯示出相當(dāng)?shù)臒崞胶夥€(wěn)定性［24］，但是使Nbs 區(qū)別于常規(guī)抗體的主要標(biāo)志是其在極端溫度下的可逆性［25?26］。這種可逆性可以通過(guò)檢測(cè)高溫孵育一段時(shí)間后Nbs 的活性來(lái)進(jìn)行表征。對(duì)部分已報(bào)道的Nbs 免疫分析文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)大部分Nbs 在85℃高溫長(zhǎng)時(shí)間處理后仍可保持結(jié)合活性，而其他常規(guī)抗體則不可逆地失活［27?38］（表1）。例如，抗咖啡因Nb可在90°C的溫度孵育后保留90%的活性，但其單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）在70°C 孵育后會(huì)失活［28］。這種耐高溫咖啡因Nb在一次性側(cè)向流動(dòng)裝置的應(yīng)用中已獲得專利，可用于監(jiān)測(cè)熱飲料中的咖啡因［39］。同樣地，針對(duì)黃曲霉毒素的Nb 以及抗獨(dú)特型抗體（anti?idiotype antibody，Aid）耐熱性也優(yōu)于常規(guī)抗體，在高溫條件下短時(shí)間孵育后其多克隆抗體（polyclonal antibody，pAb）與單克隆抗體的結(jié)合活性僅保留20%甚至完全喪失，但在相同溫度條件下孵育20 min甚至1 h后Nbs仍具有高達(dá)40%～80%的結(jié)合活性［34，36，38］，這使其可用于涉及高溫過(guò)程的黃曲霉毒素檢測(cè)，比如需要巴氏滅菌的乳制品等?？偠灾?，這些特性使Nbs在熱變性的復(fù)雜條件下比傳統(tǒng)抗體具有更廣泛的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

2.2 有機(jī)溶劑耐受性

在開(kāi)發(fā)用于親脂分析物的免疫分析方法時(shí)，一般采用有機(jī)溶劑對(duì)分析物進(jìn)行充分提取，但是有機(jī)溶劑會(huì)影響抗體的活性，因而在前處理步驟中需要進(jìn)行蒸發(fā)復(fù)溶或者高倍比稀釋來(lái)避免有機(jī)溶劑的影響。優(yōu)選有機(jī)溶劑耐受性較高的抗體可以省去蒸發(fā)復(fù)溶的步驟或避免高倍數(shù)稀釋導(dǎo)致分析靈敏度的下降。對(duì)部分Nbs的有機(jī)溶劑耐受性評(píng)估進(jìn)行總結(jié)發(fā)現(xiàn)大部分Nbs 可耐受較高濃度的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或二甲基亞砜［27，34，37，40?43］（表2），而這些溶劑是提取高度親脂性分析物的首選溶劑。例如，從食品基質(zhì)中提取赭曲霉毒素A（OTA）需要用到甲醇，但是甲醇不僅會(huì)影響了OTA 與抗體的相互作用，還會(huì)抑制免疫測(cè)定中的二抗活性［44?45］。在20%的甲醇溶液中，抗OTA的Nb在測(cè)定時(shí)僅稀釋2.5倍即可消除樣品基質(zhì)干擾，但是其mAb測(cè)定需要稀釋30 倍以上才能消除，表明了Nbs 比傳統(tǒng)抗體對(duì)樣品基質(zhì)干擾有更高的抵抗力［37］。當(dāng)高度親脂性的黃曲霉毒素作為目標(biāo)分析物時(shí)，Nb 能在80%的甲醇溶液中保持100%的結(jié)合能力，而其mAb 在相同條件下則會(huì)失去50%的活性［34］。這種耐有機(jī)溶劑特性不僅有利于檢測(cè)需要從樣品中萃取的親脂性分析物，還可以使其應(yīng)用于需要較少稀釋的親和柱開(kāi)發(fā)［34］。

Table 1 Comparison of heat resistance between Nbs and conventional antibody表1 Nbs與常規(guī)抗體耐熱性的比較

Table 2 Tolerance of Nbs in different organic solutions表2 Nbs在不同有機(jī)溶液中的耐受性

2.3 壓力耐受性

在壓力耐受性方面，Dumoulin等［24］報(bào)告了針對(duì)人溶菌酶與偶氮染料RR6的Nbs在大于400 MPa的壓力條件下才會(huì)使其變性展開(kāi)，說(shuō)明了Nb 在極端壓力條件下的穩(wěn)定性。另外，在較低的壓力條件（約50～250 MPa）下可以加速解離非共價(jià)蛋白化合物，因此可在這個(gè)壓力范圍內(nèi)分離抗原?Nbs 復(fù)合物而不會(huì)破壞抗體。該策略可用于免疫親和分離，在受控的壓力增加后從免疫吸附劑中洗脫特異性結(jié)合的抗體。此外，這種可耐受極端壓力以及小體積和高溶解的特性還有利于Nbs開(kāi)發(fā)為霧化吸入制劑用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療。比如現(xiàn)階段已經(jīng)進(jìn)入臨床II期研究的三聚體Nb ALX?0171可通過(guò)氣溶膠遞送方式有效降低住院嬰兒的呼吸道合胞病毒載量［46］。同為三聚體Nb的PiN?21也成功通過(guò)噴霧給藥的方式以超低劑量預(yù)防并治療了倉(cāng)鼠動(dòng)物模型中的SARS?CoV?2冠狀病毒［47］。

2.4 化學(xué)試劑耐受性

一般化學(xué)變性劑有鹽酸弧、尿素、硫氰酸銨溶液等。除了壓力穩(wěn)定性測(cè)試，Dumoulin等［24］還探究了Nbs的化學(xué)誘導(dǎo)展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明Nbs的鹽酸弧、尿素變性濃度分別在2.3～3.3 mol/L 和高于6 mol/L 的范圍，明顯高于常規(guī)抗體scFv 片段（1～2 mol/L和2～3 mol/L）。與之類(lèi)似，針對(duì)hCG與RR6 的Nbs 所需的變性硫氰酸銨濃度也比其mAb高，其中最穩(wěn)定的Nb在4 mol/L硫氰酸銨溶液中僅損失20%的生物活性［27，48］。另外，在洗發(fā)劑存在條件下分離出的Nb 不僅可以在含有高濃度表面活性劑的洗發(fā)水中穩(wěn)定結(jié)合抗原馬拉色菌，在高濃度的尿素與鹽酸胍條件下也保持穩(wěn)定，可將該Nb 與洗發(fā)劑混合使用來(lái)防止頭皮屑［48］。但是并非所有化學(xué)變性劑對(duì)抗體反應(yīng)的影響都是消極的，比如抗李斯特菌Nb 在高尿素濃度下會(huì)提高抗原結(jié)合力，表明尿素有助于部分Nbs的重新折疊［49］。

2.5 極端pH耐受性

Nbs在不同pH值條件下也具有相似的穩(wěn)定性。比如，Wang 等［41］報(bào)道的抗四溴雙酚A 的Nb 抗體在pH 值為7.4～10 之間非常穩(wěn)定。同樣地，針對(duì)李斯特菌的Nb在pH為2及12的酸堿極端條件下孵育過(guò)夜后仍能保留至少30%的活性［49］。另外，酸堿性條件的變化對(duì)抗皮質(zhì)醇Nb 的抗原結(jié)合力也不會(huì)有明顯的影響，使得該Nb 抗體在微流體實(shí)驗(yàn)中具有受測(cè)試條件可變性影響較小的優(yōu)勢(shì)［9］。

2.6 蛋白酶抗性

部分Nbs還具有較強(qiáng)的蛋白酶抗性，可抵抗胃腸道中的蛋白酶解，適于用作口服給藥的治療劑。通過(guò)DNA改組和隨機(jī)誘變得到的穩(wěn)定性Nb可在腸液或胃液培養(yǎng)后仍分別保持90%和41%的活性［50］。在蛋白酶壓力下淘選出來(lái)的Nb 也具有優(yōu)秀的蛋白酶抗性，能顯著減少雞胃腸道中的空腸彎曲桿菌［51］，可作為一種替代抗生素的潛在飼料添加劑加以推廣應(yīng)用。此外，這種可規(guī)避蛋白酶解的特性還有利于開(kāi)發(fā)靶向細(xì)胞內(nèi)抗原的功能性重組抗體Nbs，使其成為對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)病原體或治療神經(jīng)退行性疾病的新型治療劑［52］。

3 穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

Nbs的小分子和單域?qū)傩再x予了其比常規(guī)抗體更為穩(wěn)定的特性，然而并非所有的Nbs都具有很好的熱穩(wěn)定性與化學(xué)穩(wěn)定性。在以往研究的多個(gè)Nbs中，大約有2/3 的Nbs 在65℃處理后發(fā)生了不可逆的聚集，但是部分Nbs 在90℃高溫處理后仍具有90%的活性［7］。這些穩(wěn)定性差異的根本原因在于Nbs特殊結(jié)構(gòu)的差異，包括氨基酸序列、二硫鍵的數(shù)量與位置、結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象等。

3.1 氨基酸

3.1.1 氨基酸的化學(xué)修飾

盡管Nbs可以通過(guò)原核生物進(jìn)行大量表達(dá)，沒(méi)有翻譯后修飾的過(guò)程，但是在抗體儲(chǔ)存、生產(chǎn)與應(yīng)用過(guò)程中的一些脅迫條件容易使抗體的一些氨基酸發(fā)生化學(xué)修飾。其中天冬氨酸（Asn）與谷氨酰胺（Gln）的脫酰胺反應(yīng)是較為重要的一種化學(xué)修飾，以Asn的脫酰胺更為普遍。這些化學(xué)修飾的積累會(huì)改變抗體的局部疏水性以及空間結(jié)構(gòu)從而影響其生物活性，其中抗體CDR 區(qū)的脫酰胺作用還可能會(huì)導(dǎo)致抗原結(jié)合功能的喪失。Akazawa?Ogawa 等［8］還通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了化學(xué)修飾是導(dǎo)致Nbs熱誘導(dǎo)不可逆變性的主要驅(qū)動(dòng)力，其Asn殘基的化學(xué)修飾會(huì)改變抗體的范德華相互作用和天然結(jié)構(gòu)的氫鍵，從而導(dǎo)致Nbs的穩(wěn)定性和折疊能力發(fā)生變化。除了Asn修飾，熱誘導(dǎo)還會(huì)引起半胱氨酸（Cys）的化學(xué)修飾與二硫鍵的交換。研究表明對(duì)野生型抗hCG Nb進(jìn)行熱處理，Cys的修飾會(huì)導(dǎo)致巰基數(shù)量的減少以及Cys殘基周?chē)臄嗔眩@可能是具有單個(gè)二硫鍵的Nbs 變性的原因［53］。這些易于發(fā)生化學(xué)修飾的氨基酸是影響Nbs穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸，可能會(huì)引起抗體變性后折疊能力的逐漸喪失。

3.1.2 氨基酸的電荷

增加多肽鏈的凈電荷會(huì)增強(qiáng)溶解度并導(dǎo)致未折疊狀態(tài)的分子間排斥，提高抗體對(duì)聚集的抵抗力［54］。與VH 抗體相比，D62、K65、R67、R72、K76和E89在Nbs結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)得更頻繁，這些帶電荷殘基的普遍使用增加了電荷排斥，降低了Nbs聚集的傾向，使得Nbs蛋白可逆折疊、熱穩(wěn)定性和可溶性的性質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)抗體［17，19］。據(jù)報(bào)道［55］，具有抗聚集特性的VHs 與Nbs 的等電點(diǎn)pI 多傾向于酸性，這表明含有大量負(fù)電荷殘基可能是Nbs穩(wěn)定性和溶解性進(jìn)化的內(nèi)在因素。此外，Nbs序列中一些保守性的帶正電荷殘基可增強(qiáng)與介質(zhì)中存在的帶負(fù)電荷分子的靜電相互作用，比如皮質(zhì)醇分子被其N(xiāo)b中幾個(gè)帶正電荷的殘基緊密包圍，增加了Nb在惡劣環(huán)境中與抗原的結(jié)合穩(wěn)定性［56］。又比如與糠秕馬拉色菌結(jié)合的Nb 序列中帶正電荷的殘基（R/K44）對(duì)于Nb 在高pH、洗發(fā)劑、尿素和鹽酸胍等條件下與真菌的結(jié)合至關(guān)重要［48］。以上表明具有高穩(wěn)定性的Nbs趨于含有更多凈電荷，尤其含有更多帶負(fù)電荷的氨基酸，而結(jié)構(gòu)中帶正電的殘基可通過(guò)靜電作用來(lái)促進(jìn)抗原與抗體之間的穩(wěn)定性結(jié)合。

3.2 二硫鍵

二硫鍵在分泌蛋白的折疊和穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道［9，57］，使用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)Nbs時(shí)，在還原性細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生Nbs 的Tm要比在周質(zhì)的氧化環(huán)境中產(chǎn)生的Nbs低得多，這種穩(wěn)定性差異主要與二硫鍵的形成有關(guān)［21，58］。在氧化環(huán)境中，Cys殘基的成對(duì)氧化將二硫鍵引入多肽鏈中，通過(guò)約束蛋白質(zhì)的未折疊構(gòu)象來(lái)提高折疊結(jié)構(gòu)域的機(jī)械穩(wěn)定性及構(gòu)象穩(wěn)定性［53，59?60］。在Nbs結(jié)構(gòu)中，大多會(huì)出現(xiàn)1個(gè)及以上的二硫鍵，包括連接FR1（C23）和FR3（C104）的保守二硫鍵以及連接CDR3與其他結(jié)構(gòu)域的額外二硫鍵，這些二硫鍵是固定Nbs三級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一。

3.2.1 保守二硫鍵

Nbs的穩(wěn)定性高度依賴于這個(gè)幾乎所有Nbs結(jié)構(gòu)共有的保守二硫鍵。該域內(nèi)二硫鍵埋藏在Nbs折疊域的疏水核內(nèi)部，將兩個(gè)β折疊連接在一起，使Nbs 肽鏈的空間結(jié)構(gòu)更為緊密［60］。通過(guò)定點(diǎn)誘變除去野生型Nbs的天然保守二硫鍵可以顯著降低其Tm（15～25°C）［9，53，59，61］，表明了該鍵是影響Nbs平衡熱力學(xué)穩(wěn)定性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。但是該鍵不是Nbs結(jié)構(gòu)與功能所必需的，如果Nbs具有較強(qiáng)的固有穩(wěn)定性或已通過(guò)蛋白質(zhì)工程進(jìn)行穩(wěn)定性改造，則該鍵的缺失與替換不會(huì)影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合能力［60］。比如衍生自單峰駱駝的通用Nbs 框架cAbBCII10在去除保守的二硫鍵后仍具有良好的表達(dá)水平與穩(wěn)定性［62］。此外，還有文獻(xiàn)報(bào)道了部分無(wú)二硫鍵的Nbs突變體可以折疊成原生結(jié)構(gòu)，保留其抗原結(jié)合能力，也不會(huì)影響其抗體抗原結(jié)合復(fù)合物的剛性［53，59，61，63］。

3.2.2 額外二硫鍵

除了保守二硫鍵，部分Nbs還含有一個(gè)可以穩(wěn)定可變區(qū)空間構(gòu)象的額外二硫鍵［64］。在研究中發(fā)現(xiàn)，在兩種同源Nbs中，含有雙二硫鍵的Nbs要比僅含有保守二硫鍵的Nbs具有更高的熱穩(wěn)定性與構(gòu)象穩(wěn)定性［59］。同樣地，對(duì)大量的Nbs 序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)具有額外二硫鍵的Nbs 的Tm值平均會(huì)高5.2℃［65］。這些額外的二硫鍵約束并穩(wěn)定增大的CDR3環(huán)，限制構(gòu)象遷移并防止其熱誘導(dǎo)聚集，提高了其構(gòu)象穩(wěn)定性［11?12，14，66］。此外，額外二硫鍵會(huì)通過(guò)降低Nbs的聚集速率來(lái)減少不可逆聚集，提高了動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性［20］。主流觀點(diǎn)認(rèn)為這個(gè)額外二硫鍵還可以通過(guò)降低其與抗原結(jié)合的熵?fù)p失來(lái)提高結(jié)合親和力［14］。但是，Mendoza等［17］對(duì)此進(jìn)行了反駁，他們分離出一種對(duì)親和力沒(méi)有明顯變化的二硫鍵突變體。由此可見(jiàn)，這個(gè)額外的二硫鍵可能已經(jīng)進(jìn)化成為穩(wěn)定Nbs結(jié)構(gòu)域的生物物理特性，在特定情況下可在抗原結(jié)合中發(fā)揮一定的作用，但是這種作用不具有廣泛的普遍性。

根據(jù)編碼Cys的位置可以將其額外二硫鍵大致分為3 種不同類(lèi)型（圖3），分別是連接CDR3 與CDR1 或CDR2/FR2 邊界的環(huán)間二硫鍵以及CDR3的環(huán)內(nèi)二硫鍵［12］。不同駝?lì)愒陬~外二硫鍵的位置與豐度上有很大的差異。據(jù)報(bào)道［17］，駱駝中額外二硫鍵的出現(xiàn)頻率約30%，比羊駝（～12%）和美洲駝（～3.5%）高。這是因?yàn)榇蟛糠盅蝰凬bs 因其CDR3 環(huán)相對(duì)較短而不存在這種額外的二硫鍵［67］，只有小部分羊駝Nbs 在FR2（C55）和CDR3 間存在額外增多的Cys［66，68］。另外，美洲駝抗體僅一個(gè)特殊亞科VHH3 含有延伸的CDR3，該CDR3 被一個(gè)位于FR2（C50）的二硫鍵連接，但是這個(gè)亞科的Nbs很少被分離出來(lái)，因此文獻(xiàn)中報(bào)道的絕大多數(shù)來(lái)自美洲駝的Nbs 僅在保守位置出現(xiàn)二硫鍵［11，69］。而駱駝Nbs 中延伸的CDR3 則一般是被位于CDR1（C31/33/34）的二硫鍵約束［11，70］，其另一個(gè)Cys 出現(xiàn)在位置FR2（C50）或CDR3 上的Nbs 也曾見(jiàn)于報(bào)道［67，71］。這說(shuō)明了這個(gè)額外的二硫鍵不是維持其穩(wěn)定性的必要結(jié)構(gòu)，具有不同生態(tài)適應(yīng)性的駝種Nbs根據(jù)其序列及其長(zhǎng)度的差異采用不同數(shù)量以及不同位置的二硫鍵來(lái)豐富其穩(wěn)定性機(jī)制。

Fig.3 Three different types of additional disulfide bonds in Nbs圖3 Nbs中三種不同類(lèi)型的額外二硫鍵

根據(jù)以上分析可以看出在CDR1、FR2、CDR2區(qū)域出現(xiàn)的Cys 一般出現(xiàn)在保守位置上，而CDR3的Cys位置是隨機(jī)的，這是因?yàn)榍罢呤怯神橊劦姆N系基因編碼，而CDR3中第二個(gè)Cys密碼子出現(xiàn)在V?D?J重排后或之后的體細(xì)胞超突變［72］。大量序列分析發(fā)現(xiàn)，Nbs的Cys總是成對(duì)出現(xiàn)的，這是由于Nbs 在B 細(xì)胞受體成熟期間進(jìn)行陽(yáng)性選擇的結(jié)果［14，59，73］。含有未配對(duì)Cys 的Nbs 容易自發(fā)氧化形成二聚體而失去抗原結(jié)合能力，即便這種克隆被成功分離出來(lái)也會(huì)因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存而導(dǎo)致二聚化［74］。但是，存在一種特殊情況允許這種單Cys的存在，最近報(bào)告了一種含有金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的Nb，該Nb 結(jié)構(gòu)中沒(méi)有配對(duì)的Cys 與其他3 個(gè)殘基形成了一個(gè)與金屬離子Zn2+配位的幾何結(jié)構(gòu)，其中Zn2+代替二硫鍵充當(dāng)CDR1 和CDR3 環(huán)之間的橋，為CDR3環(huán)構(gòu)象提供了更大的剛性［72］。

3.3 結(jié)構(gòu)域

3.3.1 單體結(jié)構(gòu)

對(duì)于Nbs來(lái)說(shuō)，其小分子和單域?qū)傩允瞧淠褪軠囟鹊闹饕獧C(jī)制。已經(jīng)證明了同源的常規(guī)IgG1抗體、HCAb、Nbs片段熱穩(wěn)定性依次遞增［26，75］，這可能由于Nbs只有1個(gè)免疫球蛋白折疊域，沒(méi)有輕鏈、CH1、鉸鏈區(qū)以及Fc片段，其分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)復(fù)雜性要比分別具有6與12個(gè)免疫球蛋白折疊域的HcAb、IgG1抗體要低。在應(yīng)對(duì)高溫等變性條件時(shí)，理論上具有較少折疊形式的蛋白質(zhì)片段更容易重新折疊從而具有更高的耐受性［76］。此外，常規(guī)抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)很容易形成增加聚集傾向的β 折疊結(jié)構(gòu)，且其重輕鏈?zhǔn)杷Y(jié)合界面的暴露在不可逆聚集中起著核心作用，這些結(jié)構(gòu)特征都導(dǎo)致了駱駝血清中的重輕鏈抗體IgG1在熱處理后其結(jié)合活性嚴(yán)重?fù)p失［26，77］。在構(gòu)建scFv文庫(kù)時(shí)，VH與VL的結(jié)合容易出現(xiàn)錯(cuò)配，導(dǎo)致其在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)不佳，出現(xiàn)無(wú)法識(shí)別抗原以及結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等問(wèn)題［20］。相比之下，只含1個(gè)結(jié)構(gòu)域的Nbs不受重鏈與輕鏈配對(duì)的限制，避免了這種結(jié)構(gòu)解離導(dǎo)致的不可逆聚集以及重組表達(dá)的錯(cuò)配，大大提高其在變性后或者表達(dá)的折疊效率，從而提高了理化穩(wěn)定性。

3.3.2 FR框架區(qū)

CDR 主要決定了Nbs 對(duì)靶標(biāo)的特異性和親和力，但是針對(duì)化學(xué)變性劑、熱、蛋白酶和極端pH的穩(wěn)定性主要取決于結(jié)構(gòu)域中保守的FR 序列。在傳統(tǒng)抗體中，F(xiàn)R 區(qū)含有大量的疏水殘基（L12、V42、G49、L50、W52、Y95和W117），介導(dǎo)了重鏈與CH1、輕鏈的結(jié)合［19，67，78］。當(dāng)其孵育溫度高于Tm時(shí)，這個(gè)疏水界面會(huì)隨著常規(guī)抗體天然結(jié)構(gòu)的解離而暴露在外，可能引起分子間的相互作用，導(dǎo)致不良的非特異性聚集與沉淀［24］。Nbs 的聚集需要蛋白質(zhì)展開(kāi)，從而強(qiáng)調(diào)了天然Nbs 的高溶解度［7］。在駱駝科動(dòng)物Nbs中，為防止重鏈聚集，框架區(qū)內(nèi)的一些殘基突變?yōu)楦H水的殘基（L12S、G49E、L50R和W117R/G），而其他突變（V42F和W52F/G）則被較長(zhǎng)的CDR3 環(huán)覆蓋從而屏蔽了溶劑［19，67，78?79］。特別地，V42F 突變可以填充VH 中由Y95、W117 和CDR3 的側(cè)鏈形成的疏水口袋，而Nbs中的W117R取代允許F42較大的側(cè)鏈向Y95和R117轉(zhuǎn)移［80］，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水堆積，從而增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［81］。除此，F(xiàn)R1 的5V 和6E 殘基是很多穩(wěn)定Nbs的共有氨基酸序列，已經(jīng)成為引入負(fù)突變工程化的通用殘基［82］。此外，對(duì)人VH片段的氨基酸進(jìn)行“駱駝化”突變，其熔點(diǎn)高于野生VH片段的實(shí)驗(yàn)也證明了Nbs框架序列中的特定氨基酸有助于提高溫度穩(wěn)定性［83］。以上研究表明，特定的氨基酸取代和重新定向的側(cè)鏈可以重塑Nbs結(jié)構(gòu)域并增加其親水性。

3.3.3 CDR超變區(qū)

Nbs與常規(guī)抗體的另一個(gè)區(qū)別特征是明顯延伸的CDR3 環(huán)。序列分析驗(yàn)證了Nbs 的CDR3 平均長(zhǎng)度比常規(guī)抗體多5 個(gè)氨基酸［84］，尤其是單峰駱駝具有更長(zhǎng)的CDR3環(huán)［85］。這些長(zhǎng)CDR3環(huán)可以增加抗體與抗原的接觸面積，在一定程度上彌補(bǔ)輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降的不足［69］。理論上，這個(gè)增大的CDR3環(huán)表明其具有更大的柔韌性，這可能會(huì)降低結(jié)合親和力和抗體穩(wěn)定性。但是在實(shí)際的研究中發(fā)現(xiàn)，CDR3長(zhǎng)度和熱穩(wěn)定性之間并沒(méi)有預(yù)期的負(fù)相關(guān)性，而是隨著CDR3長(zhǎng)度的增加，穩(wěn)定性略有增加的趨勢(shì)更加明顯［7］。較為合理的解釋是長(zhǎng)的CDR3環(huán)更有利于通過(guò)與殘基的相互作用屏蔽VH 與VL 結(jié)合的疏水界面，增加其親水性并防止二聚化。同時(shí)，這種非共價(jià)相互作用也穩(wěn)定了這個(gè)長(zhǎng)CDR3環(huán)，補(bǔ)償了長(zhǎng)環(huán)CDR3區(qū)可能引起的不穩(wěn)定效應(yīng)。

此外，CDR3 環(huán)N/C 端附近的Y93、F/Y117 、W118 等保守氨基酸形成的疏水簇也有助于穩(wěn)定CDR3 環(huán)的構(gòu)象［18，67］。因此，CDR 區(qū)殘基可以與FR 區(qū)殘基相互作用，并且這種相互作用具有中和潛在聚集點(diǎn)和對(duì)互補(bǔ)位施加結(jié)構(gòu)剛性的雙重作用，其穩(wěn)定性與CDR3長(zhǎng)度正相關(guān)，通過(guò)二硫鍵或者其他非共價(jià)相互作用穩(wěn)定長(zhǎng)CDR3環(huán)可進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定效應(yīng)。

4 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性優(yōu)化

Nbs穩(wěn)定性信息與結(jié)構(gòu)信息的合并揭示了高度穩(wěn)定納米抗體所特有的結(jié)構(gòu)特征?；谶@些結(jié)構(gòu)特征可以對(duì)Nbs采用合理的設(shè)計(jì)方法來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性優(yōu)化，包括共有序列驅(qū)動(dòng)的序列修復(fù)、替換易于修飾的氨基酸、凈蛋白質(zhì)電荷的改變、非天然二硫鍵的引入和CDR 的移植。通過(guò)這些策略開(kāi)發(fā)出在極端條件下仍能保持結(jié)合能力的穩(wěn)定Nbs，從而為生物技術(shù)、檢測(cè)、診斷和治療應(yīng)用提供高性能的試劑。

4.1 點(diǎn)突變

4.1.1 基于共有序列的誘變

同一個(gè)對(duì)象可以篩出多株序列不同的Nbs，這些序列的FR 區(qū)的某些位置基本保守不變，如果這些保守殘基發(fā)生變化可能會(huì)導(dǎo)致同源Nbs 的Tm出現(xiàn)重大差異［86?87］，當(dāng)恢復(fù)這些保守序列有可能導(dǎo)致Tm的增加。例如，一株抗蓖麻毒蛋白Nb 在第117位殘基發(fā)生偏差從共有序列Trp變?yōu)锳rg，恢復(fù)此突變可使其Tm增加而不會(huì)降低其抗原親和力以及產(chǎn)量［10］。但是該方法也有例外，比如有研究者通過(guò)I122T 突變來(lái)恢復(fù)抗肉毒桿菌神經(jīng)毒素Nb E7在位置122的共有序列IIe，雖然可以提高產(chǎn)量，但是突變體Tm并沒(méi)有發(fā)生變化［76］。雖然該策略將穩(wěn)定的高概率歸因于蛋白質(zhì)家族特定序列位置上最常見(jiàn)的殘基，具有一定的物種依賴性與偶然性，但是可以作為一個(gè)穩(wěn)定性優(yōu)化的重要方向。

4.1.2 易修飾殘基的替換

對(duì)抗體序列中易受化學(xué)修飾的位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造也是其穩(wěn)定性優(yōu)化的重要方向之一。據(jù)報(bào)道［8］，用其他的氨基酸取代Nb 序列中所有易于修飾的Asn 殘基（N57S/N82S/N92T）所得到的突變體比野生型Nb 更能抵抗熱誘導(dǎo)的不可逆變性。此外，替換未配對(duì)的Cys不僅可以提高產(chǎn)量，還可能提高其Tm［10］。Asn和Cys的修飾是引起Nbs變性的關(guān)鍵因素之一，替換這些易于修飾的殘基有利于提高Nbs的耐熱性。

4.1.3 負(fù)突變殘基的引入

通過(guò)用帶電殘基替換暴露于溶劑的殘基來(lái)增加蛋白質(zhì)的凈電荷，可以顯著降低其聚集特性。由于穩(wěn)定性Nbs的等電點(diǎn)傾向于酸性，因此在某些Nbs的序列中引入負(fù)電荷突變或者在其C端引入一段負(fù)電荷序列以降低等電點(diǎn)，不僅可以提高產(chǎn)量，還可以提高溶解度、熔解溫度與抗聚集能力，改善變性后的折疊，利于Nbs 在高濃度條件下的儲(chǔ)存［10，65，76，82］。添加電荷可以防止聚集，但也會(huì)破壞抗體的折疊狀態(tài)，選擇要突變的殘基要同時(shí)保留Nbs 天然結(jié)構(gòu)，在非抗原結(jié)合區(qū)的框架1 中引入負(fù)突變Q1E/D、K3Q、Q5V、A6E基本成為了優(yōu)先考慮的負(fù)突變位點(diǎn)［10，65，82，88］。

4.2 二硫鍵的工程化

在Nbs中進(jìn)行二硫鍵的工程化是提高其穩(wěn)定性最為廣泛使用的方法之一，大量文獻(xiàn)集中研究比較了引入不同數(shù)量與位置的Cys對(duì)Nbs的穩(wěn)定性和親和力的影響（表3）。在數(shù)量上，Saerens等［59］分別在3 個(gè)不同的Nbs 中通過(guò)突變獲得了含有0～3 個(gè)二硫鍵的突變體。實(shí)驗(yàn)表明，去除保守二硫鍵大多會(huì)導(dǎo)致其Tm的急劇下降，而引入一個(gè)工程化二硫鍵則基本可以提高其穩(wěn)定性，但是當(dāng)Cys 數(shù)量達(dá)到8個(gè)甚至10 個(gè)時(shí)則容易導(dǎo)致突變體形成無(wú)功能多聚體。此外，目前也鮮見(jiàn)具有多于4 個(gè)天然Cys 的Nbs 的報(bào)道，說(shuō)明過(guò)多Cys 容易導(dǎo)致二硫鍵的異常配對(duì)，無(wú)法形成正確穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在位置上，Hagihara等［9］首次使用Cys取代Nbs中的埋藏殘基A54（FR2）和I78（FR3），插入的二硫鍵在抗原親和力基本不變的情況下使其Tm提高了10°C。其中殘基A54 和I78 在Nbs 中高度保守，并跨越β 折疊之間的疏水內(nèi)部。隨后有不少研究人員相繼對(duì)不同抗體的相同位置進(jìn)行了突變，加入第2個(gè)二硫鍵的突變體可使其Tm增加4～20°C，甚至在多次加熱冷卻循環(huán)處理后仍保持接近100% 的結(jié)合能力［10?11，89］。此外，引入這個(gè)連接FR2與FR3的二硫鍵還可以在酸性pH 和存在化學(xué)變性劑的情況下提高Nbs熱穩(wěn)定性和蛋白酶抗性，使其具有更高的胃腸道穩(wěn)定性［51，89?91］。另外，也有學(xué)者比較了其他不同二硫鍵插入位點(diǎn)（C4～117、C36～110、C53～112以及C44～50）對(duì)其穩(wěn)定性的影響，但是發(fā)現(xiàn)盡管大部分突變體都可以提高親本的Tm，但卻犧牲了部分親和力、產(chǎn)量或者變性重折疊能力［11，92］。以上實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)蛋白質(zhì)工程在A54 和I78 處引入額外的二硫鍵已經(jīng)成為提高Nbs平衡熱力學(xué)穩(wěn)定性的通用方法。

Table 3 Disulfide bond engineering of Nbs表3 Nbs二硫鍵的工程化

通過(guò)定點(diǎn)誘變加入工程化的二硫鍵是穩(wěn)定Nbs的有效方法，但是此方法也會(huì)對(duì)其應(yīng)用性能產(chǎn)生一定的影響。a.在需要高溫長(zhǎng)時(shí)間孵育的應(yīng)用中，添加的額外二硫鍵甚至天然存在的二硫鍵可能會(huì)由于熱誘導(dǎo)的二硫鍵改組和Cys殘基的修飾，顯示出影響Nbs復(fù)性的能力［20?21，53］。b.在某些情況下，二硫鍵的引入會(huì)對(duì)親和力以及特異性產(chǎn)生難以預(yù)測(cè)的負(fù)面影響［59，90］。c.由于在折疊過(guò)程中可能形成錯(cuò)誤的二硫鍵，Nbs在大腸桿菌中的表達(dá)會(huì)受到二硫鍵的影響［14，21］。因此，在進(jìn)行抗體的二硫鍵工程化時(shí)應(yīng)該綜合考慮穩(wěn)定性、親和力與表達(dá)量等方面的影響。

4.3 CDR超變區(qū)的移植

由于部分Nbs序列高度保守，可以通過(guò)移植不太穩(wěn)定的抗原特異性Nb的CDR到一些高度穩(wěn)定的Nbs 框架上以獲得具有環(huán)供體Nb 的抗原結(jié)合特性與支架受體Nb的穩(wěn)定性的嵌合體，這種CDR移植技術(shù)已用于常規(guī)抗體片段的穩(wěn)定改造［94?95］。在Nbs的應(yīng)用中，已經(jīng)報(bào)道了多個(gè)可以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)功能的保守框架，例如人源化框架cAbBCII10［96］、hs2dAb［97］、C8WT［98］以及針對(duì)細(xì)菌表達(dá)優(yōu)化的人工設(shè)計(jì)CF支架［99］。其中框架cAbBCII10是一種具有較高構(gòu)象穩(wěn)定性的單峰駝通用框架，將家族2 Nbs 的CDR 移植到該框架上保留了CDR 供體抗原結(jié)合能力的同時(shí)顯示出了增加的穩(wěn)定性［62］。此外，Zabetakis 等［100］此前曾報(bào)道，將CDR2 從具有高熔點(diǎn)的抗葡萄球菌腸毒素B的Nb A3移植到具有低熔點(diǎn)的抗蓖麻蛋白Nb中可以使嵌合體克隆Tm提升15℃。雖然CDR 移植比較局限于Nbs 亞家族的限制［62］，且還可能導(dǎo)致Nbs 與靶標(biāo)結(jié)合能力的下降［100］，但是利用具有特定特性的支架進(jìn)行CDR超變區(qū)交換是一種嘗試增加抗體穩(wěn)定性的可行方法。

5 展 望

雖然目前已經(jīng)有很多研究者通過(guò)定點(diǎn)突變、引入二硫鍵等工程化的方法制備出很多相對(duì)親本更穩(wěn)定的Nbs，但是大多數(shù)的工程化是基于共有序列分析與經(jīng)驗(yàn)值的基礎(chǔ)上，鮮有報(bào)道涉及晶體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性分析，這可能導(dǎo)致得出的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)信息具有一定的片面性。蛋白質(zhì)晶體的制備與X?射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最直觀、準(zhǔn)確的技術(shù)，可以在分子水平上闡明分子間相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。未來(lái)的研究可以更多地綜合利用蛋白質(zhì)結(jié)晶、X?射線晶體結(jié)構(gòu)解析、分子動(dòng)力學(xué)等技術(shù)建立Nbs與抗原的三維空間結(jié)構(gòu)模型，明確重鏈抗體識(shí)別方式、關(guān)鍵氨基酸殘基、結(jié)合位點(diǎn)、作用力類(lèi)型等關(guān)鍵信息，全面探討Nbs的一級(jí)序列結(jié)構(gòu)、二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的關(guān)系與規(guī)律。鑒于Nbs在臨床應(yīng)用上取得的成果，未來(lái)Nbs在復(fù)雜基質(zhì)與環(huán)境的檢測(cè)等方面具有較為廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)行深入的系統(tǒng)研究。