寧夏野生甘草和種植甘草內(nèi)生菌的分離和初鑒定

張 燃，李 佳 (.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川 7500；.阿拉善盟生態(tài)環(huán)境綜合服務(wù)中心，內(nèi)蒙古阿拉善盟 750300)

甘草()，豆科甘草屬灌木狀多年生草本植物，是我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)重要的植物資源，寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古等地為其主產(chǎn)區(qū)，具有耐旱、耐鹽堿、防風(fēng)固沙等特點(diǎn)，可以產(chǎn)生較好的生態(tài)效益。同時(shí)甘草作為我國(guó)重要的大宗藥材，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、 祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥、抗癌抗病毒等作用，在臨床上用于治療呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病。此外，甘草還廣泛應(yīng)用于食品、化工等工業(yè)中。因此，優(yōu)質(zhì)甘草在國(guó)內(nèi)外需求量極大，市場(chǎng)供不應(yīng)求。隨著近年來(lái)對(duì)于野生甘草資源毫無(wú)節(jié)制的采挖，資源總量和質(zhì)量逐年下降，野生甘草資源已接近枯竭。而人工栽培甘草的周期長(zhǎng)、難度大，且藥用成分如甘草黃酮、甘草酸等含量都較低。因此探索如何提高人工種植甘草質(zhì)量則成為間接保護(hù)野生甘草資源、保障甘草市場(chǎng)需求的方法之一。

植物內(nèi)生菌是指一類共生于植物體內(nèi)，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀或產(chǎn)生負(fù)向影響的微生物。藥用植物中也含有大量的內(nèi)生菌，研究表明一些內(nèi)生菌可與藥用植物進(jìn)行基因融合，使其具有可以合成與宿主相同藥效物質(zhì)的能力；有些內(nèi)生菌也可協(xié)助植物共同完成一些生物的合成，使中藥材中藥用成分含量增加。甘草中也有非常豐富的內(nèi)生菌資源，其中以從根中分離的菌株為主。從野生優(yōu)質(zhì)甘草中分離其內(nèi)生菌，并摸清內(nèi)生菌和甘草間的相互作用、內(nèi)生菌和甘草藥用成分間的關(guān)系，都將為提高種植甘草的藥用品質(zhì)提供新思路，同時(shí)也將為野生甘草的保護(hù)、解決其資源匱乏等問題提供新途徑。

1 材料與方法

試材。試驗(yàn)用種植甘草植株采自寧夏鹽池甘草種植基地，試驗(yàn)用野生甘草植株采自寧夏鹽池金馬村，并由寧夏中藥材研究中心郭紅艷教授鑒定為烏拉爾甘草(Fisch.)。

培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨(BPDA)培養(yǎng)基。牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉5 g，加蒸餾水熱攪拌至全部溶解后，加入瓊脂 20 g，調(diào) 節(jié) pH 至 7.3～7.6，補(bǔ)加蒸餾水定容至 1 000 mL，高壓蒸汽滅菌后倒平板，每個(gè)培養(yǎng)皿約 15 mL，放置冷卻凝固，無(wú)菌觀察，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。將馬鈴薯去皮，取 200 g，切成小塊放入加 1 L 水中，加熱煮沸 30 min，用四層紗布過(guò)濾，加入 20 g 葡萄糖、5 g氯化鈉、20 g 瓊脂，溶液再加熱煮至瓊脂全部溶解，補(bǔ)加蒸餾水定容至 1 000 mL，調(diào) 節(jié) pH 至 7.0～7.4，高壓蒸汽滅菌后，加適量氯霉素倒平板，每個(gè)培養(yǎng)皿約 15 mL，放置冷卻凝固，無(wú)菌觀察，備用。

甘草處理。2種甘草樣本各取一截根部外表無(wú)破損的部分，約5 cm，用自來(lái)水將甘草表面泥土沖洗干凈，放入超凈工作臺(tái)紫外照射殺菌30 min，之后用75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗5次；3%次氯酸鈉浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗5次；75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗5次。

內(nèi)生菌分離培養(yǎng)。以無(wú)菌濾紙片吸干甘草樣品表面水分并剝?nèi)ジ什莞客馄?，再用滅菌的手術(shù)剪刀將樣品沿甘草根部橫截面剪切成2～3 mm厚的薄片，接種于已制備好的2種固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中接3～4塊，并標(biāo)記好，每個(gè)樣本 10皿。將接種植株組織的培養(yǎng)基用封口膜封好，放置于智能光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)，BPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，即將剝?nèi)ネ馄さ母什莞拷M織塊在空白的培養(yǎng)基上滾動(dòng)并輕輕按壓，使樣品表面各處都接觸到培養(yǎng)基，再用封口膜封口，與接種好的培養(yǎng)皿在相同條件下一起培養(yǎng)，若對(duì)照組培養(yǎng)皿上未長(zhǎng)出菌落，說(shuō)明植株的表面消毒徹底。培養(yǎng)完成后，分別計(jì)算2種甘草的分離率和定殖率，其中分離率為從樣本組織塊中得到的菌株數(shù)與全部樣本組織塊數(shù)的比值，定殖率為樣本中受內(nèi)生真菌侵染的組織塊數(shù)占全部樣本組織塊數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

內(nèi)生菌的純化。培養(yǎng)完成后，觀察2種培養(yǎng)基的空白對(duì)照組和樣品組，若空白對(duì)照組無(wú)菌落產(chǎn)生，而樣品組有菌落產(chǎn)生，則利用接種環(huán)挑取邊緣菌落，用劃線法接入新鮮的培養(yǎng)基中，于 28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新菌落后，根據(jù)菌種的形態(tài)與顏色的不同，再次挑取尖端菌絲進(jìn)行純化，反復(fù)純化至單一菌種。

甘草內(nèi)生菌形態(tài)學(xué)鑒定。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、《真菌鑒定手冊(cè)》，根據(jù)內(nèi)生菌菌落的表面形態(tài)、潤(rùn)澤、大小、邊緣形態(tài)、顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)速度等特征，光學(xué)顯微鏡觀察菌絲顏色、有無(wú)產(chǎn)孢、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、有無(wú)橫隔等微觀特征，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

在接種的樣品中，從野生組分離得到12株甘草內(nèi)生菌，其中內(nèi)生真菌8株、內(nèi)生細(xì)菌4株，從人工種植組中分離得到4株，其中內(nèi)生真菌2株、內(nèi)生細(xì)菌2株，分離率、定殖率見表1，部分菌種見圖1。從結(jié)果可以看出，野生組所獲得的內(nèi)生菌數(shù)量明顯高于人工種植組，其中內(nèi)生真菌數(shù)量高于內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量，并且整體來(lái)看，分離獲得的甘草內(nèi)生菌數(shù)量并不多。

表1 甘草內(nèi)生菌的分離率、定殖率Table 1 Isolation rate and colonization rate of endophyte licorice %

圖1 甘草樣本中分離的部分菌種和空白對(duì)照Fig.1 Part of bacteria isolated from Glyeyrrhica uralensis samples and blank control

分離出來(lái)的甘草內(nèi)生菌經(jīng)過(guò)純化培養(yǎng)獲得單一菌株，部分菌落見圖2，其菌落特點(diǎn)見表2，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)分離獲得的內(nèi)生菌進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定，從野生甘草樣本中分離出的8株甘草內(nèi)生真菌分別為青霉屬2株，占25.0%；根霉屬2 株，占25.0%；木霉屬1 株，占12.5%；鐮孢屬3 株，占 37.5%，鐮孢屬是優(yōu)勢(shì)種屬；4株甘草內(nèi)生細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬，但分別屬于萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌。從種植甘草樣本中分離出的2株甘草內(nèi)生真菌分別為根霉屬1株，占50.0%；鐮孢屬1株，占50.0%，分離獲得內(nèi)生真菌太少，無(wú)法分析其優(yōu)勢(shì)種屬；2株甘草內(nèi)生細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬。

3 討論與結(jié)論

此次試驗(yàn)中分離純化出的甘草內(nèi)生菌數(shù)量較少，不夠理想，分析推測(cè)其原因首先是甘草樣本表面消毒條件較高(紫外照射殺菌30 min，之后用 75% 乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗5次；3%次氯酸鈉浸泡 2 min，無(wú)菌水沖洗5次；75% 乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗5次)，無(wú)論是乙醇還是次氯酸鈉溶液對(duì)于甘草樣本的滲透作用都較強(qiáng)，因此會(huì)將甘草樣本淺表部分的內(nèi)生菌殺死，導(dǎo)致樣本中的內(nèi)生菌數(shù)量減少，影響最終分離的結(jié)果；其次在試驗(yàn)初期的2次分離培養(yǎng)過(guò)程中都出現(xiàn)了空白對(duì)照陽(yáng)性的情況，導(dǎo)致需反復(fù)對(duì)甘草表面的消毒條件進(jìn)行摸索改良，錯(cuò)過(guò)分離甘草內(nèi)生菌的最佳時(shí)期，樣本中部分內(nèi)生菌出現(xiàn)死亡，移植的樣本中內(nèi)生菌數(shù)較少；最后此次試驗(yàn)所采甘草樣本中野生甘草約3年生，種植甘草約2.5年生，因此推測(cè)由于樣本生長(zhǎng)年限較短，本身也未曾共生太多內(nèi)生菌，基于以上原因，最終培養(yǎng)獲得的甘草內(nèi)生菌數(shù)量較少。

圖2 純化后部分甘草內(nèi)生菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.2 Colony morphology and microscopic morphology of some Glyeyrrhica uralensis endophytes after purification

表2 純化后部分甘草內(nèi)生菌的菌落特點(diǎn)

雖然獲得的內(nèi)生菌數(shù)量較少，但從數(shù)據(jù)上也可看出明顯特點(diǎn)，從野生組分離獲得的內(nèi)生菌不論是數(shù)量還是多樣性方面都明顯高于種植組，這與多數(shù)相關(guān)研究一致，同時(shí)也可更好地印證在藥用植物中大量且多樣的內(nèi)生菌確實(shí)會(huì)直接或間接地影響其共生植物藥材的藥物作用和效果。此外還有研究表明，某些內(nèi)生菌群為宿主植物適應(yīng)特殊的生境提供極大的幫助，能增強(qiáng)或賦予宿主藥用植物抗病、抗旱、抗寒、抗鹽堿等特性賦予道地藥材較好的抗逆性品質(zhì)。因此后續(xù)會(huì)繼續(xù)研究分離出來(lái)的內(nèi)生菌與甘草的相互作用，以期通過(guò)對(duì)分離培養(yǎng)的內(nèi)生菌進(jìn)行篩選，來(lái)獲得可以產(chǎn)生甘草有效成分的內(nèi)生菌，為提高種植甘草的藥用品質(zhì)、解決野生甘草資源匱乏和保護(hù)等問題提供支持。