廣西地區(qū)隱球菌感染的臨床特征、菌種鑒定及體外抗真菌藥物敏感性

鄭冬燕 曹存巍李秀楹 鄭艷青 潘開素廖萬清

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021； 2. 廣西衛(wèi)生健康委員會(huì)廣西真菌研究與真菌病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021； 3. 南寧市第四人民醫(yī)院，南寧 530023)； 4. 上海長征醫(yī)院皮膚性病與真菌病研究所，上海 200003

隱球菌病是一種常見的機(jī)會(huì)性侵襲性真菌感染，主要分為新生隱球菌(血清型A、AD和D)和格特隱球菌(血清型B和C)[1]。新生隱球菌主要見于免疫功能低下患者，而格特隱球菌在健康人群中更為常見[2]。盡管隨著高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)在治療艾滋病領(lǐng)域的引入，隱球菌病的發(fā)病率有所下降，但免疫功能低下的個(gè)體仍然存在感染高風(fēng)險(xiǎn)和高死亡率[3-4]。新生隱球菌和格特隱球菌在基因上是相互關(guān)聯(lián)的，然而，它們?cè)诘乩矸植肌⒆匀粭⒌?、宿主傳染性和致病性方面存在差異[5]。新生隱球菌在全球分布，而格特隱球菌在北美和澳大利亞更為常見[6]。此外，格特隱球菌的治療比新生隱球菌似乎更加困難[7]。中國是世界上人口最多的國家，擁有大片潮濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)，植被豐富，這種氣候有利于真菌的生長和傳播。此外，在過去幾十年中，中國免疫功能低下人群的數(shù)量逐年增加，導(dǎo)致隱球菌病等侵襲性真菌感染的發(fā)病率隨之增加，這對(duì)公共衛(wèi)生造成了沉重負(fù)擔(dān)[8]。而且，由于臨床表現(xiàn)的多樣性，隱球菌病很容易被誤診，導(dǎo)致患者不能得到及時(shí)正確地治療。因此，早期診斷、及時(shí)有效地治療對(duì)本病的預(yù)后起著重要作用。

已有研究者對(duì)新生隱球菌和我國的格特隱球菌進(jìn)行了大量研究[9-12]。然而，在我國廣西，對(duì)致病性隱球菌種類及其對(duì)抗真菌治療的敏感性的研究相對(duì)較少。廣西位于亞熱帶地區(qū)，氣候溫暖濕潤，隱球菌病常見，可能存在嚴(yán)重漏報(bào)的現(xiàn)象。并且隨著新的抗真菌藥物的引入，抗真菌藥敏譜需要研究和更新。因此，本研究旨在對(duì)廣西地區(qū)隱球菌感染的患者臨床特征、菌種鑒定和體外藥物敏感性進(jìn)行詳細(xì)分析。

1 材料和方法

1.1 資料來源

收集2014年5月至2018年5月來自南寧市第四人民醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院的隱球菌屬臨床分離株及臨床資料，剔除患者臨床資料不足的菌株。

1.2 菌株的復(fù)蘇和鑒定

將103株隱球菌在Sabouraud葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基27℃下培養(yǎng)48～72 h后，轉(zhuǎn)種于L-甘氨酸溴麝香草酚藍(lán)(CGB)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～7 d，以此鑒別新生隱球菌和格特隱球菌[13]。為了確保菌株的生長和純度，采用條紋劃板法進(jìn)行了三次連續(xù)純化。

1.3 隱球菌蛋白的提取

將約5 mg菌體添加到含有300 μL蒸餾水的Ep管中混勻后加入900 μL無水乙醇，12 000 r/min離心2 min。棄上清液后，再次以12 000 r/min離心2 min，然后將Ep管置于室溫下干燥。加入50 μL 70%甲酸和50 μL乙腈，以12 000 r/min的速度離心2 min。最后將上清液轉(zhuǎn)移到新Ep管中使用。

1.4 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定

取1 μL上述備用的上清液滴加在質(zhì)譜儀靶板的靶點(diǎn)上，再取1 μL基質(zhì)溶液覆蓋樣品，基質(zhì)溶液由50%乙腈-2.5%三氟乙酸中的α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液組成，并在分析前再次風(fēng)干。對(duì)于每個(gè)樣品，在自動(dòng)采集模式下，產(chǎn)生了質(zhì)量-電荷范圍為2 200～22 000 Da的光譜，平均240次激光發(fā)射。當(dāng)獲得較差的光譜(1 000個(gè)任意單位以上的10個(gè)定義明確的峰少于10個(gè))時(shí)，在蛋白質(zhì)提取過程中通過額外的洗滌步驟重復(fù)分析，從而提高光譜質(zhì)量。使用MALDI Biotyper 3.0數(shù)據(jù)庫比較數(shù)據(jù)并記錄質(zhì)譜鑒定結(jié)果。根據(jù)使用手冊(cè)，鑒定分值≥1.70表示識(shí)別正確；鑒定分值<1.70表示識(shí)別不正確或無法識(shí)別[14]。

1.5 DNA提取及分子鑒定

隨機(jī)選擇20株隱球菌提取DNA進(jìn)行測序。將菌株于27℃ SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，按照江蘇康威世紀(jì)生物科技有限公司Q19生產(chǎn)的真菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行DNA提取。使用引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAGTGCGG-3’；ITS4:5’- TCCTCCGCT1TATTGATATGC -3’對(duì)核糖體RNA(rRNA)內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rITS)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)的條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物送至廣州金科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。將測序好的堿基序列上傳至NCBI基因庫數(shù)據(jù)庫和CBS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.6 抗真菌藥敏試驗(yàn)

根據(jù)CLSI推薦的M27-A4方案進(jìn)行體外抗真菌藥敏試驗(yàn)。測定了氟康唑(FLC)、兩性霉素B(AmB)、5-氟胞嘧啶(5-FC)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VOC)、泊沙康唑(POS)和艾沙康唑(ISA)的最小抑制濃度(MIC)值。使得FLC的最終藥物濃度范圍為0.125～64 μg/mL，AmB和5-FC的最終濃度范圍為0.00156～8 μg/mL，ITC、VOC、POS和ISA的最終濃度范圍分別為0.0020～1 μg/mL。在RPMI 1640培養(yǎng)基中，通過比濁儀將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×103～5×103/mL。96孔板在37℃下孵育接種72 h后讀取分析結(jié)果。使用近平滑念珠菌 ATCC22019菌懸液作為質(zhì)控菌株。

1.7 體外抗真菌藥敏結(jié)果

根據(jù)CLSI M27-A4文件，AmB的MIC定義為與無藥物對(duì)照組對(duì)比，100%生長抑制所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度，而其他抗真菌藥物的MIC定義為50%生長抑制的最低濃度(≥50%)。MIC50和MIC90分別為能夠抑制50%和90%的菌株生長所對(duì)應(yīng)的抗真菌藥物濃度[15]。FLC的對(duì)隱球菌的折點(diǎn)如下：敏感(S)≤8 μg/mL，劑量依賴性耐藥(SDD)16～32 μg/mL和耐藥(R)≥64 μg/mL；5-FC則分別為：≤ 4 μg/mL(S)、8～16 μg/mL(SDD)和≥32 μg/mL(R)；ITC為：≤0.125 μg/mL(S)、0.25～0.5 μg/mL(SDD)和≥1 μg/mL(R)；VOR的MIC≤1 μg/mL為敏感[5,16-17]。由于目前對(duì)于隱球菌尚無POS、ISA和AmB的折點(diǎn)，因此參考了念珠菌屬的數(shù)據(jù)[18-19]。已有研究顯示，新生隱球菌grubii變種的ECVs(epidemi ological cut-off values)分別：FLC 為8.0 μg/mL，AmB為1.0 μg/mL，5-FC為4 μg/mL，ITC為0.125 μg/mL，VOR為1.0 μg/mL，POS為0.5 μg/mL，ISA為0.25 μg/mL。格特隱球菌為FLC 8 μg/mL,5-FC 4 μg/mL，AmB、ITC、VOR和POS均為0.5 μg/mL，ISA 0.25 μg/mL[20-22]。所有菌株藥敏試驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù)3次，以獲得最佳結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0(美國伊利諾伊州芝加哥市SPSS公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌種和臨床資料的收集

本研究共包括來自86名患者的103株菌株(見表1)。其中男性59名，女性27名。年齡分布范圍為21～84歲。在86名患者中，14名為HIV陽性，72名為HIV陰性。有55人無基礎(chǔ)疾病，21例次患有肝病，7例次患有糖尿病，4例次患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，1例次有免疫抑制治療史，3例次患有肝癌，1例次患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。所有86名患者來自我國廣西壯族自治區(qū)的13個(gè)不同城市(見圖1)。在103株菌株中，17株為系列菌株(即同時(shí)從同一患者的不同部位或在不同時(shí)間從同一部位培養(yǎng)出的菌株)。共有91株來自腦脊液標(biāo)本，7株來自肺組織，3株來自肺泡灌洗，2株來自皮膚組織。

表1 86例隱球菌病患者的人口學(xué)和臨床特征Tab.1 Demographic and clinical characteristics of 86 patients with cryptococcosis

(續(xù)表)

圖1 廣西隱球菌病患者的地理分布Fig.1 Geographical distribution of patients with cryptococcosis in Guangxi

2.2 菌株鑒定

結(jié)合CGB培養(yǎng)基、分子鑒定及MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定結(jié)果，11株菌株被鑒定為格特隱球菌，92株經(jīng)鑒定為新生隱球菌。在本課題組的前期研究中，使用多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)對(duì)11株格特隱球菌及其基因型進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)菌株被鑒定為VGI型，6個(gè)被鑒定為VGII型[23]。

2.3 體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果

所有菌株對(duì)7種抗真菌藥物均敏感，MIC、MIC50和MIC90值如表2所示。92株新生隱球菌grubii變種對(duì)7種抗真菌藥的MIC值分別如下：FLC 0.05～4 μg/mL，AmB 0.25～1 μg/mL，5-FC 0.0625～2 μg/mL，ITC 0.0625～0.25 μg/mL，VOR 0.0078～0.25 μg/mL，POS 0.0313～0.5 μg/mL，ISA 0.0020～0.125 μg/mL。所有92株新生隱球菌grubii變種對(duì)FLC、AmB、VOC、POS和ISA均敏感。其中91株(98.91%)對(duì)5-FC敏感，1株(1.09%)呈劑量依賴性敏感，85.87%(79/92)的菌株對(duì)ITC敏感，其余14.13%(13/92)菌株對(duì)ITC的呈劑量依賴性敏感。

格特隱球菌和新生隱球菌grubii變種類似，未發(fā)現(xiàn)耐藥的菌株(見表 2)。 但值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)其中有一株格特隱球菌的MIC 值高于 FLC 的 ECVs。

表2 抗真菌藥物對(duì)103株隱球菌分離株的MIC范圍、GM、MIC50和MIC90值

3 討 論

本研究對(duì)廣西地區(qū)隱球菌的流行病學(xué)、菌種鑒定和體外抗真菌藥物敏感性進(jìn)行了詳細(xì)地分析。研究發(fā)現(xiàn)，在廣西地區(qū)的大規(guī)模人口中，由新生隱球菌引起的隱球菌病的患病率高于格特隱球菌引起的隱球菌病，與國內(nèi)既往報(bào)道一致[8,24-25]。在本研究的75例新生隱球菌患者中，HIV陽性患者占18.7%，68%患者無基礎(chǔ)疾病，與中國其他地區(qū)的報(bào)道類似，但卻與美國、非洲和歐洲報(bào)告的HIV相關(guān)隱球菌病病例相反[26-27]。研究還發(fā)現(xiàn)新生隱球菌grubii變種是廣西的主要致病菌株[24]。

近年來，MALDI-TOF MS已成為微生物鑒定和診斷的快速、準(zhǔn)確而且經(jīng)濟(jì)有效的新方法[28]，可MIC50和MIC90:能夠分別抑制50%和90%菌株生長的濃度;**GM:幾何平均數(shù);FLC,氟康唑；AmB, 兩性霉素B；5-FC，5-氟胞嘧啶；ITC，伊曲康唑；VOC，伏立康唑；POS：泊沙康唑；ISA：艾沙康唑。

以取代一些傳統(tǒng)的鑒定方法，從而提高臨床的診治水平。此外，MALDI-TOF MS可以鑒定致病真菌的種類來進(jìn)一步預(yù)測耐藥性[14]。既往研究表明MALDITOF MS可以100%將隱球菌準(zhǔn)確鑒定到屬的水平[29-30]。在本次研究中，我們的結(jié)果也顯示MALDI-TOF MS方法與DNA測序的結(jié)果一致性為100%。

本次體外抗真菌藥物敏感性結(jié)果發(fā)現(xiàn)：新生隱球菌和格特隱球菌對(duì)兩性霉素B敏感(MIC 0.25～1 μg/mL)。這與Nascimento的報(bào)告相一致。然而，也有文獻(xiàn)報(bào)道了因MIC值較大而導(dǎo)致臨床治療失敗的例子[31]。

有研究發(fā)現(xiàn)，體外藥敏試驗(yàn)FLC對(duì)新生隱球菌的MIC值較低[32]。然而，也有報(bào)道新生隱球菌有較高的MIC50和MIC90值(4～8 μg/mL和2～128 μg/mL)[15]。在本研究中，氟康唑的MIC50和MIC90值分別為2 μg/mL和4 μg/mL，均未發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。文獻(xiàn)報(bào)道氟康唑?qū)Ω裉仉[球菌的 MIC 值很高(≥64 μg/mL)[32-33]。在與本研究相比，我們檢測到的MIC值≤16 μg/mL。這一觀察結(jié)果引起了人們對(duì)耐藥性的關(guān)注，并表明 FLC 單獨(dú)用于治療時(shí)可能會(huì)失去其效力。

新的唑類藥物(伏立康唑、泊沙康唑和艾沙康唑)對(duì)所有新生隱球菌及格特隱球菌均有較好的抗真菌活性，MIC均小于0.5 μg/mL，這與Pfaller等的報(bào)告一致。在本次研究中，伊曲康唑?qū)Υ蟛糠蛛[球菌表現(xiàn)出較高的活性，MIC≤0.25，與Herkert等[34]的報(bào)告相似甚至更低；然而，有13株新生隱球菌(14.13%)對(duì)伊曲康唑呈劑量依賴性。同樣，來自塞爾維亞的新生隱球菌菌株也曾報(bào)道對(duì)伊曲康唑具有劑量依賴性敏感[35]。不過，由于伊曲康唑不易透過血腦屏障，所以在治療隱球菌性腦膜炎時(shí)很少作為單一藥物使用。

大量研究表明，5-FC 對(duì)新生隱球菌和格特隱球菌的MIC值≤64 μg/mL[35-36]。 在本研究中，除了一株新生隱球菌 (1.09%) 對(duì) 5-FC 呈劑量依賴性敏感，其余所有菌株都對(duì)5-FC敏感，MIC值≤2 μg/mL。

在本次研究中，新生隱球菌與格特隱球菌(格特隱球菌為VG Ⅰ型和VG Ⅱ型兩種類型)對(duì)7種抗真菌藥物的敏感性之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)CLSI M27-A4標(biāo)準(zhǔn)，本研究中除了其中一株可能對(duì) FLC 產(chǎn)生耐藥的菌株，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究以確認(rèn)它是否為非野生型，其余大多數(shù)菌株都是野生型。

綜上所述，隱球菌病是一種復(fù)雜的疾病，但由于隱球菌病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，在診斷上極其容易誤診。新生隱球菌grubii變種是廣西最優(yōu)勢的菌株。 MALDI-TOF MS是一種快速可靠的鑒定隱球菌屬的方法。所有分離株均對(duì)常用抗真菌藥物無耐藥性，對(duì)新型三唑類藥物高度敏感?？拐婢幟粼囼?yàn)有助于早期發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，對(duì)及時(shí)有效地治療隱球菌病具有重要意義。