miR-143對(duì)妊娠期糖尿病胎盤葡萄糖代謝和線粒體功能的作用

麥彩園 (廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

妊娠期糖尿病(GDM)為育齡期的女性孕前有可能潛在的糖耐量異常，或糖代謝正常，到妊娠時(shí)才出現(xiàn)的以血糖升高為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，是妊娠期常見(jiàn)的并發(fā)癥[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約15.8%的妊娠婦女存在GDM[2]。GDM會(huì)影響母親和后代。母體血糖升高會(huì)引起胎兒血糖升高，從而導(dǎo)致胎兒胰島素分泌增加。 胰島素是胎兒生長(zhǎng)因子，可導(dǎo)致巨大胎兒，并增加剖宮產(chǎn)和胎兒出生創(chuàng)傷的風(fēng)險(xiǎn)，包括陰道撕裂、難產(chǎn)、窒息等[3]。胎盤本身的代謝對(duì)于全面了解胎盤如何調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，能量平衡，胎兒的生長(zhǎng)以及胎兒的程序發(fā)育至關(guān)重要。MicroRNA (miRNA)是一種非編碼RNA，已經(jīng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛研究[4]，主要通過(guò)與靶基因的3' 端非編碼區(qū)的結(jié)合，對(duì)靶因子產(chǎn)生調(diào)控作用，從而影響細(xì)胞的增殖、凋亡[5]。miR-143位于染色體5號(hào)位上，參與脂肪形成，在幾種癌癥中存在下調(diào)，可以抑制己糖激酶2(HK-2)并上調(diào)有氧糖酵解[6]。miR-143通過(guò)抑制Ⅰ型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT1)，抑制T細(xì)胞葡萄糖攝取和糖酵解，調(diào)控T細(xì)胞分化[7]。Hastie等研究表明，妊娠前肥胖或妊娠前糖尿病婦女的胎盤降低了線粒體呼吸鏈酶的表達(dá)，這可能對(duì)胎盤功能產(chǎn)生不利影響[8]。腫瘤細(xì)胞有氧環(huán)境下能夠攝取葡萄糖，生成的丙酮酸不經(jīng)過(guò)氧化磷酸化，而在胞質(zhì)中酵解形成乳酸，為瓦氏效應(yīng)(Warburg effect)或有氧糖酵解[9]。已有研究顯示，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞具有相同的特性，依賴于有氧糖酵解供能[10]。本文研究GDM患者胎盤中miR-143的表達(dá)情況，檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞有氧糖酵解代謝、線粒體功能有關(guān)指標(biāo)水平，分析miR-143對(duì)GDM患者胎盤線粒體功能及葡萄糖代謝的影響。

1 資料與方法

1.1儀器及試劑

1.1.1儀器：實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)：Bio-Rad公司，美國(guó)。熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)：Progmega公司，美國(guó)。

1.1.2試劑：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物：Bio-Rad公司，美國(guó)。培養(yǎng)基、載體、胎牛血清、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、pMiR report質(zhì)粒：Invitrogen公司，美國(guó)。質(zhì)粒抽提試劑盒：Takara公司，中國(guó)。miR-143模擬物(miR-143 mimics)和對(duì)照物(miR-143 NC)、RNAiMAX：Qiagen公司，德國(guó)。Trizol試劑：Takara公司，中國(guó)。

1.2收集胎盤組織：本方案按照赫爾辛斯基宣言有關(guān)規(guī)定，經(jīng)由本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，患者簽署知情同意。選擇2019年8月～2021年7月在本院行剖宮產(chǎn)的GDM患者30例，收集胎盤的原發(fā)性絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，分為兩組：Diet組為單純飲食組，Drug組為胰島素治療，每組15例。另外對(duì)照組15例為無(wú)妊娠并發(fā)癥的孕婦，收集順產(chǎn)后胎盤組織。三組均為單胎妊娠。胎盤娩出后，清理胎盤表面，自母體面-胎兒面獲取1 cm×1 cm大小的全層胎盤組織，去除羊膜，隨機(jī)取3個(gè)部位，冷凍并儲(chǔ)存在-80℃冰箱。

1.3胎盤勻漿組織ELISA測(cè)定：使用夾心ELISA在胎盤勻漿中測(cè)量人胎盤催乳素(hPL)，在涂有與辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的抗hPL抗體包被的孔中將等份的胎盤勻漿孵育。結(jié)合的過(guò)氧化物酶量和勻漿中hPL的濃度成正比。

1.4實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)：將樣品移到1 ml RNAiso Plus液的EP管，混和均勻，加入氯仿0.2 ml，混和均勻，離心。上層水相移至離心管，加入異丙醇，離心。移去上清液，然后加入乙醇?；旌途鶆?，離心棄去上清液，再加無(wú)RNA酶水40 μl，讀取OD值。反轉(zhuǎn)錄將RNA合成cDNA。用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)、Takara公司合成的引物，引物序列：miR-143上游引物5'-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3'，下游引物5'-TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3'；上游引物5'-GLUT1 CACATGCCTTCTTTGCCAAG-3'，下游引物5'-TCTATACACAGCAGGGCAGGA-3'；HK-2上游引物5'-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3'，下游引物5'-GTACTCCCCTCGTTTGTGCAG-3'；磷酸果糖激酶(PFK)上游引物5'-GTACGAATTCTTGGCCTGACCTGAAT-3'，下游引物5'-GCGCCCCGGGCCGACTCTTATGTTGTGT-3'；乳酸脫氫酶(LDH)上游引物5'-TATCGAGAATCTGATCGCAGAAGAC-3'，下游引物5'-GGGCAACAAGTTCATCAGCCAAATCC-3'；過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α)上游引物5'-GACCACAAACGATGACCCTC-3'，下游引物5'-ATGTTGCGACTGCGGTTG；-3'過(guò)氧化物酶體增殖物受體γ(PPARγ)上游引物5'-GCAGTGGGGATGTCTCATAATGC-3'，下游引物5'-CAGGGGGGTGATGTGTTTTGAAC-3'；U6上游引物5'-GGTGGTGGAGAACTCTTCA-3'，下游引物5'-GAGCAGCGTCTTCAGGAGCA-3'。反應(yīng)體系: TaqMan?Fast Advanced Master Mix(2×)10 μl， TaqMan?Advanced miRNA Assay(20×)1 μl， cDNA反應(yīng)液(1∶10 稀釋)5 μl，無(wú)核酸酶水4 μl。按以下條件擴(kuò)增：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。miR-143選擇U6做內(nèi)參，其他因子選擇3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。檢測(cè)三組miR-143的表達(dá)；三組GLUT1、HK-2、PFK、LDH的水平；三組PGC-1α、PPARγ的水平。使用Rotor-Gene Q Software計(jì)算Ct值，用2-ΔΔCT表示相對(duì)表達(dá)量。所有樣本重復(fù)3遍。

1.5細(xì)胞分離與培養(yǎng)：用酶消化和percoll梯度純化法從胎盤中分離出絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞接種在Seahorse XF24板，置于37 ℃、5%CO2孵箱，在濃度17 mmoL/L的葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.6雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)、miR-143 mimics進(jìn)行轉(zhuǎn)染：在基因網(wǎng)站http://www.targetscan.org/vert_70/上尋找miR-143靶向作用的基因GLUT1(SLC2A1即GLUT1)。將指數(shù)生長(zhǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞以2×105/cm2的密度接種至12孔板，細(xì)胞融合達(dá)80%，將miR-143 mimics及miR-143 NC進(jìn)行轉(zhuǎn)染(按Lipofeetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法)，設(shè)只加Lipofectamine 2000的對(duì)照組。從Drug組胎盤分離的滋養(yǎng)細(xì)胞，用1 nmoL/L miR-143 mimics或陰性對(duì)照miRNA轉(zhuǎn)染，再于24 h后，細(xì)胞被洗凈并轉(zhuǎn)染，野生型3’UTR GLUT1和突變型3’UTR GLUT1的pGL3-，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。以miR-143 mimics轉(zhuǎn)染Drug組滋養(yǎng)細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)GLUT1、HK-2、PFK、LDH的水平以及PGC-1α、PPARγ的水平。

2 結(jié)果

2.1三組臨床資料比較：三組患者年齡、體重指數(shù)(BMI)、孕周、胎兒重量、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)0 h血糖(OGTT 0 h PG)、OGTT 2 hPG比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Diet組較對(duì)照組、Drug組胎盤重量增加，胎兒/胎盤重量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組臨床資料比較

2.2ELISA法檢測(cè)三組hPL：Diet組hPL含量明顯高于對(duì)照組，Drug組hPL含量明顯高于Diet組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 三組入選者胎盤hPL相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 miR-143在三組滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)量比較

2.3RT-qPCR檢測(cè)三組miR-143水平：miR-143在Drug組滋養(yǎng)細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組和Diet組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4RT-qPCR檢測(cè)三組糖代謝指標(biāo)和線粒體功能：與對(duì)照組和Diet組比較，Drug組胎盤中糖代謝相關(guān)指標(biāo)GLUT1、HK-2、PFK和LDH顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，Diet組、Drug組中線粒體呼吸功能相關(guān)指標(biāo)PGC-1α、PPARγ顯著下調(diào)，且Drug組PGC-1α、PPARγ顯著低于Diet組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

注：*P<0.05圖3 三組GLUT1、HK2、PFK和LDH的水平

注：*P<0.05圖4 三組PGC-1α、PPARγ的水平

2.5miR-143可靶向調(diào)控GLUT1表達(dá)：使用數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.targetscan.org/vert_70/驗(yàn)證miR-143與GLUT1的潛在結(jié)合靶點(diǎn)，其結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖5。而熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示miR-143可顯著抑制野生型pMIR-GLUT1-WT的熒光素酶活性，而不影響突變型pMIR-GLUT1-MT熒光素酶活性。見(jiàn)圖6。

圖5 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-143和GLUT1結(jié)合(SLC2A1即是GLUT1)

注：*P<0.05圖6 熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果

2.6miR-143 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)葡萄糖代謝、線粒體功能的影響：以miR-143 mimics轉(zhuǎn)染Drug組滋養(yǎng)細(xì)胞后，GLUT1、HK2、PFK和LDH表達(dá)明顯降低，而PGC-1α、PPARγ的表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7、圖8。

注：*P<0.05圖7 miR-143對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞糖代謝指標(biāo)的影響

注：*P<0.05圖8 miR-143對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞線粒體功能的影響

3 討論

胎盤在母體和胎兒同種異體移植物之間提供免疫界面，在母體和胎兒之間運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物，并且是影響胎兒、胎盤和母體新陳代謝和發(fā)育的肽和類固醇激素的來(lái)源。胎盤被認(rèn)為在GDM的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，具有物質(zhì)交換、防御、合成及免疫功能，因?yàn)榕cGDM相關(guān)的并發(fā)癥會(huì)在胎盤分娩后消失[11]。本研究結(jié)果說(shuō)明GDM的胎盤肥大，可以在其呼吸減少時(shí)維持胎兒的質(zhì)量。

hPL對(duì)胎兒的生長(zhǎng)、胎盤的功能均有影響，它是在孕期適應(yīng)母體內(nèi)分泌胰腺的主要刺激因素，增加了β細(xì)胞的大量胰島素生成，從而幫助母體在妊娠期間彌補(bǔ)高血糖。在整個(gè)妊娠過(guò)程中，hPL的濃度逐漸增加，并直接分泌到胎兒和母體循環(huán)中，臨床上測(cè)定hPL mRNA反映胎盤功能狀態(tài)及胎兒宮內(nèi)發(fā)育情況，胎盤變大與母體血液中的hPL水平升高有關(guān)[12]。本研究結(jié)果符合胎盤組織的hPL水平在GDM患者中明顯增加的表現(xiàn),也符合胎盤變大與母體hPL水平升高有關(guān)的理論。

在健康的人類和大鼠中，進(jìn)入胎盤的葡萄糖中至少有33%是通過(guò)線粒體的氧化磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)代謝，可以滿足高代謝率的滋養(yǎng)細(xì)胞[13]。PPARγ是一類轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)促進(jìn)能量沉積或能量耗散來(lái)調(diào)節(jié)能量平衡，PGC-1α是PPARγ的共激活因子，可誘導(dǎo)促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生與脂肪酸氧化，PGC-1α和PPARγ的下調(diào)都有助于降低Drug組胎盤中的線粒體功能[14-15]。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白(SIRT1)過(guò)表達(dá)可能通過(guò)介導(dǎo)PPARy通路對(duì)肥胖大鼠肝臟的脂肪沉積、變性及氧化應(yīng)激起到了調(diào)節(jié)作用[16]。妊娠前肥胖或妊娠前糖尿病婦女的胎盤降低了線粒體呼吸鏈酶的表達(dá)，這可能對(duì)胎盤功能產(chǎn)生不利影響[8]。本研究說(shuō)明GDM患者的胎盤線粒體功能受損，可能是胎盤代償肥大的原因。這與之前研究的妊娠并發(fā)先兆子癇和母體肥胖的孕婦胎盤中線粒體呼吸復(fù)合物的表達(dá)和活性降低，肥胖母親胎盤分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞中的呼吸減少一致[17]；也與高脂飲食大鼠中的研究[14]一致。

GLUT1是葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的唯一載體，HK-2是糖酵解途徑的第一個(gè)酶，PFK-1是糖酵解的限速酶，是反映最主要的調(diào)控位點(diǎn)，LDH在糖代謝中起著重要作用。它們的表達(dá)水平對(duì)GDM的嚴(yán)重程度和預(yù)后有診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值[18]。GLUT1與糖代謝緊密相關(guān)，參與孕婦與胎兒的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，是胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的最終一步，其在胎盤組織中含量的高低對(duì)GDM有重要意義[18]。研究顯示經(jīng)野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1(Wip1)特異性抑制劑(GSK2830371)治療，PFK、HK-2和LDH的活性以及肝臟乳酸量均增高，可以進(jìn)一步促進(jìn)肝再生并提高肝細(xì)胞的有氧糖酵解水平[19]。達(dá)英-35聯(lián)合二甲雙胍治療大鼠，在卵巢水平上改善其內(nèi)分泌功能，促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增殖，其機(jī)制是通過(guò)提高糖酵解相關(guān)限速酶(GLUT1、HK-2、PFK和LDH)的表達(dá)，維持卵泡發(fā)育所需要的能量[20]。本研究與糖尿病妊娠中基底膜GLUT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加的報(bào)道一致[21]。GDM胎盤中葡萄糖的可用性和消耗量的增加可能反映在糖酵解途徑中限速酶的表達(dá)或活性增加。

Muralimanoharan研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自受藥物控制的GDM胎盤組織中的miR-143明顯降低了50%，miR-143的過(guò)表達(dá)減少了糖酵解；發(fā)現(xiàn)受藥物控制的GDM胎盤中hPL顯著升高，線粒體功能降低，糖酵解增加，miR-143和自噬相關(guān)蛋白(mTOR)活化降低，miR-143過(guò)表達(dá)能夠部分拯救線粒體功能并減少受藥物控制的GDM胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中的糖酵解酶[22]。本研究再次證實(shí)了以上結(jié)論。

本研究中熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-143可靶向調(diào)控GLUT1表達(dá)。以miR-143 mimics轉(zhuǎn)染Drug組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞后，其結(jié)果提示miR-143過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致糖酵解減少，線粒體功能升高。

綜上所述，GDM患者h(yuǎn)PL明顯升高，miR-143表達(dá)降低，糖酵解增加，線粒體功能降低。miR-143可靶向調(diào)控GLUT1，miR-143過(guò)表達(dá)能夠部分挽救線粒體功能并減少GDM胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的有氧糖酵解。本文樣本量較小，對(duì)于miR-143的表達(dá)與患者臨床資料的相關(guān)性還存在不足，而miR-143對(duì)線粒體的調(diào)控機(jī)制可待進(jìn)一步研究。