基于分子動力學(xué)模擬的TRPM8通道門控特性分析

高志偉， 李軍委， 史賽， 付強(qiáng)， 賈鈞儒， 安海龍

基于分子動力學(xué)模擬的TRPM8通道門控特性分析

高志偉1， 李軍委2， 史賽1， 付強(qiáng)1， 賈鈞儒1， 安海龍2

（1. 河北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院， 2. 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院, 生物物理研究所, 河北省分子生物物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300401）

TRPM8通道的溫度感知等生理功能依賴于正常的門控, 但現(xiàn)有晶體結(jié)構(gòu)中S6跨膜螺旋C末端形成的門控結(jié)構(gòu)存在氨基酸缺失, 所以其門控特性未能揭曉. 本文基于已有的晶體結(jié)構(gòu)和AlphaFold算法構(gòu)建了 11個(gè)完整不同構(gòu)象的TRPM8通道, 發(fā)現(xiàn)其S6跨膜螺旋C末端構(gòu)成的門控存在回環(huán)和螺旋2種構(gòu)象. 在回環(huán)構(gòu)象中, 多個(gè)氨基酸參與形成阻礙離子通透的孔道區(qū); 而在螺旋構(gòu)象中, 僅有關(guān)鍵氨基酸V956發(fā)揮門控作用. 由于回環(huán)構(gòu)象的柔性大于螺旋構(gòu)象, 導(dǎo)致回環(huán)構(gòu)象參與阻礙離子通透的關(guān)鍵氨基酸構(gòu)象和數(shù)量變化多樣. 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與模建結(jié)果表明, S6跨膜螺旋C末端存在回環(huán)構(gòu)象向螺旋構(gòu)象的轉(zhuǎn)變, 此過程中柔性的回環(huán)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域向胞外側(cè)上移, 關(guān)鍵氨基酸向孔道襯外扭轉(zhuǎn), 增強(qiáng)了與相鄰跨膜螺旋S5的相互作用以及S5與TRP螺旋之間的相互作用, 進(jìn)而形成剛性、 穩(wěn)定且有序的螺旋構(gòu)象. 這增加了TRPM8通道各結(jié)構(gòu)域間的協(xié)同性, 使能量信息更高效地傳遞到門控結(jié)構(gòu)域, 為TRPM8通道開啟蓄勢.

TRPM8通道； 門控； 同源模建； 分子動力學(xué)模擬

TRPM（Transient receptor potential melastatin）家族是TRP超家族中最大和最多樣化的亞家族［1］. 該亞家族成員與溫度、 味覺等環(huán)境信號感知密切相關(guān)［2］. TRPM亞家族在激活模式、 陽離子選擇性和組織分布等方面存在差異， 但在結(jié)構(gòu)上TRPM通道跨膜螺旋S6的C末端區(qū)域有一段高度保守的氨基酸序列， 稱為TRP螺旋［3］.

瞬時(shí)受體電位M8型離子通道（TRPM8）是TRPM家族的成員之一［4］. 該通道主要表達(dá)于外周感覺神經(jīng)元， 但也存在于前列腺、 支氣管肺組織、 膀胱和泌尿生殖道中［5］. 目前， 已知TRPM8參與各種病理過程， 如與炎癥或神經(jīng)損傷后的冷痛癥密切相關(guān)， 以及在炎癥后冷性痛覺超敏等疼痛條件中起到關(guān)鍵作用［6］.

TRPM8通道是一種多模態(tài)、 非選擇性陽離子通道， 對Ca2+等陽離子敏感. TRPM通道的多模態(tài)［7］則表現(xiàn)在受低溫（<28 ℃）、 膜去極化及冷相關(guān)化合物（薄荷醇、 Icilin和桉樹腦等）等多種物理化學(xué)刺激的調(diào)控［4］. TRPM8通道是冷刺激感受離子通道， 是感受溫度和疼痛的受體單元［8］， 還可以通過激活該通道增加眼淚緩解干眼癥［9］. 因此， TRPM8通道可作為藥物開發(fā)的作用靶點(diǎn). 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究可為靶向調(diào)控藥物或小分子探針的設(shè)計(jì)提供研究基礎(chǔ)［10～12］.

目前， 關(guān)于TRPM8通道已經(jīng)報(bào)道了8種晶體結(jié)構(gòu)（表S1， 見文本支持信息）， 其中包括3種激動劑復(fù)合結(jié)構(gòu)（PDBID： 6NR2， 6NR3， 6NR4）， 2種拮抗劑復(fù)合結(jié)構(gòu)（PDBID： 6O72， 6O6R）， 1種高濃度Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)（PDBID： 6O77）和2種無配體蛋白結(jié)構(gòu)（PDBID： 6BPQ， 6O6A）［13～15］. TRPM8通道是一種同源四聚體， 每個(gè)單體包含跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（CD）. 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域由N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）組成. N端結(jié)構(gòu)域由4個(gè)MHR（Melastatin homology regions， MHRs）組成. C端結(jié)構(gòu)域由位于TRP結(jié)構(gòu)域C端的3段螺旋（CTDH1/2和CC）組成. 在跨膜結(jié)構(gòu)域中， 跨膜螺旋S1～S4組成電壓感受域（VSLD）， 跨膜螺旋S5和S6及1個(gè)孔螺旋（PH）形成孔域（PD）. 在孔域中， 4個(gè)同源單體的S6螺旋 C末端相互交叉形成阻礙離子通透的空間位阻［16］. S6螺旋向C端方向延伸是TRP螺旋， 其將跨膜結(jié)構(gòu)域連接組成一個(gè)整體， 是跨膜結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域重要的鏈接結(jié)構(gòu)［14］.

離子通道功能是通過其構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)的， 而構(gòu)象變化的產(chǎn)生則依賴于調(diào)控因子與通道間的相互作用［10，17，18］. 由此可知， 作用位點(diǎn)對通道的變構(gòu)至關(guān)重要. TRPM8通道的電壓感受結(jié)構(gòu)域（S1～S4螺旋）形成腔室是激動劑（WS-12， Icilin和薄荷醇等）， 拮抗劑（TC-Ⅰ 2014和AMTB等）， 以及Ca2+的重要結(jié)合位點(diǎn)［16］. S1， S4和TRP螺旋形成的狹縫是小分子磷脂酰基醇4，5-2磷酸（PIP2）的結(jié)合位點(diǎn). S4-S5連接子運(yùn)動是薄荷醇激活TRPM8通道的重要表現(xiàn)［7］； 磷脂分子PIP2在TRPM8通道激活過程中可能影響S4-S5鏈接子和TRP螺旋的空間結(jié)構(gòu)， 達(dá)到調(diào)控通道功能的目的［14，15］. 生物學(xué)濕實(shí)驗(yàn)表明， 薄荷醇對TRPM8通道的激活機(jī)制與S4-S5連接子運(yùn)動相關(guān)［16］； 對比冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)， 磷脂分子PIP2在TRPM8通道激活過程中可能影響S4-S5鏈接子和TRP螺旋的空間結(jié)構(gòu)， 達(dá)到調(diào)控通道功能的目的［14］； 晶體結(jié)構(gòu)分析表明， 在門控發(fā)生大尺度構(gòu)象變化時(shí)， S6螺旋發(fā)生彎折， 彎折點(diǎn)處的螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪?，是門控開啟的重要結(jié)構(gòu)變化［13］.

迄今， 結(jié)構(gòu)生物學(xué)家雖然提供了多個(gè)TRPM8通道的晶體結(jié)構(gòu)， 但關(guān)鍵區(qū)域氨基酸或者氨基酸側(cè)鏈存在缺失. 靜態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)均不能明確通道的門控微觀結(jié)構(gòu)， 需進(jìn)一步挖掘TRPM8通道的門控特性， 揭示其門控動力學(xué)行為， 從而為基于TRPM8通道靶給藥物研發(fā)設(shè)計(jì)提供理論支持. 本文基于現(xiàn)有TRPM8通道晶體結(jié)構(gòu)和AlphaFold計(jì)算結(jié)構(gòu)， 通過“嫁接”優(yōu)化同源模建模板， 重構(gòu)了完整的通道結(jié)構(gòu)， 并對模建結(jié)果進(jìn)行了分析評估. 研究結(jié)果表明， TRPM8通道S6跨膜螺旋C末端（門控）存在柔性、 不確定、 無序的回環(huán)構(gòu)象和剛性、 穩(wěn)定、 有序的螺旋構(gòu)象2種不同構(gòu)象. 推測回環(huán)向螺旋變構(gòu)過程中胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域向胞外側(cè)上移， 門控氨基酸向孔道襯外扭轉(zhuǎn)， 增強(qiáng)了跨膜螺旋S5， S6和TRP螺旋間的相互作用， 提升了各結(jié)構(gòu)域間的協(xié)同性， 有利于TRPM8通道門控的開啟.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1　同源模建

根據(jù)白領(lǐng)姬鹟（PDBID： 6NR2）的氨基酸序列， 以PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.pdbus.org/）和AlphaFold （https：//www.alphafold.ebi.ac.uk/）云計(jì)算鼠源（UniprotKB： Q8R455， Q8R54D5）、 人源（UniprotKB： Q7Z2W7）結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)模板［19］， 通過模板的構(gòu)象互補(bǔ)， 大規(guī)模缺失的區(qū)域嫁接補(bǔ)充， 對基礎(chǔ)模板進(jìn)行了優(yōu)化重構(gòu)， 使用SWISS-MODEL模建服務(wù)平臺（https：//swissmodel.expasy.org/）模建了11個(gè)完整的TRPM8通道結(jié)構(gòu)［20］.

通過比較現(xiàn)有的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)， 6NR2缺失了胞外環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)（Ⅰ區(qū)域）， 但是在Ⅲ區(qū)域缺失最少 ［圖1（A）］； 6O77的Ⅰ區(qū)域是TRPM8唯一完整的晶體結(jié)構(gòu)， 但是在Ⅲ區(qū)域缺失大量氨基酸［圖1（C）］. 6NR2和6O77大部分的缺失區(qū)域存在互補(bǔ)性， 所以進(jìn)行相互“嫁接”， 優(yōu)化模建的模板. 使用SWISS-MODEL平臺同源模建， 得到2種完整的TRPM8通道結(jié)構(gòu)6NR2-2［圖1（B）］和6O77-2［圖1（D）］. 依據(jù)此方法模建了6O6R， 6NR2， 6NR4， 6O72， 6BPQ， 6O6A， 6NR3和6O77的結(jié)構(gòu)模型， 并以AlphaFold云計(jì)算結(jié)構(gòu)為模板同源模建得到3個(gè)TRPM8通道蛋白結(jié)構(gòu).

Fig.1　Structural models and the Ramachandran Plot statistics

The crystal structures of 6NR2（A） and 6O77（B）； the homology modeling structures of 6NR2（C）， 6O77（D） and AlphaFold（E， F）； the statistical results of the Ramachandran Plot（G）.

1.2　分子動力學(xué)模擬參數(shù)設(shè)置

首先， 用同源模建結(jié)果的最優(yōu)結(jié)構(gòu)構(gòu)建同源四聚體， 并將TRPM8的四聚體結(jié)構(gòu)嵌入1-棕櫚酰-2-油酰-卵磷脂（POPC）的磷脂膜中. 將蛋白質(zhì)雙層系統(tǒng)浸入大小為15.6 nm×15.7 nm×14.9 nm的水分子盒中， 添加0.4 mol/L的CaCl2離子， 使模擬系統(tǒng)凈電荷為0， 構(gòu)建成約363000個(gè)原子的動力學(xué)模擬體系.

使用NAMD進(jìn)行分子動力學(xué)模擬， 整個(gè)體系使用CHARMM36全原子力場［21，22］， 溶劑水分子使用TIP3P模型， 在 310 K的恒定溫度下進(jìn)行， 并在所有方向應(yīng)用周期性邊界條件［23］. 采用Particle Mesh Ewald（PME）方法計(jì)算長程靜電相互作用， 以距離1.2 nm截?cái)喟霃接?jì)算范德華相互作用. 在動力學(xué)模擬運(yùn)行前先進(jìn)行500000步的能量最小化以消除不良接觸， 逐步釋放膜磷脂分子、 水分子、 離子和蛋白后， 在NPT系綜下進(jìn)行100 ns分子動力學(xué)模擬， 并2 ps記錄一次軌跡［11］.

1.3　氨基酸相互作用計(jì)算

氨基酸間的相互作用使用VMD插件NAMD Energy（V1.4）計(jì)算完成［24，25］. NAMD Energy使用標(biāo)準(zhǔn)VMD原子選擇語言標(biāo)識2處氨基酸， 則計(jì)算2處氨基酸之間的相互作用能. 指定計(jì)算能量類型為非鍵合能量包含靜電相互作用和范德華相互作用； 孔道圖使用Hole程序計(jì)算繪制得出［26］； 氨基酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用JPred4計(jì)算完成［27］； 結(jié)構(gòu)可視化、 數(shù)據(jù)分析和圖形繪制使用VMD軟件［28］.

2 結(jié)果與討論

2.1　模型可靠性分析

雖然TRPM8通道的晶體結(jié)構(gòu)描述了整體構(gòu)象， 但也存在部分氨基酸的缺失（表S1）或側(cè)鏈不完整. 根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)相似互補(bǔ)， 采用相互“嫁接”的方法， 進(jìn)行同源模建. 模建結(jié)果中， 不僅6NR2和6O77的“嫁接”部分（Ⅰ區(qū)域）與AlphaFold計(jì)算的相應(yīng)結(jié)構(gòu)很相似（RMSD值相差0.19 nm）， 而且6O77的S6螺旋 C末端、 鏈接TRP螺旋的Ⅱ區(qū)域也與AlphaFold計(jì)算結(jié)構(gòu)相似（RMSD值相差0.11 nm）.

在同源模建的結(jié)構(gòu)中， S6螺旋與TRP螺旋鏈接的Ⅱ區(qū)域出現(xiàn)較大差異. 同源模建的6O6R， 6NR2， 6NR4， 6O72和6O6A結(jié)構(gòu)在Ⅱ區(qū)域展現(xiàn)為回環(huán)構(gòu)象； 而6NR3和6O77結(jié)構(gòu)中卻為螺旋構(gòu)象. 為了證明 Ⅱ區(qū)域存在不同構(gòu)象， 定義了一個(gè)距離（表S2， 見文本支持信息）， 即S6螺旋中的氨基酸M958到TRP螺旋N末端的距離［圖1（C）］. 假若在距離中填充螺旋， 可根據(jù)理論上需要氨基酸個(gè)數(shù)與實(shí)際個(gè)數(shù)差值分為兩類： 一類是差值接近或大于3個(gè)氨基酸的模建結(jié)果， 包含6O72， 6O6A， 6O6R， 6NR2和6NR4； 另一類是差值小于一個(gè)氨基酸的模建結(jié)果， 包含6NR3和6O77. 這恰好與模建中形成不同的非螺旋和螺旋構(gòu)象結(jié)果相符. OPM數(shù)據(jù)計(jì)算顯示Ⅱ區(qū)域在膜內(nèi)側(cè)， 而非跨膜結(jié)構(gòu)， 所以此結(jié)構(gòu)有可能實(shí)現(xiàn)回環(huán)構(gòu)象和螺旋構(gòu)象間的相互轉(zhuǎn)變［29］（圖S1， 見文本支持信息）. 同時(shí)， 研究證實(shí)由于Ⅱ區(qū)域構(gòu)象的靈活多變， 導(dǎo)致未解析出此結(jié)構(gòu)域， 這與模建構(gòu)象具有結(jié)構(gòu)多樣性的結(jié)果一致［13］.

對同源模建的結(jié)果模型進(jìn)行了評估. 模建的氨基酸序列與白領(lǐng)姬鹟序列（6NR2， 6NR4， 6BPQ 和6NR3）的同源性大于96.9%， 與大山雀序列（6O6R， 6O72， 6O6A和6O77）的同源性為97.9%， 與 鼠源和人源（AlphaFold云計(jì)算結(jié)果UniprotKB： Q8R455， Q8R54D5和Q7Z2W7）的同源性大于78.6%. 拉氏圖計(jì)算結(jié)果表明， 6NR2和6O77模建結(jié)果分別在允許區(qū)域以上的比值達(dá)到99.4%（6NR2-2）和98.4%（6O77-2）， 比直接模建模型拉氏結(jié)果98.1%（6NR2）和97.4%（6O77）分別上升了1.3%和1% ［圖1（F）］， 說明“嫁接”模建結(jié)構(gòu)的二面角合理性取得進(jìn)步. TRPM8通道同源模建結(jié)構(gòu)的主鏈與模板完全重合（圖S2， 見文本支持信息）， QMEANDisCo Global評分［30］等蛋白三維結(jié)構(gòu)評估均在合理范圍內(nèi)， 充分說明“嫁接”優(yōu)化模板模建的結(jié)果合理可靠.

2.2　基于同源模建的TRPM8通道門控微觀結(jié)構(gòu)分析

TRPM8通道4個(gè)同源單體的S5和S6跨膜螺旋構(gòu)成孔道， S6螺旋的C末端區(qū)域能夠阻礙孔道中陽離子的通透， 形成TRPM8通道的門控結(jié)構(gòu)域. 參與門控的關(guān)鍵氨基酸包含L954～E968. 門控的開啟或關(guān)閉在孔道圖中用不同顏色表示， 藍(lán)色區(qū)域表示離子可跨膜通透， 而綠色或者紅色區(qū)域?yàn)樽璧K離子通透的路徑.

所有模型的孔道圖在門控結(jié)構(gòu)域均出現(xiàn)紅色或者綠色的狹窄區(qū)域， 所以TRPM8通道同源模建結(jié)果的所有結(jié)構(gòu)均未出現(xiàn)開放態(tài)的構(gòu)象， 但是門控處的氨基酸構(gòu)象卻表現(xiàn)出很大的差異. 以6NR2結(jié)構(gòu)模建得到的孔道圖表明， 氨基酸M958和F959側(cè)鏈指向孔內(nèi)， 并形成了綠色或紅色狹窄的路徑， 與 晶體結(jié)構(gòu)一致［圖2（A）］； 同時(shí)， 其它氨基酸Y961， Q967和E968也可能參與阻礙離子通透門控過程 ［圖2（A）～（C）］. 以6NR3結(jié)構(gòu)模建得到的孔道圖表明， L954， M958， T962和V963側(cè)鏈指向孔內(nèi)， 并形成阻礙離子透過的空間位阻［圖2（D）］. 這種構(gòu)象的關(guān)鍵門控氨基酸數(shù)量多， 且構(gòu)象變化多樣.

Fig.2　Conformational changes of the ion permeation pore

The zoom-in view of the bundle crossing gate illustrated that residues known to be critical for ions passing； the solvent accessible pathway as generated by the HOLE software is illustrated as red（radiussize of a water molecule） surface； hole diagram of model 6NR2（A）， 6NR4（B）， 6O72（C）， 6NR3（D）， 6O77（E） and AlphaFold（F）； amino acid name in （A） to （F） is on the right.

以6O77和AlphaFold結(jié)構(gòu)同源模建結(jié)果表明， 阻礙離子通透的氨基酸僅有V956， 這與晶體結(jié)構(gòu)一致［13］. 此時(shí)， 參與門控的氨基酸L954， M958， F959， T962， V963， Q967和E968都不再指向孔道內(nèi)側(cè)， 而是指向孔道襯外［圖2（E）和2（F）］. 這可能是由于以6NR2模建的門控結(jié)構(gòu)域處于非螺旋態(tài)， 而以6O77和AlphaFold模建的門控結(jié)構(gòu)域則處于螺旋態(tài). 在TRPM8通道中跨膜螺旋S6上的氨基酸V956不僅參與影響離子跨膜通透的門控過程， 還具有調(diào)控通道離子選擇性的作用. 這說明氨基酸V956在控制離子選擇通透過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［19，31］.

2.3　TRPM8通道門控結(jié)構(gòu)處存在兩種不同構(gòu)象

通過比較多個(gè)同源模建結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)， 門控結(jié)構(gòu)域存在回環(huán)和螺旋2種構(gòu)象［圖3（A）和（B）］， 其中以6NR2， 6NR4， 6O6A， 6O72， 6O6R為模板構(gòu)建的完整TRPM8模型門控結(jié)構(gòu)域是回環(huán)構(gòu)象； 以6O77和AlphaFold計(jì)算的結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建的完整模型門控結(jié)構(gòu)域是螺旋構(gòu)象［圖3（B）］. 門控結(jié)構(gòu)域兩種構(gòu)象的差異直觀地表現(xiàn)在TRP螺旋N末端最低處到細(xì)胞膜中心的距離. 在此， 定義TRPM8通道四聚體S6螺旋上的氨基酸V940主鏈中心到TRP螺旋N末端最低處的距離（可以表示為孔道的長度）和TRP 螺旋的傾斜角度［圖3（A）和（B）］， 通過計(jì)算得出6O6R， 6NR2， 6NR4， 6O72， 6O6A， 6NR3和6O77同源模建的完整模型的孔道長度分別為3.92， 3.90， 3.86， 3.83， 3.71， 3.26和3.16 nm， 傾斜角度分別為33.61°， 30.49°， 25.65°， 31.33°， 33.86°， 17.11°和18.55°. 可見， 以6O6R， 6NR2， 6NR4， 6O72和6O6A為模板構(gòu)建的模型孔道長度均大于3.7 nm， TRP傾斜角度大于25°， 此時(shí)S6螺旋C末端主鏈構(gòu)象為回環(huán)； 以6O77為模板構(gòu)建的模型的孔道長度在3.2 nm左右， TRP傾斜角度約為18°， 此時(shí)門控微觀結(jié)構(gòu)處于螺旋態(tài)［圖3（C）］. 以6NR3為模板構(gòu)建的模型的指標(biāo)雖與6O77相近， 但門控結(jié)構(gòu)并未完全形成螺旋. 孔道高度和TRP螺旋角度均說明門控微觀結(jié)構(gòu)存在回環(huán)和螺旋2種構(gòu)象， 導(dǎo)致孔道構(gòu)象不同.

Fig.3　Statistical height of the ion permeation pore and angle of TRP helix, secondary structure prediction of gate amino acids

（A） The structure of loop gate； （B） the binding-crossing of helical gate； （C） the distance statistics from S6 helix to N terminal of TRP helix on the left and the angle of TRP helix on the right； （D） prediction of secondary structure of gates amino acids.

對門控區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測. 結(jié)果表明， 門控結(jié)構(gòu)域在JNetPRED （共識預(yù)測）、 JNetHMM（基于隱馬爾可夫模型的預(yù)測）和JNetPSSM（基于位置特定評分矩陣的預(yù)測） 3種預(yù)測中， 都傾向于形成螺旋， 用紅色的長條形表示［圖3（D）］. JNetCONF表示預(yù)測螺旋的置信度， 用高度值（0～9）或用黑色條形方框的占據(jù)來表示. 數(shù)值越大， 黑色條形框占據(jù)越多， 形成螺旋的可能性越大； 反之形成螺旋的可能性越小. L954～A957的置信度較高， 傾向于形成螺旋， 而M958～T962形成螺旋的置信度較小， 可能形成非螺旋. 以上結(jié)果表明， 此段氨基酸既有傾向于形成螺旋構(gòu)象的趨勢， 又存在非螺旋構(gòu)象的可能性.

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與文獻(xiàn)報(bào)道均表明， TRPM8通道S6螺旋C末端（門控結(jié)構(gòu)域）處在2種不同的結(jié)構(gòu)， 即回環(huán)和螺旋態(tài)［32］. 由此推測回環(huán)構(gòu)象可以向螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變， 此過程中TRPM8通道TRP螺旋傾斜角度降低， 回環(huán)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域向胞外側(cè)上移， 門控氨基酸向孔道襯外扭轉(zhuǎn)， 孔道長度變短， S6跨膜螺旋C末端氨基酸形成穩(wěn)定有序的螺旋構(gòu)象， 影響門控開啟［17］. 該轉(zhuǎn)變現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在TRPM8通道中， 在內(nèi)向整流鉀離子Kir2.1通道中也同樣存在. Kir2.1通道受PIP2分子調(diào)控， 當(dāng)通道處于關(guān)閉態(tài)時(shí)， PIP2分子與通道的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域處于回環(huán)構(gòu)象； 當(dāng)結(jié)合PIP2分子時(shí)， Kir2.1通道激活， PIP2分子拉動胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域向細(xì)胞膜方向移動， 結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域縮短， 回環(huán)構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪龢?gòu)象［33］.

2.4　門控微觀結(jié)構(gòu)處于不同構(gòu)象的動力學(xué)分析

在Hole孔道圖中發(fā)現(xiàn)處于回環(huán)態(tài)的TRPM8通道， 使用相同的模板卻構(gòu)建出多個(gè)不同的孔道構(gòu)象； 而處于螺旋時(shí)不同的模板則模建出相似的孔道構(gòu)象， 這可能與其柔性相關(guān). 基于此， 對回環(huán)態(tài)中以6NR2為模板構(gòu)建的模型和螺旋態(tài)中以6O77為模板構(gòu)建的模型， 在NPT系綜下進(jìn)行了100 ns自由馳豫的動力學(xué)模擬. 2種狀態(tài)的均方根偏差（RMSD）基本相同， 都穩(wěn)定在0.32 nm左右［圖4（A）］， 說明處在2種狀態(tài)的TRPM8通道均是穩(wěn)定的結(jié)構(gòu). 通過分析用于表征結(jié)構(gòu)域柔性的均方根漲落（RMSF）， 發(fā)現(xiàn)回環(huán)態(tài)的G960到N970的RMSF值為0.24 nm左右（藍(lán)色曲線）， 而螺旋態(tài)G960到N970的RMSF值為0.15 nm左右［圖4（B）紅色曲線］. 以上結(jié)果表明， 當(dāng)門控區(qū)域處在回環(huán)態(tài)時(shí)的柔性明顯高于螺旋態(tài).

Fig.4　Root?mean?square deviation(RMSD) and root mean square fluctuation(RMSF) plots of 6NR2 or 6O77 systems under MD simulation

回環(huán)構(gòu)象的柔性大， 形成門控的氨基酸可靈活擺動， 具有不確定性， 是一種無序的構(gòu)象； 而螺旋構(gòu)象則剛性強(qiáng)， 門控氨基酸較穩(wěn)定， 是一種相對有序的構(gòu)象. 因此， 門控結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出不同的柔性： 回環(huán)態(tài)的門控結(jié)構(gòu)柔性大， 氨基酸不確定性和無序性導(dǎo)致形成阻礙離子通透的氨基酸數(shù)量多且構(gòu)象多樣； 而螺旋態(tài)的門控結(jié)構(gòu)剛性大， 氨基酸構(gòu)象穩(wěn)定， 且僅有氨基酸V956發(fā)揮門控作用.

2.5　處于兩種不同構(gòu)象的關(guān)鍵氨基酸相互作用分析

回環(huán)構(gòu)象的柔性高于螺旋構(gòu)象， 除與自身相鄰氨基酸的相互作用有關(guān)外（回環(huán)本身柔性大）， 還與其周圍氨基酸的相互作用密切相關(guān). 因此， 100 ns分子動力學(xué)模擬過程中不同構(gòu)象（回環(huán)和螺旋）門控結(jié)構(gòu)域與S5螺旋的相互作用也有差異. 在這2種不同體系中， 雖然回環(huán)和螺旋的構(gòu)象未發(fā)生改變， 但S6螺旋C末端氨基酸M958， F959和T962的構(gòu)象存在較大差異. 在回環(huán)態(tài)中， 以上3個(gè)氨基酸指向孔道域， 形成阻礙離子通透的勢壘區(qū)［圖5（A）］； 而在螺旋態(tài)中， 這3個(gè)氨基酸由指向孔域轉(zhuǎn)變?yōu)槠x孔域， 指向S5跨膜螺旋方向［圖5（B）］. 此種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是處在回環(huán)構(gòu)象的氨基酸上升， 扭轉(zhuǎn)形成螺旋構(gòu)象. 蛋白質(zhì)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變必定伴隨有相互作用的變化.

當(dāng)TRPM8通道門控結(jié)構(gòu)域?yàn)榛丨h(huán)構(gòu)象時(shí)， 3個(gè)氨基酸M958， F959和T962指向孔道域， 偏離S5跨膜螺旋， 故在動力學(xué)過程中這3個(gè)氨基酸與相鄰跨膜螺旋S5上F849和M843氨基酸存在相互作用， M958與F849相互作用為（-0.21±0.13） kJ/mol［圖5（C）］， F959與M843相互作用為（-2.80±0.71） kJ/mol［圖5（D）］， T962與M843相互作用為（-0.08±0.08） kJ/mol［圖5（E）]. 當(dāng)處在螺旋構(gòu)象時(shí)， 3個(gè)氨基酸M958， F959和T962偏離孔道域， 指向S5跨膜螺旋， 故在動力學(xué)過程中這3個(gè)氨基酸分別與相鄰跨 膜螺旋S5上F849和M843氨基酸相互作用為（-4.14±1.13） kJ/mol［圖5（C）］， （-18.70±1.80） kJ/mol ［圖5（D）］和（-8.66±2.76） kJ/mol［圖5（E）］. 除S6螺旋中3個(gè)明顯偏轉(zhuǎn)的氨基酸與S5螺旋發(fā)生相互作用外， 螺旋態(tài)的S6門控結(jié)構(gòu)域與S5螺旋總相互作用為（-259.83±47.57） kJ/mol； 回環(huán)態(tài)的S6門控結(jié)構(gòu)域與S5螺旋總相互作用為（-45.44±19.04） kJ/mol［圖5（F）］ . 除以上相互作用外， 門控結(jié)構(gòu)域處于不同構(gòu)象時(shí)TRP螺旋與S5螺旋的相互作用也存在不同. 當(dāng)處于螺旋態(tài)時(shí)， 位于TRP螺旋上的N970與S5螺旋N末端的R842間的相互作用為（-35.69±5.31）kJ/mol； 當(dāng)處于回環(huán)態(tài)時(shí)， N970與R842間的相互作用為0～45 ns為（-0.54±0.42） kJ/mol， 45～100 ns為0 kJ/mol［圖5（G）］. 氨基酸R842是多個(gè)激動劑（薄荷醇、 WS-12和Icilin）的結(jié)合位點(diǎn)［7，14］， 因此加強(qiáng)了激動劑、 S5螺旋和TRP螺旋彼此間的相互作用， S5螺旋與TRP螺旋間的相互作用對于門控的開啟至關(guān)重要［34］. 相互作用分析結(jié)果表明， 螺旋態(tài)的門控結(jié)構(gòu)域與相鄰螺旋S5的相互作用均強(qiáng)于回環(huán)態(tài)， 與TRP螺旋的相互作用也強(qiáng)于回環(huán)態(tài).

Fig.5　Interaction between the binding?crossing domain and S5 helix

The structure of loop gate（A） and helical gate（B）； the interaction of M958 with F849（C）， F959 with M843（D）， T962 with M843（E）， the bundle crossing（956 to 970） with S5 N-terminal（840 to 850）（F）， N970 with R842（G）； （A， B） the main chain is represented by band， and the side chain amino acids are represented by rod； （C—G） blue indicates the interaction of loop gate and red indicates the interaction of amino acids in the bundle crossing of helical gate； theaxis stands for the total energy of electrostatic interactions and Van Der Waals interactions.

當(dāng)TRPM8通道S6螺旋C末端交叉束結(jié)構(gòu)域， 即門控結(jié)構(gòu)域處于回環(huán)態(tài)時(shí)， 其氨基酸與相鄰螺旋S5的相互作用很弱， 柔性強(qiáng)， 導(dǎo)致其門控結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象多變， 形成門控的氨基酸數(shù)量不確定， 此時(shí)的門控結(jié)構(gòu)域處于一種無序的構(gòu)象； 當(dāng)處于螺旋態(tài)時(shí)， 其氨基酸與相鄰螺旋S5的相互作用增強(qiáng)， 柔性減弱， 剛性增強(qiáng)， 形成門控的氨基酸僅有一個(gè)， 此時(shí)的門控結(jié)構(gòu)域處于一種穩(wěn)定有序的構(gòu)象. 以上結(jié)果表明， 門控結(jié)構(gòu)域由回環(huán)態(tài)向螺旋態(tài)變構(gòu)時(shí)， 其與相鄰跨膜螺旋S5的相互作用增強(qiáng)； TRP螺旋與S5螺旋的相互作用也增強(qiáng). 以上增強(qiáng)的相互作用不僅能維持S6螺旋C末端處于穩(wěn)定且有序的螺旋態(tài)， 而且加強(qiáng)了TRP螺旋、 跨膜螺旋S5和S6相互作用， 增加了各結(jié)構(gòu)域間的協(xié)同性. 因此， TRPM8通道的門控表現(xiàn)出與周圍相互作用氨基酸的兩種相互作用強(qiáng)度： 當(dāng)門控結(jié)構(gòu)域處于回環(huán)態(tài)時(shí)， 與周圍氨基酸相互作用弱， 不利于電壓敏感域的相互作用傳遞到門控氨基酸； 而處于螺旋態(tài)時(shí)， 與周圍氨基酸相互作用強(qiáng)， 有利于增強(qiáng)各結(jié)構(gòu)域運(yùn)動的協(xié)調(diào)性， 為TRPM8通道的開啟奠定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).

TRPM8通道的激活與S5螺旋、 TRP螺旋運(yùn)動密切相關(guān)［1］. 調(diào)控因子PIP2磷脂分子能夠促進(jìn)TRPM8通道跨膜螺旋S5向遠(yuǎn)離孔域方向移動， 且TRP螺旋靠近孔域端向上傾斜［15，17］. 薄荷醇小分子激活TRPM8通道是通過S4-S5連接子運(yùn)動實(shí)現(xiàn)的［7］. TRPM其它亞家族通道調(diào)控同樣與S4-S5螺旋的連接子和TRP螺旋的運(yùn)動密切相關(guān). 研究發(fā)現(xiàn)， TRPM2通道的TRP螺旋可以整合胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、 電壓感受域和S4-S5連接子的能量和信息， 直接拉拽S6螺旋C末端調(diào)控通道開啟［35］； TRP螺旋的運(yùn)動也能夠促進(jìn)激活因子Ca2+與TRPM5通道的結(jié)合［35，36］， 將TRPM4通道電壓感受域S1-S4的信息傳遞到孔域， 調(diào)控通道開閉［37］.

3 結(jié) 論

TRPM8通道中結(jié)合配體的能量信息傳遞到門控結(jié)構(gòu)域要經(jīng)過兩個(gè)途徑： 其一是通過S4-S5螺旋連接子作用S5跨膜螺旋； 其二是通過TRP螺旋的運(yùn)動. 由于有些激活小分子結(jié)合在S1-S4電壓感受域， 促使電壓感受域發(fā)生運(yùn)動， S4螺旋通過S4-S5螺旋連接子與螺旋S5相連接， 進(jìn)而拉拽S5發(fā)生運(yùn)動； 如果S5螺旋與S6螺旋間存在相互作用， 則有利于門控的開啟. 相對S4-S5連接子的間接作用， TRP螺旋直接與S6螺旋C末端（門控結(jié)構(gòu)域）相連接. 當(dāng)門控結(jié)構(gòu)域處于螺旋構(gòu)象時(shí)， 加強(qiáng)了與S5螺旋、 TRP螺旋間相互作用， 比回環(huán)構(gòu)象更具剛性、 穩(wěn)定性和有序性. 因此， 門控結(jié)構(gòu)域處于螺旋構(gòu)象時(shí)更具協(xié)同性， 有利于TRPM8通道門控的開啟.

本文采用同源模建的方法構(gòu)建了若干個(gè)完整的TRPM8通道結(jié)構(gòu)， 采用分子動力學(xué)模擬的方法研究了TRPM8通道門控特性. 眾所周知， TRPM8通道受多種因素的調(diào)控， 包括物理因素和化學(xué)因素. 雖然已結(jié)晶出部分小分子與通道結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)， 呈現(xiàn)出單個(gè)和多個(gè)小分子與通道的靜態(tài)結(jié)合模式， 然而各因素共同調(diào)控通道門控過程中， 各因素間的耦合協(xié)同作用機(jī)制尚不明確. 同時(shí)， 激動劑與拮抗劑結(jié)合的位置大致相同， 卻能引發(fā)不同的門控變構(gòu)過程， 結(jié)合的信息能量如何傳遞到門控結(jié)構(gòu)域尚不清楚. 在門控變構(gòu)過程中， 各因素間的耦合協(xié)同作用與遠(yuǎn)程相互作用傳遞路徑有待進(jìn)一步挖掘.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220080.

［1］ Moran M. M.，， 2018， 58， 309—329

［2］ Jimenez I.， Prado Y.， Marchant F.， Otero C.， Eltit F.， Cabello?Verrugio C.， Cerda O.， Simon F.，， 2020，（12）， 2604

［3］ Huang Y.， Fliegert R.， Guse A. H.， Lü W.， Du J.，， 2020，， 102111

［4］ Izquierdo C.， Martín?Martínez M.， Gómez?Monterrey I.， González?Mu?iz R.，， 2021，（16）， 8502

［5］ Se?arís R.， Ordás P.， Reimúndez A.， Viana F.，， 2018，（5）， 761—777

［6］ Moore C.， Gupta R.， Jordt S. E.， Chen Y.， Liedtke W. B.，， 2018，（1）， 120—142

［7］ Xu L. Z.， Han Y. L.， Chen X. Y.， Aierken A.， Wen H.， Zheng W. J.， Wang H. K.， Lu X. C.， Zhao Z. Y.， Ma C.， Liang P.， Yang W.， Yang S. L.， Yang F.，， 2020，（1）， 3790

［8］ González?Mu?iz R.， Bonache M. A.， Martín?Escura C.， Gómez?Monterrey I.，， 2019，（11）， 2618

［9］ Yoon H. J.， Kim J.， Yang J. M.， Wei E. T.， Kim S. J.， Yoon K. C.，， 2021，（2）， 250

［10］ Hou S.， Gu R. X.， Wei D. Q.，， 2017，（11）， 2811—2821

［11］ Lei X. T.， Jin Y. Q.， Meng X. Y.，， 2021，（8）， 2550—2557 （雷曉彤， 金怡卿， 孟烜宇. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2021，（8）， 2550—2557）

［12］ Gu R. X.， Liu L. A.， Wei D. Q.，， 2013，（10）， 571—580

［13］ Diver M. M.， Cheng Y. F.， Julius D.，， 2019，（6460）， 1434—1440

［14］ Yin Y.， Wu M. Y.， Zubcevic L.， Borschel W. F.， Lander G. C.， Lee S. Y.，， 2018，（6372）， 237—241

［15］ Yin Y.， Le S. C.， Hsu A. L.， Borgnia M. J.， Yang H. H.， Lee S. Y.，， 2019，（6430）， eaav9334

［16］ Xu L. Z.， Han Y. L.， Chen X. Y.， Aierken A.， Wen H.， Zheng W. J.， Wang H. K.， Lu X. C.， Zhao Z. Y.， Ma C.， Liang P.， Yang W.， Yang S. L.， Yang F.，， 2020，（1）， 3790

［17］ Yin Y.， Lee S. Y.，， 2020，（9）， 806—819

［18］ Gu R. X.， Liu L. A.， Wei D. Q.， Du J. G.， Liu L.， Liu H.，， 2011，（28）， 10817—10825

［19］ Jumper J.， Evans R.， Pritzel A.， Green T.， Figurnov M.， Ronneberger O.， Tunyasuvunakool K.， Bates R.， ?ídek A.， Potapenko A.， Bridgland A.， Meyer C.， Kohl S. A. A.， Ballard A. J.， Cowie A.， Romera?Paredes B.， Nikolov S.， Jain R.， Adler J.， Back T.， Petersen S.， Reiman D.， Clancy E.， Zielinski M.， Steinegger M.， Pacholska M.， Berghammer T.， Bodenstein S.， Silver D.， Vinyals O.， Senior A. W.， Kavukcuoglu K.， Kohli P.， Hassabis D.，， 2021，（7873）， 583—589

［20］ Waterhouse A.， Bertoni M.， Bienert S.， Studer G.， Tauriello G.， Gumienny R.， Heer F. T.， de Beer T. A. P.， Rempfer C.， Bordoli L.， Lepore R.， Schwede T.，， 2018，（W1）， W296—W303

［21］ Vermaas J. V.， Hardy D. J.， Stone J. E.， Tajkhorshid E.， Kohlmeyer A.，， 2016，（6）， 1112—1116

［22］ Phillips J. C.， Hardy D. J.， Maia J. D. C.， Stone J. E.， Ribeiro J. V.， Bernardi R. C.， Buch R.， Fiorin G.， Hénin J.， Jiang W.， McGreevy R.， Melo M. C. R.， Radak B. K.， Skeel R. D.， Singharoy A.， Wang Y.， Roux B.， Aksimentiev A.， Luthey-Schulten Z.， Kalé L. V.， Schulten K.， Chipot C.， Tajkhorshid E.，， 2020，（4）， 044130

［23］ Miao M. Y.， Guo Y. C.， Shao X. G.， Cai W. S.，， 2021，（10）， 3116—3124 （妙孟姚， 郭一暢， 邵學(xué)廣， 蔡文生. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2021，（10）， 3116—3124）

［24］ Jurrus E.， Engel D.， Star K.， Monson K.， Brandi J.， Felberg L. E.， Brookes D. H.， Wilson L.， Chen J. H.， Liles K.， Chun M. J.， Li P.， Gohara D. W.， Dolinsky T.， Konecny R.， Koes D. R.， Nielsen J. E.， Head-Gordon T.， Geng W. H.， Krasny R.， Wei G. W.， Holst M. J.， McCammon J. A.， Baker N. A.，， 2018，（1）， 112—128

［25］ Acun B.， Hardy D. J.， Kale L. V.， Li K.， Phillips J. C.， Stone J. E.，， 2018，（6）， 1—9

［26］ Takematsu K.， Pospisil P.， Pizl M.， Towrie M.， Heyda J.， Zalis S.， Kaiser J. T.， Winkler J. R.， Gray H. B.， Vlcek A.，， 2019，（7）， 1578—1591

［27］ Drozdetskiy A.， Cole C.， Procter J.， Barton G. J.，， 2015，（W1）， W389—394

［28］ Humphrey W.， Dalke A.， Schulten K.，， 1996，（1）， 33—38

［29］ Shimizu K.， Cao W.， Saad G.， Shoji M.， Terada T.，， 2018，（5）， 1077—1091

［30］ Studer G.， Rempfer C.， Waterhouse A. M.， Gumienny R.， Haas J.， Schwede T.，， 2020，（6）， 1765—1771

［31］ Kühn F. J. P.， Knop G.， Lückhoff A.，， 2007，（38）， 27598—27609

［32］ Mishra S.， Looger L. L.， Porter L. L.，， 2021，（10）， e23471

［33］ Li J. W.， Lü S. Q.， Liu Y. Z.， Pang C. L.， Chen Y. F.， Zhang S. H.， Yu H.， Long M.， Zhang H. L.， Logothetis D. E.， Zhan Y.， An H. L.，， 2015，， 11289

［34］ Ruan Z.， Haley E.， Orozco I. J.， Sabat M.， Myers R.， Roth R.， Du J.， Lü W.，， 2021，（7）， 604—613

［35］ Huang Y. H.， Winkler P. A.， Sun W. N.， Lu W.， Du J.，， 2018，（7725）， 145—149

［36］ Zhang Z.， Tóth B.， Szollosi A.， Chen J.， Csanády L.，， 2018，， e36409

［37］ Winkler P. A.， Huang Y. H.， Sun W. N.， Du J.， Lu W.，， 2017，（7684）， 200—204

Analysis of Gating Characteristics of TRPM8 Channel Based on Molecular Dynamics

GAOZhiwei1， LIJunwei2*， SHISai1， FUQiang1， JIAJunru1， ANHailong2*

（，，，，300401，）

Physiological functions of TRPM8 channel， such as temperature sensing， depend on normal gating. Due to the lack and insufficient number of existing crystal structures， the gating characteristics of TRPM8 channels need to be further explored. Therefore， 11 TRPM8 channels with different conformations were constructed， basing on the existing crystal structure and AlphaFold algorithm. It was found that there were two different architectural in the S6 transmembrane helical bundle crossing domain（gating）： loop state and helix state. At the loop state， multiple amino acids participated in the formation of pore regions that hinder ion permeability， while in the helical architecture. Only the key amino acid V956 played a gating role. Because the flexibility of the gated loop architecture was greater than that of the helical， and the number of key amino acids involved in gating was different. The secondary structure prediction showed that the loop architecture could change to the helical. In this process， the flexible loop domain moved upward to the outside of the cell， and the gated amino acids twisted to the outside of the pore lining. At the same time， the interaction with the adjacent transmembrane S5 helix was enhanced， and a rigid， stable and orderly helical architecture was formed. This promoted the coordination between the various domains of TRPM8 channel， enabled energy and information to be transmitted to the bundle crossing more efficiently， which was conducive to channel opening.

TRPM8 channel； Gating mechanism； Homology modeling； Molecular dynamics simulation

O641

A

10.7503/cjcu20220080

2022-02-08

2022-04-28.

李軍委, 男, 博士, 副教授, 主要從事離子通道結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究. E-mail: junwei_li@hebut.edu.cn

安海龍, 男, 博士, 教授, 主要從事離子通道結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、 離子通道與重大疾病及離子通道靶向藥物分子設(shè)計(jì)等方面的研究. E-mail: hailong_an@hebut.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 11647121, 81830061, 11747610)、 河北省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: F2021202001, H20202005, 19JCYBJC28300)和河北省留學(xué)引進(jìn)人員資助項(xiàng)目(批準(zhǔn)號: C20210337)資助.

Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.11647121, 81830061 and 11747610), the Natural Science Foundation of Hebei Province, China(Nos.F2021202001, H20202005 and 19JCYBJC28300), and the Funding Program for Overseas-educated Scholars of Hebei Province, China(No.C20210337).

（Ed.： L， H， W， K）