丁香揮發(fā)油對(duì)水產(chǎn)品中易腐細(xì)菌抑制作用的影響

◎ 張思琪，韋鄒萍，邵俊楠，許澤鵬，吳明霞，薛 斌

（廣州工商學(xué)院 工學(xué)院，廣東 廣州 510850）

水產(chǎn)品因其獨(dú)特的口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)成分受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2021年水產(chǎn)品產(chǎn)量總計(jì)6 693萬(wàn)t，比2020年增長(zhǎng)2.2%[1]。微生物的生長(zhǎng)繁殖和食品內(nèi)固有酶的活動(dòng)是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因。為滿足消費(fèi)者對(duì)水產(chǎn)品的需求，延長(zhǎng)水產(chǎn)品貨架期并保持其品質(zhì)是水產(chǎn)品市場(chǎng)急需解決的問(wèn)題。水產(chǎn)品的保鮮辦法主要包括低溫保鮮、化學(xué)保鮮劑保鮮與天然保鮮劑保鮮。其中，天然保鮮劑具有天然安全、高效低毒等特點(diǎn)，是近幾年的熱門保鮮技術(shù)。

丁香為丁香屬落葉灌木或小喬木，主產(chǎn)于馬達(dá)加斯加、印度尼西亞、印度及中國(guó)的海南省和云南省[2]。丁香是藥食同源植物，丁香揮發(fā)油具有抗炎、麻醉、抗細(xì)菌、抗真菌、抗氧化和抗癌等功效[3]。研究表明，丁香揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和副溶血性弧菌等病原菌有較顯著的抑制作用，但對(duì)水產(chǎn)品中易腐細(xì)菌抑菌作用的研究報(bào)道較少。本文以基圍蝦為實(shí)驗(yàn)試材，研究丁香揮發(fā)油對(duì)基圍蝦表面易腐細(xì)菌的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基圍蝦（平均質(zhì)量30～40 g），產(chǎn)于廣東沿海，將購(gòu)買后的基圍蝦迅速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，置于-4 ℃冰箱中冷凍貯藏；丁香，產(chǎn)于云南，常溫貯存；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏粉3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)至7.3±0.2）。

1.2 儀器與設(shè)備

冰箱，美的集團(tuán)有限公司；電子天平，沈陽(yáng)多杰電子科技有限公司；電子萬(wàn)用爐，天津市泰斯特儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外分光光度計(jì)，翱藝儀器上海有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋，江明濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 丁香抑菌成分的提取

稱取丁香2 g，置于1 000 mL的燒瓶中，加入適量的蒸餾水，使用玻璃棒上下攪動(dòng)樣品數(shù)次，使樣品完全浸濕，并用標(biāo)簽標(biāo)記好樣品。用油性筆在燒杯上畫(huà)出橫線以記錄水位，把燒杯放于電子萬(wàn)用爐上加熱，水沸騰后開(kāi)始倒計(jì)時(shí)，沸騰一段時(shí)間后關(guān)閉電子萬(wàn)用爐，期間須不時(shí)攪動(dòng)樣品，并保證水位基本與標(biāo)記橫線平齊。關(guān)閉電子萬(wàn)用爐后，待提取液冷卻至室溫。把120目濾網(wǎng)對(duì)折成兩層置于漏斗上，借助玻璃棒直接將提取液過(guò)濾于容量瓶中，并定容至500 mL，得到丁香提取物[4]。

1.3.2 丁香抑菌成分提取工藝的優(yōu)化

稱取丁香2 g，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，研究料液比（1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85和1∶90）、提取時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min和25 min）對(duì)水提法提取丁香中揮發(fā)油提取率的影響。按照1.3.1提取步驟提取[5]。

1.3.3 丁香提取物的抑菌實(shí)驗(yàn)

（1）預(yù)處理。在無(wú)菌操作環(huán)境下，將基圍蝦放在0.9%生理鹽水中浸泡15 min制得菌懸液，以10倍、102倍、103倍、104倍和105倍稀釋進(jìn)行接種。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以稀釋103的菌懸液作為最終接種樣品濃度。

（2）抑菌實(shí)驗(yàn)。抑菌實(shí)驗(yàn)采用稀釋涂布平板法測(cè)定菌落總數(shù)鑒定抑菌效果。將基圍蝦分成兩組，以稀釋103的菌懸液與丁香提取物1∶1混合作為陽(yáng)性對(duì)照，以稀釋103的菌懸液作為陰性對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)平行組進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。將接種完的培養(yǎng)皿正置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后測(cè)定菌落總數(shù)并分析其抑菌效果。將所獲得的的陰性組菌落用于微生物菌落分析。

（3）混合菌檢測(cè)。從蝦表面微生物的菌落提取基因組DNA，提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行測(cè)序[6]。高通量測(cè)序（如Illumina Novaseq等測(cè)序平臺(tái)）得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（Sequenced Reads）。實(shí)驗(yàn)原理如圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)原理圖

（4）信息分析結(jié)果。數(shù)據(jù)通過(guò)質(zhì)量過(guò)濾對(duì)引物序列進(jìn)行識(shí)別閾去除得到不包含引物序列的Clean Reads，利用雙端序列拼接對(duì)每個(gè)樣品的Clean Reads進(jìn)行拼接，根據(jù)不同區(qū)域的長(zhǎng)度范圍對(duì)拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾，最終使用去除嵌合體法得到最終有效數(shù)據(jù)。通過(guò)劃分Feature（OTUs、ASVs）、多樣性分析、差異分析、相關(guān)性分析及功能預(yù)測(cè)，統(tǒng)計(jì)與分析處理各階段樣品序列得出最終樣品菌落豐富度圖，以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫(kù)使用樸素貝葉斯分類器對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

由圖2可知，隨著波長(zhǎng)的增加，丁香的吸光值有著不同程度的變化，其中丁香的吸光值在340 nm處達(dá)到頂峰，由此可得丁香提取物在340 nm波長(zhǎng)處的靈敏度最高，可提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

圖2 丁香提取物不同波長(zhǎng)的吸收峰圖

2.2 提取時(shí)間對(duì)丁香揮發(fā)油提取率的影響

圖3為提取溫度100 ℃、料液比1∶50的條件下，不同提取時(shí)間對(duì)丁香揮發(fā)油提取率的影響。隨著提取時(shí)間的增加，丁香揮發(fā)油提取率逐漸升高。當(dāng)提取時(shí)間為15 min時(shí)提取率趨于穩(wěn)定。因此，提取時(shí)間為15 min最佳。

圖3 提取時(shí)間對(duì)丁香揮發(fā)油提取率的影響圖

2.3 料液比對(duì)丁香揮發(fā)油提取率的影響

圖4為提取溫度100 ℃，提取時(shí)間15 min條件下，不同料液比對(duì)丁香揮發(fā)油提取率的影響。料液比為1∶75時(shí)提取率最高。在沸水提取的條件下，提取溶劑量越大，滲透速度和化學(xué)成分溶解速率越快，提取率越高。當(dāng)溶劑達(dá)到一定量時(shí)，浸出化學(xué)物質(zhì)趨近飽和。綜合考慮成本與環(huán)境因素，選擇料液比1∶75、提取時(shí)間15 min、提取溫度100 ℃的條件進(jìn)行丁香揮發(fā)油的提取。

圖4 料液比對(duì)丁香揮發(fā)油提取率的影響圖

2.4 丁香提取物的抑菌效果

從基圍蝦菌懸液得到的細(xì)菌與添加丁香揮發(fā)油的菌懸液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)板上進(jìn)行稀釋涂布培養(yǎng)18 h。由圖5可知，丁香揮發(fā)油對(duì)基圍蝦表面的易腐細(xì)菌具有良好的抑菌效果。由圖6可知，對(duì)照組菌液總數(shù)分別為 3.9×105CFU·mL-1和 4×105CFU·mL-1，實(shí)驗(yàn)組 a的菌落總數(shù)為1.3×105CFU·mL-1，實(shí)驗(yàn)組b的菌落總數(shù)為1.8×105CFU·mL-1。經(jīng)丁香揮發(fā)油作用后，培養(yǎng)基中混合菌的菌落總數(shù)差異顯著（P＜0.05），丁香揮發(fā)油對(duì)基圍蝦表面易腐細(xì)菌有顯著的抑制作用。

圖5 丁香提取物對(duì)混合菌的抑菌效果圖

圖6 丁香提取物對(duì)混合菌細(xì)菌總數(shù)的影響圖

2.5 微生物分離鑒定

通過(guò)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理各階段樣品序列數(shù)目，評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量。由表1可知，從樣品中分離出10種微生物，其中變形菌綱微生物占樣品中微生物的96.93%。根據(jù)堿基識(shí)別與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)，將10種微生物鑒定到種的水平，如圖7。

表1 混合菌菌類豐富度表

圖7 混合菌菌類名稱圖

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丁香以1∶75料液比進(jìn)行15 min的沸水提取，對(duì)基圍蝦表面易腐細(xì)菌有顯著的抑制作用（P＜0.05）。水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)豐富，脂肪含量低，蛋白質(zhì)含量高，易成為微生物天然的培養(yǎng)基。一些易腐微生物的生長(zhǎng)是引起水產(chǎn)品腐敗的主要原因。丁香作為一種具有抗炎、抗細(xì)菌、抗真菌的食藥同源植物，是研究開(kāi)發(fā)天然保鮮劑的良好選擇。丁香揮發(fā)油可能是作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，改變其通透性，使得細(xì)菌因細(xì)胞膜的完整性被破壞達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，進(jìn)而達(dá)到水產(chǎn)品的保鮮作用。本實(shí)驗(yàn)為丁香揮發(fā)油的提取以及其應(yīng)用于食品的防腐保鮮提供了數(shù)據(jù)及理論參考。