強(qiáng)化阿托伐他汀治療對PCI患者EMPs、Th17/Treg水平及Notch1信號通路的影響

陳園月,陸永光,陳麗媛，黃軍章，陳 林，仇昌智 (欽州市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣西 欽州 535099)

越來越多的研究表明急性冠狀動脈綜合征(ACS)的進(jìn)展過程中存在急慢性炎性反應(yīng)及病理性免疫反應(yīng)[1]，炎性及免疫細(xì)胞的過度激活與血管內(nèi)不穩(wěn)定性斑塊密切相關(guān)[2-3]。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)是治療ACS的有效方法，手術(shù)后存在的心肌損害仍是棘手問題。EMPs的功能與內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)，它可以通過作為細(xì)胞介質(zhì)和黏附分子的載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號[4]。有研究表明，ACS患者EMPs表達(dá)增多[5]。 哺乳動物的Notch信號通路由4種Notch受體(Notch1～4)和5種配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)組成，當(dāng)配體與受體胞外區(qū)結(jié)合后，發(fā)生酶切，然后經(jīng)Y-分泌酶二次酶切，激活相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可加重內(nèi)皮細(xì)胞衰老及炎性反應(yīng)[6]。于是提出Notch信號與動脈粥樣硬化有關(guān)。巨噬細(xì)胞在動脈硬化進(jìn)展中扮演著中心角色。研究表明，激活的巨噬細(xì)胞通過介導(dǎo) Notch1 及其下游目標(biāo)基因和炎性效應(yīng)因子而參與促炎反應(yīng)，從而具有促進(jìn)ACS發(fā)生的作用[7]。但目前還沒有Notch信號通路與EMPs關(guān)系的相關(guān)具體研究。本研究旨在探討兩者之間關(guān)系。

阿托伐他汀是冠心病的主要治療藥物，效果顯著，但其對Th17/Treg及Notch1信號通路的影響研究較少。本研究觀察了ACS患者外周血Th17、Treg變化及Notch1受體變化，探討阿托伐他汀治療對Th17、Treg的作用及EMPs誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞亞群分化和效應(yīng)分子的表達(dá)機(jī)制和EMPs與Notch1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2017年2月～2018年1月本院收治的ACS患者112例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：包括不穩(wěn)定性心絞痛及急性心肌梗死并擇期行PCI術(shù)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有腦卒中、近1個月內(nèi)使用非甾體抗炎藥、激素、免疫抑制劑或他汀類藥物；合并肝腎功能障礙、免疫及風(fēng)濕性疾病或腫瘤；合并感染性疾病或發(fā)熱；妊娠及哺乳期婦女。將患者隨機(jī)分為阿托伐他汀強(qiáng)化治療組(強(qiáng)化組)和阿托伐他汀常規(guī)治療組(常規(guī)組)各56例。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2治療方法：強(qiáng)化組和常規(guī)組均積極控制基礎(chǔ)疾病，給予冠心病二級預(yù)防常規(guī)治療等。在此基礎(chǔ)上強(qiáng)化組口服阿托伐他汀鈣片術(shù)前服用 80 mg/d，術(shù)后服用40 mg/d，而常規(guī)組術(shù)前、術(shù)后服用20 mg/d。

1.3血清Treg、Th17檢測：強(qiáng)化組及常規(guī)組分別于術(shù)前、術(shù)后1周抽取靜脈血，制備單淋巴細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)檢測 Th17、Treg，計算 Treg/Th17。

1.3.1單淋巴細(xì)胞懸液制備：將標(biāo)本加入分離液中，離心0.5 h，使用PBS洗滌細(xì)胞，然后液氮保存。

1.3.2Th17檢測：解凍淋巴細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)及加入抗體孵育后，采用流式細(xì)胞儀檢測Th17，計算比例。

1.3.3Treg檢測：于單細(xì)胞懸液加入抗體，經(jīng)破膜及孵育后，采用流式細(xì)胞儀檢測Treg。

1.4ROR-yt mRNA、Foxp3 mRNA、Notch1 mRNA水平表達(dá)檢測：采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法。取各組樣本，采用TRIzol法提取總RNA；合成第一鏈cDNA；構(gòu)建熒光定量PCR 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃2 min、95℃ 20 s、60℃ 30 s、68 ℃ 55 s(40個循環(huán))。以 GAPDH 為 內(nèi)參，計算ROR-yt、Foxp3 mRNA Notch1 mRNA相對表達(dá)量。ROR-yt 上游引物：CCTGGGCTCCTCGCCT-GACC，下游引物：TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC。Foxp3上游引物：CTGGCAAATGGTGTCTGCAAGT，下游引物：TGGCACCCAGCACAATGAA。Notch1基因引物序列上游引物ACAGCCTCAACGGGTACAAG，下游引物GGCAGACACAGGAGAAGCTC。

1.5IL-17檢測：取1.4標(biāo)本離心后取血清，按試劑說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測IL-17。

1.6EMPs檢測：在患者入院后次日清晨空腹及術(shù)后1周時采取患者外周靜脈血抽取患者3 ml，離心后獲取含血小板的血漿。取50 μl血小板血漿加入特異性標(biāo)記抗體0.5 μg或等量的同型對照抗體(鼠IgG1/PE，鼠IgG1/FITC，美國BD公司生產(chǎn))。在室溫下孵育20 min后加用PBS后，用流式細(xì)胞儀檢測。檢測過程在血樣收集后4 h內(nèi)完成。EMPs定義為直徑<1.0 μm且CD31+/CD42-的微粒。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)與χ2檢驗(yàn)；兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1兩組Th17、Treg表達(dá)的比較：與術(shù)前比較，術(shù)后Th17下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與常規(guī)組比較，強(qiáng)化組Th17降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與術(shù)前比較，術(shù)后Treg及Treg/Th17表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與常規(guī)組比較，強(qiáng)化組Treg及Treg/Th17表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表1。

表1 兩組Th17、Treg及Treg/Th17水平比較

2.2兩組ROR-yt、Foxp3和Notch1 mRNA表達(dá)比較：與術(shù)前比較，術(shù)后ROR-yt、Notch1 mRNA下降；與常規(guī)組比較，強(qiáng)化組ROR-yt、Notch1 mRNA下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與術(shù)前比較，術(shù)后(Foxp3) mRNA升高；與常規(guī)組比較，強(qiáng)化組(Foxp3) mRNA升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表2。

表2 兩組血漿ROR-yt、Foxp3 mRNA、Notch1 mRNA表達(dá)水平比較

2.3兩組EMPs、IL-17水平比較：與術(shù)前比較，術(shù)后EMPs、IL-17下降；與常規(guī)組比較，強(qiáng)化組EMPs、IL-17下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表3。

2.4相關(guān)性分析：結(jié)果顯示EMPs與 Foxp3 mRNA水平均呈負(fù)相關(guān)，EMPs與Notch1 mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17水平均呈正相關(guān)。

表3 兩組EMPs、IL-17水平比較

3 討論

Th17和Treg是來源相同，分化卻不同的一組免疫炎性反應(yīng)調(diào)控T細(xì)胞亞群，它們互相調(diào)節(jié)及抑制。Th17可分泌IL-17等多種細(xì)胞因子，激活病理免疫反應(yīng)。有研究證實(shí)，Th17/Treg失衡在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展演變過程發(fā)揮重要作用[8-9]，本課題也充分體現(xiàn)了Th17/Treg失衡在ACS中發(fā)揮的重要地位。研究顯示，動脈硬化模型小鼠的Th17及轉(zhuǎn)錄因子ROR-yt升高，說明Th17升高加速了動脈硬化進(jìn)展[10]。既往試驗(yàn)表明ACS患者Th17及IL-17明顯升高，說明Th17升高加劇了冠脈斑塊的不穩(wěn)定性[11]。而本次試驗(yàn)結(jié)論也符合該論點(diǎn)。Treg具有抑制免疫及抑制炎性反應(yīng)的特性。Treg可分泌TGF-β和IL-10及抑制和下調(diào)炎性反應(yīng)因子及單核細(xì)胞趨化因子表達(dá)，減少泡沫細(xì)胞形成及炎性細(xì)胞積聚，減輕動脈粥樣硬化。Treg還可加快血脂分解，尤其低蛋白脂蛋白，下調(diào)血脂水平，抑制斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞活化[12]。

ROR-yt是Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化和IL-17基因的轉(zhuǎn)錄。ROR-yt參與Th17介導(dǎo)的炎性反應(yīng)免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展，主要通過誘導(dǎo)Th17細(xì)分泌IL-17等細(xì)胞因子。Foxp3是Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3通過介導(dǎo)Treg分化、發(fā)育、表達(dá)而發(fā)揮重要免疫抑制作用。

不僅ROR-yt、Foxp3 會誘導(dǎo)Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞分化及相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。已有研究表明CD4+T細(xì)胞表達(dá)的Notch1細(xì)胞因子，也能夠調(diào)控Thl7、Treg分化和免疫功能。本研究表明，上述CD4+T關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Notch1及其mRNA表達(dá)水平在ACS患者中均有改變，表明其不同程度參與了冠狀動脈粥樣硬化和粥樣斑塊不穩(wěn)定的免疫調(diào)控。

在淋巴細(xì)胞發(fā)育原始階段，Notch1受體可決定其向T、B細(xì)胞分化的命運(yùn)[13]，Notch1在淋巴細(xì)胞的發(fā)育初期階段有促進(jìn)淋巴樣前體細(xì)胞向T細(xì)胞分化，抑制其向B細(xì)胞分化的作用，而缺乏Notch1信號激活誘導(dǎo)的淋巴樣前體細(xì)胞則會發(fā)育為B細(xì)胞。所以說Notch1在T細(xì)胞分化、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，而且是Notch其他家屬成員無法替代的。Zheng[14]研究發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后不同恢復(fù)程度的患者Th17細(xì)胞水平表達(dá)量明顯不同，與Notch的表達(dá)量成正相關(guān)，提示在腎移植急性排斥反應(yīng)中Th17細(xì)胞的增殖和分化與Notchl密切相關(guān)。而本試驗(yàn)ACS患者ROR-yt mRNA和IL-17也呈正相關(guān)。

有試驗(yàn)應(yīng)用Notchl siRNA阻滯劑阻斷Notch1信號通路，不但可以降低轉(zhuǎn)錄因子RORYt mRNA的表達(dá)，還能顯著降低人類Th17細(xì)胞分泌的IL-17A、IL-17F 等細(xì)胞因子[15]，提示Notchl至少可通過轉(zhuǎn)錄因子ROR-yt 和IL-17基因啟動子2個位點(diǎn)調(diào)控Th17細(xì)胞分化和功能。

本研究EMPs 與Notch1-mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17呈正相關(guān)，因此，本研究推測EMPs誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞亞群分化和效應(yīng)分子的表達(dá)可能通過對相應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXP3和ROR-yt及Notch1信號通路的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的效應(yīng)分子還可反作用于CD4+T淋巴細(xì)胞，影響其分化和功能的發(fā)揮，它們之間存在著復(fù)雜的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

本研究112例ACS患者，與治療前比較，治療后強(qiáng)化組Th17、IL-17水平、ROR-yt mRNA及Notch1-mRNA表達(dá)量均較治療前及常規(guī)組治療后降低，Treg及Treg/Th17、Foxp3 mRNA表達(dá)量較治療前及常規(guī)組治療后升高，EMPs 水平低于術(shù)前且強(qiáng)化組較常規(guī)組變化更明顯，EMPs與Treg、Foxp3 mRNA水平均呈負(fù)相關(guān)。EMPs 與Notch1-mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17呈正相關(guān)，提示急性冠脈綜合征患者體內(nèi)存在Th17、Treg失衡，強(qiáng)化阿托伐他汀通過下調(diào)Th17細(xì)胞IL-17及抑制Notch1表達(dá)糾正Th17/Treg失衡，而減輕ACS術(shù)后心肌炎性反應(yīng)。

綜上所述，阿托伐他汀通過下調(diào)EMPs水平有助于糾正Th17/Treg失衡，從而減輕炎性反應(yīng)。同時Notch1信號通路由于對T細(xì)胞分化及發(fā)育中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，其在動脈硬化形成發(fā)展階段有重要影響，激活及加劇粥樣斑塊的炎性反應(yīng)和斑塊的不穩(wěn)定性。使其成為新的藥物作用靶。隨著研究的深入，進(jìn)一步闡明Notch1信號通路在疾病發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，Notch1有望作為新的藥物治療靶點(diǎn)。