藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子分析鑒定

寇呈熹，佟金泉，馬 瑞，孫 偉，薛哲勇*，麻鵬達(dá)*

藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子分析鑒定

寇呈熹1, 2，佟金泉3，馬 瑞4，孫 偉5，薛哲勇1, 2*，麻鵬達(dá)3*

1. 東北林業(yè)大學(xué) 東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 東北林業(yè)大學(xué) 黑龍江省植物天然活性物質(zhì)的合成與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 楊凌 712100 4. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130033 5. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 中藥鑒定與安全性評(píng)估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法鑒定藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族，并作初步分析。通過隱馬可夫模型從藜蘆轉(zhuǎn)錄組序列中篩選基因，并使用ExPASy、MEME等在線網(wǎng)站及MEGA、TBtools等軟件對(duì)藜蘆bHLH進(jìn)行理化性質(zhì)、保守基序等可視化分析。在藜蘆轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到72條bHLH轉(zhuǎn)錄因子，VnbHLH轉(zhuǎn)錄因子氨基酸數(shù)目為105～692，等電點(diǎn)介于4.69～11.47，相對(duì)分子質(zhì)量為11 071.2～77 795.3，亞細(xì)胞定位分析顯示VnbHLH均定位于細(xì)胞核中；系統(tǒng)發(fā)育分析將VnbHLH轉(zhuǎn)錄因子分為6個(gè)亞族，VnbHLH在不同組織中表達(dá)差異顯著，Vn_54312、Vn_14037在根中表達(dá)較高，推測(cè)其可能參與了藜蘆植物根部某些生物堿的合成。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了藥用植物藜蘆中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族，有助于下一步對(duì)藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族功能預(yù)測(cè)及驗(yàn)證。

藜蘆；轉(zhuǎn)錄組；bHLH轉(zhuǎn)錄因子；系統(tǒng)進(jìn)化；基因表達(dá)

藜蘆L.為百合科（Liliaeeae）多年生單子葉植物，全世界約有40種，分布于亞洲、北美和歐洲，中國(guó)約有17種，常見于高海拔、潮濕、酸性的土壤環(huán)境[1]。黎蘆植物的大部分組織均可供藥用，可內(nèi)服治療中風(fēng)痰壅、喉痹不通、癲癇、頭痛、黃疽、瘧疾、骨折[2-3]，外用治疥癬、滅蠅蛆[4-5]。其本品作為中醫(yī)藥物收載于《本草綱目》中已有一千多年歷史，在當(dāng)代仍作為涌吐風(fēng)痰藥物使用，但藜蘆自身被列為中藥配伍禁忌中的十八反[6]，在臨床應(yīng)用中存在一定限制。藜蘆屬植物的化學(xué)活性成分包括甾體生物堿類、肽類、黃酮類等，起主要作用的是甾體類生物堿。目前，已經(jīng)從藜蘆植物中分離出184種[1]甾體類生物堿，如環(huán)靶明、藜蘆胺、介藜蘆堿等，具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓、降血壓等多種藥理活性。

環(huán)靶明（環(huán)巴胺，11-去氧芥芬胺，cyclopamine）是藜蘆植物中的一種甾體類生物堿，主要存在于百合科黎蘆屬植物的根系中。環(huán)靶明的發(fā)現(xiàn)源于其致畸作用，20世紀(jì)中期，Keeler等[7]研究了美國(guó)愛達(dá)荷州（Idaho）高概率的羔羊頭部單眼畸形現(xiàn)象后，發(fā)現(xiàn)藜蘆屬植物加州藜蘆L.中的一種甾體類生物堿為致畸主要成分并確定了其結(jié)構(gòu)，即環(huán)靶明。直到20世紀(jì)90年代，環(huán)靶明才被發(fā)現(xiàn)對(duì)Hedgehog信號(hào)通路[8]有特定的抑制作用[9]，并從原理上解釋了它的致畸性。由于Hedgehog信號(hào)通路與多種腫瘤的生長(zhǎng)有關(guān)聯(lián)[10]，故環(huán)靶明可作為一種潛在的抗癌癥藥物。

作為第二大類轉(zhuǎn)錄因子，bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中。其家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、環(huán)境脅迫應(yīng)答中起調(diào)控作用[11]，由堿性螺旋-環(huán)-螺旋特征結(jié)構(gòu)而得名。有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究多以動(dòng)物為對(duì)象，而在植物中主要為水稻及擬南芥等少數(shù)植物。bHLH轉(zhuǎn)錄因子的主要結(jié)構(gòu)是一段貫穿真核生物生命的高度保守的肽序列，它為轉(zhuǎn)錄因子提供了2個(gè)關(guān)鍵的分子作用——DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄調(diào)控[12]。bHLH結(jié)構(gòu)域包含大約60個(gè)氨基酸，有2個(gè)功能不同的區(qū)域，基本區(qū)域和HLH[13]區(qū)域。堿基區(qū)有15個(gè)氨基酸長(zhǎng)，通常包括6個(gè)堿基殘基。它位于該結(jié)構(gòu)域的N端，功能為DNA結(jié)合基序[14]。HLH區(qū)包含2個(gè)兩親α螺旋，中間由一個(gè)變長(zhǎng)環(huán)區(qū)隔開。HLH區(qū)域作為二聚體區(qū)域，可以形成同型二聚體或異型二聚體。通過對(duì)擬南芥基因組序列的分析，共鑒定出162個(gè)編碼bHLH的基因，根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將其分為21個(gè)亞家族[15]。在水稻L.和大白菜var.Regel基因組中分別鑒定出167和230個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子[16-17]。它們分別被分為22亞科和24亞科。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，植物bHLH蛋白包含26個(gè)亞家族，到目前為止，大多數(shù)bHLH蛋白在擬南芥中已經(jīng)被鑒定出功能特征，它們的作用包括調(diào)節(jié)果實(shí)開裂、花藥和表皮細(xì)胞發(fā)育、激素信號(hào)和應(yīng)激反應(yīng)[18]。而目前對(duì)中藥植物藜蘆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子分析甚少，本實(shí)驗(yàn)將以藜蘆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族進(jìn)行分析鑒定，為進(jìn)一步藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

藜蘆植物樣品為2017年4月26日吉林省磐石市煙筒山鎮(zhèn)的海拔700 m山坡林下的苗期植株，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)薛哲勇教授鑒定為藜蘆L.，采集其根、莖和葉3個(gè)部位，并做3次生物學(xué)重復(fù)，備用。

2 方法

2.1 藜蘆二代、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得

將植物樣品進(jìn)行總RNA提取，以完成二代測(cè)序；將提取的總RNA進(jìn)行混合，以完成全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。其中二代測(cè)序由Illumina平臺(tái)完成，全長(zhǎng)測(cè)序由PacBio平臺(tái)完成。利用BUSCO對(duì)去冗余后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行完整性評(píng)估。

2.2 藜蘆bHLH基因家族鑒定

通過NCBI在線網(wǎng)站（https://www.ncbi. nlm.nih.gov）下載擬南芥bHLH序列。藜蘆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本課題組對(duì)藜蘆測(cè)序獲得。使用perl程序提取藜蘆所有蛋白序列，利用PlantTFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）網(wǎng)站進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。將預(yù)測(cè)獲得的藜蘆bHLH基因家族成員進(jìn)行篩選，去除重復(fù)轉(zhuǎn)錄本。在Pfam（http://pfam. xfam.org/）網(wǎng)站下載得到bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族隱馬可夫模型（PF00010），利用HMMER search搜索預(yù)測(cè)的藜蘆bHLH基因家族。冗余序列及無bHLH結(jié)構(gòu)域序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)完成，最終篩選到72個(gè)藜蘆bHLH基因家族成員。藜蘆bHLH蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及氨基酸數(shù)目等理化性質(zhì)利用ExPASy網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行分析。采用WoLF PSORT在線網(wǎng)站（http://www. gen- script.com/ wolfpsort.html），對(duì)藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

2.3 藜蘆bHLH蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及Motif和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEGA 7.0軟件內(nèi)置的Clustal W程序?qū)继JbHLH家族蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，將比對(duì)結(jié)果采用鄰接法（neigh-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行自舉評(píng)估（Bootstrap），重復(fù)1000次，缺失值處理方式為配對(duì)狀態(tài)刪除（pairwise deletion），其他參數(shù)使用默認(rèn)值[19]。通過Evolview在線工具（https://www.evolgenius.info/）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化[20]，運(yùn)用MEME（http://meme-suite. org/tools/meme）網(wǎng)站分析藜蘆bHLH家族蛋白的基序，基序數(shù)量為10，其余參數(shù)為默認(rèn)值[21]。

2.4 藜蘆bHLH蛋白組織表達(dá)模式分析

通過Illumina平臺(tái)對(duì)藜蘆的根、莖和葉3個(gè)組織進(jìn)行了二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過RSEM軟件[22]按照公式FPKM=cDNAFragments/{MappedFragments（Millions）?TranscriptLength（kb）}計(jì)算衡量出各個(gè)基因絕對(duì)表達(dá)量的FPKM值。其中cDNA Fragments表示比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的片段數(shù)目，即雙端Reads數(shù)目；Mapped Fragments（Millions）表示比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù)，以106為單位；TranscriptLength（kb）：轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度，以103個(gè)堿基為單位。對(duì)藜蘆bHLH成員基因表達(dá)量（FPKM）使用log2（FPKM）＋1對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化處理，利用TBtools繪制藜蘆bHLH表達(dá)模式圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 藜蘆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析

通過對(duì)藜蘆植物樣品的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得circular consensus（CCS）read 352 009條，其中全長(zhǎng)非嵌合（full length readsnon-chimeric，F(xiàn)LNC）序列308 650條。對(duì)全長(zhǎng)非嵌合序列進(jìn)行聚類得到一致序列93 217個(gè)，對(duì)一致序列進(jìn)行polish得到高質(zhì)量一致序列共90 756個(gè)，用二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)低質(zhì)量一致序列進(jìn)行校正，校正后與高質(zhì)量一致序列合并進(jìn)行去冗余分析得到54 048轉(zhuǎn)錄本序列。利用BUSCO對(duì)去冗余后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行完整性評(píng)估，使用OrthoDB作為參考數(shù)據(jù)庫(kù)，其完整覆蓋率（C，complete）達(dá)到植物基因庫(kù)的73.16%（圖1）。將全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組上傳到SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/sra），獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)（PRJNA734486）。

圖1 轉(zhuǎn)錄組完整性評(píng)估

3.2 藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定

通過2次HMMER search搜索，去除差異較大序列（1e-20）共計(jì)獲得80個(gè)注釋為bHLH的轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)過CDD和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證，去除冗余及未獲得結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證的8條序列，最終獲得72個(gè)具有典型bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員（表1）。將所得序列依次標(biāo)號(hào)為VnbHLH1～VnbHLH72，最長(zhǎng)的bHLH蛋白有692個(gè)氨基酸殘基（VnbHLH70），最短的有105個(gè)氨基酸殘基（VnbHLH60），等電點(diǎn)為4.69～11.47，相對(duì)分子質(zhì)量為11 071.2～77 795.3。72個(gè)VnbHLH蛋白均定位于細(xì)胞核，推測(cè)藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核發(fā)揮調(diào)控功能。

表1 藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族基本信息

Table 1 Basic information of Veratrum bHLH transcription factor gene family

編號(hào)序列名稱長(zhǎng)度/aa相對(duì)分子質(zhì)量等電點(diǎn)亞細(xì)胞定位 VnbHLH1Vn_1023150355 088 6.23細(xì)胞核 VnbHLH2Vn_1057250354 892 6.20細(xì)胞核 VnbHLH3Vn_1091650355 088 6.23細(xì)胞核 VnbHLH4Vn_1108840644 164 6.45細(xì)胞核 VnbHLH5Vn_1217555261 523 7.22細(xì)胞核 VnbHLH6Vn_1323151455 921 6.36細(xì)胞核 VnbHLH7Vn_1403733737 436 7.13細(xì)胞核 VnbHLH8Vn_1455240543 744 8.48細(xì)胞核 VnbHLH9Vn_1468735940 041 6.38細(xì)胞核 VnbHLH10Vn_1490240543 744 8.48細(xì)胞核 VnbHLH11Vn_1514743947 910 5.09細(xì)胞核 VnbHLH12Vn_1899044648 040 4.77細(xì)胞核 VnbHLH13Vn_2008143747 911 5.64細(xì)胞核 VnbHLH14Vn_2036931334 270 7.92細(xì)胞核 VnbHLH15Vn_2040831834 753 6.17細(xì)胞核 VnbHLH16Vn_2069334736 369 6.31細(xì)胞核 VnbHLH17Vn_2080019120 94210.69細(xì)胞核 VnbHLH18Vn_2090527430 190 6.31細(xì)胞核 VnbHLH19Vn_2172832435 858 6.19細(xì)胞核 VnbHLH20Vn_2253725627 735 6.80細(xì)胞核 VnbHLH21Vn_2363324226 689 5.82細(xì)胞核 VnbHLH22Vn_3257439442 996 8.14細(xì)胞核 VnbHLH23Vn_3478618219 804 9.67細(xì)胞核 VnbHLH24Vn_3492443948 548 6.30細(xì)胞核 VnbHLH25Vn_3771757763 849 7.35細(xì)胞核 VnbHLH26Vn_3901765271 076 5.05細(xì)胞核 VnbHLH27Vn_3913220022 74611.47細(xì)胞核 VnbHLH28Vn_4003231234 299 5.92細(xì)胞核 VnbHLH29Vn_4074341946 005 5.31細(xì)胞核 VnbHLH30Vn_4091732735 906 7.32細(xì)胞核 VnbHLH31Vn_4357764169 727 6.96細(xì)胞核 VnbHLH32Vn_4516115917 98210.51細(xì)胞核 VnbHLH33Vn_4552032836 240 6.38細(xì)胞核 VnbHLH34Vn_4626533136 130 6.19細(xì)胞核 VnbHLH35Vn_4640827830 549 6.31細(xì)胞核 VnbHLH36Vn_467225227 233 9.25細(xì)胞核 VnbHLH37Vn_4717723625 602 8.52細(xì)胞核 VnbHLH38Vn_4758830032 079 6.72細(xì)胞核 VnbHLH39Vn_4784037941 720 7.15細(xì)胞核 VnbHLH40Vn_487964169 727 6.96細(xì)胞核 VnbHLH41Vn_5149912414 18510.08細(xì)胞核 VnbHLH42Vn_5151255261 509 7.22細(xì)胞核 VnbHLH43Vn_5365449053 100 5.91細(xì)胞核 VnbHLH44Vn_5388818620 213 8.65細(xì)胞核 VnbHLH45Vn_5431232736 308 7.41細(xì)胞核 VnbHLH46Vn_5644031734 682 6.17細(xì)胞核 VnbHLH47Vn_588369377 795 6.40細(xì)胞核 VnbHLH48Vn_5955027831 111 6.07細(xì)胞核

續(xù)表1

3.3 藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守基序分析

對(duì)藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守氨基酸Motif進(jìn)行MEME SUITE分析（圖2），共獲得10個(gè)Motif：Motif 1（YIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKIS- ERMKYLQELVPGCNK）、Motif 2（TGKASMLD- EIINYVQSLQRQVEFLSMKLA）及Motif 3（LNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNISKM- DKASLLGDAISYIKELQRKIKELESE）等。結(jié)果（圖3、4）表明50個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都含有Motif 1，49個(gè)轉(zhuǎn)錄因子包含Motif 2，在17個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了Motif 3，有7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有Motif 4，有6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有Motif 5，有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有Motif 6，有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有Motif 7，10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有Motif 8，僅有4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子包含Motif 9，5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子包含Motif 10。

利用clustal W對(duì)所有的藜蘆bHLH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)，然后采用WebLogo 3作圖（圖3），藜蘆的bHLH結(jié)構(gòu)域由53個(gè)氨基酸組成，包含2個(gè)不同的功能區(qū)域其N端的Basic區(qū)該區(qū)域氨基酸數(shù)量較少（13個(gè)氨基酸），第10、11位的精氨酸高度保守，堿性區(qū)域是轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域，其作用可能是識(shí)別DNA的順式作用位點(diǎn)，該序列對(duì)靶基因啟動(dòng)子上游的E-box識(shí)別結(jié)合必不可少；在C端的HLH區(qū)域第21、49位的亮氨酸保守度很高，第39、43位的亮氨酸、異亮氨酸也非常保守，這些氨基酸殘基對(duì)于二聚體的形成和功能非常重要。

圖2 MEME預(yù)測(cè)的藜蘆bHLH 10個(gè)Motifs Logo

圖3 藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的保守結(jié)構(gòu)域

圖4 藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子保守基序分布

3.4 藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA 7.0軟件對(duì)72個(gè)藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子和部分?jǐn)M南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白進(jìn)行建樹（圖5）。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子和同源性較近的擬南芥bHLH序列交錯(cuò)分布。依據(jù)擬南芥bHLH蛋白家族分類[23]，藜蘆bHLH蛋白被分為6個(gè)大族，分別為Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅻ。其中Ⅲ族包含12個(gè)成員，Ⅳ族包含9個(gè)成員、Ⅶ族包含9個(gè)成員，Ⅷ族包含5個(gè)成員，Ⅸ族包含6個(gè)成員，Ⅻ族最多，含有31個(gè)成員，共計(jì)72個(gè)。根據(jù)進(jìn)化樹分類結(jié)果，可將Ⅲ組與Ⅳ組細(xì)分為Ⅲb、Ⅲd、Ⅲe、Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc幾個(gè)亞族，分別含有3、6、3、3、5和1個(gè)成員。幾乎所有藜蘆bHLH蛋白都與擬南芥bHLH蛋白聚在相同亞組上，同一亞族的藜蘆bHLH蛋白與擬南芥bHLH蛋白具有較高的相似性，藜蘆bHLH蛋白與相近的擬南芥bHLH蛋白可能具有相同或相似的功能。

圖5 藜蘆與擬南芥bHLH系統(tǒng)發(fā)育分析

3.5 不同組織藜蘆bHLH表達(dá)模式分析

對(duì)藜蘆bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因在藜蘆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，72個(gè)基因在根、莖和葉3個(gè)不同組織中表達(dá)模式有差異（圖6），大部分bHLH轉(zhuǎn)錄因子都參與表達(dá)，少部分未表達(dá)或部分表達(dá)：5條bHLH（Vn_20080、Vn_14687、Vn_8116、Vn_40032、Vn_43577）在根中未達(dá)；2條bHLH（Vn_54312、Vn_14037）在根中表達(dá)較高，而在葉中表達(dá)量極低，結(jié)合藜蘆內(nèi)的生物堿集中在根部，推測(cè)其可能參與了藜蘆植物根部某些生物堿的合成；還有些基因未參與表達(dá)，如Vn_79078。Vn_78073、Vn_83368 2條基因在莖中表達(dá)量明顯高于根部和葉片，可能在莖的發(fā)育過程中起重要作用；Vn_20800、Vn_14687和Vn_8116在葉片中表達(dá)顯著，可能參與葉的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。此外一些bHLH（如Vn_53654、Vn_23633等）在藜蘆3個(gè)不同組織部位均有較高表達(dá)，說明其可能參與藜蘆整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期中多種生理生化轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?？傮w上看，藜蘆bHLH的基因表達(dá)具有多樣性，一些基因能夠在某一或多種組織中發(fā)揮特定作用。

圖6 不同組織中藜蘆bHLH基因表達(dá)模式

4 討論

目前對(duì)基因家族的鑒定分析普遍使用基因組或基因組與轉(zhuǎn)錄組結(jié)合的方式，但藜蘆基因組尚未被報(bào)導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)通過二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序完成轉(zhuǎn)錄本定量分析，使用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得一致性轉(zhuǎn)錄本。在此基礎(chǔ)上完成了對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族的模型篩選、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和表達(dá)分析。在沒有參考基因組的情況下，二代、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合測(cè)序可作為替代策略進(jìn)行基因挖掘[24]，完成對(duì)基因家族的鑒定及部分分析。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序停留在組織表達(dá)層面，缺少對(duì)基因的結(jié)構(gòu)及染色體定位、對(duì)蛋白及代謝物的調(diào)控也需要代謝組學(xué)提供幫助。因此，對(duì)基因的完整鑒定及功能挖掘需要基因組、轉(zhuǎn)錄組及代謝組的聯(lián)合分析來完成。

bHLH是真核生物中一類廣泛存在且數(shù)量眾多的轉(zhuǎn)錄因子，因具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)而得名，其通過特定的氨基酸殘基與靶基因結(jié)合來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[25]。與其他植物相比，藜蘆屬植物由于含有特殊的甾體類生物堿，成為該方向的研究熱點(diǎn)。SlbHLH114參與了番茄甾體生物堿的合成，可被甾體生物堿合成關(guān)鍵調(diào)控因子SlMYC2激活，從而顯著提高番茄內(nèi)甾體生物堿代謝途徑基因的表達(dá)[26-27]。Vn_39017、Vn_53654和Vn_74175 3個(gè)基因與SlbHLH114、SlMYC2關(guān)系較近，在根中表達(dá)較高，且與甾體生物堿的聚集部位吻合，可能參與了藜蘆甾體生物堿環(huán)靶明的生物合成。植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及合成代謝途徑的調(diào)控，如光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素合成、腺毛和根毛發(fā)育及逆境脅迫及枝條分枝等[28-30]，而且越來越多的研究表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)調(diào)節(jié)植物逆境具有重要作用。在擬南芥中，AtbHLH122對(duì)干旱、鹽脅迫和滲透脅迫具有正向調(diào)控作用[31]，此外，bHLH115可參與調(diào)節(jié)鐵的穩(wěn)態(tài)[32]。根據(jù)與其他已驗(yàn)證功能的bHLH基因建樹結(jié)果，可初步推測(cè)藜bHLH在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或代謝途徑調(diào)控中發(fā)揮的作用。

bHLH在不同組織部位的表達(dá)模式預(yù)示著bHLH蛋白功能的多樣性。煙草bHLH93具有明顯的組織特異表達(dá)[33]，在不同生長(zhǎng)階段的側(cè)根和花期子房中有較高表達(dá)，這與植物甾醇合成的集中性特征相吻合；銀杏bHLH91的表達(dá)存在季節(jié)與組織性差異[34]。作為的靶基因，bHLH74能調(diào)控?cái)M南芥根部的生長(zhǎng)發(fā)育[35]。這些表達(dá)差異在72個(gè)藜蘆bHLH中也有體現(xiàn)，在根中表達(dá)量高或特異表達(dá)的bHLH對(duì)甾體生物堿的代謝可能具有調(diào)控作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis ofbHLH transcription factor based on transcriptome

KOU Cheng-xi1, 2, TONG Jin-quan3, MA Rui4, SUN Wei5, XUE Zhe-yong1, 2, MA Peng-da3

1. Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 2. Heilongjiang Key Laboratory of Plant Bioactive Substance Biosynthesis and Utilization, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 3. College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China 4. Jilin Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China 5. Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To identify and analyze the Veratrum () bHLH transcription factor gene family of Veratrum veratrum by bioinformatics based on transcriptome data.The bHLH gene was screened from the transcriptional sequence of Veratrum by hidden Markov model, and the physical and chemical properties and conserved motif of Veratrum bHLH were visually analyzed by online websites such as ExPASy and MEME and software such as MEGA and TBtools.A total of 72 bHLH transcription factors were identified in Veratrum transcriptome. The amino acid number of VnbHLH transcription factors was 105—692, the isoelectric point was 4.69—11.47, and the relative molecular weight was 11 071.2—77 795.3. Subcellular localization analysis showed that VnbHLH were all located in the nucleus. According to phylogenetic analysis, VnbHLH transcription factors were divided into six subgroups. The expression of VnbHLH was significantly different in different tissues, while Vn_54312 and Vn_14037 were highly expressed in roots. It is speculated that they may be involved in the synthesis of some alkaloids in the roots of Chenopodium.The analysis of bHLH transcription factor gene family inbased on transcriptome data is helpful to predict and verify the function of bHLH transcription factor family in..

L.; transcriptome; bHLH transcription factor; phylogenetic evolution; gene expression

R286.12

A

0253 - 2670(2022)14 - 4476 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.026

2021-12-02

吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2017ZY029）

寇呈熹，碩士研究生，從事中藥活性物質(zhì)代謝途徑解析。E-mail: 905546738@qq.com

薛哲勇，教授。E-mail: xuezhy@126.com

麻鵬達(dá)，副教授。E-mail: mapengda@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]