抗HER-2 納米抗體的篩選、表達及功能鑒定

王麗燕， 李艷寧， 王紅霞， 蔣 丹， 張艷婷， 張愛君， 徐廣賢，

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，銀川 750004； 3.廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術(shù)學院，廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學研究所，東莞 523808）

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）屬于原癌基因，定位于染色體17q21，編碼HER-2 受體[1]。20%～30%的原發(fā)性浸潤性乳腺癌患者過表達HER-2 基因[1]，與疾病復發(fā)率增加和預后不良密切相關(guān)[2]。隨著許多類型腫瘤基因組圖譜的增加，發(fā)現(xiàn)HER-2 基因的過度表達不僅出現(xiàn)于乳腺癌，也出現(xiàn)在其他類型腫瘤中，如胃癌、結(jié)腸癌等[3-5]。曲妥珠單抗（trastuzumab）是第一個靶向HER-2 的單克隆抗體[6]，具有一定的療效，但會引發(fā)患者心臟毒性，并且容易產(chǎn)生耐藥性[7]。因此，尋求更為有效的抗體用于HER-2 基因過表達癌癥的治療顯得尤為迫切。

納米抗體具有分子質(zhì)量?。?5 kDa）、親和力高、免疫原性低、組織穿透力強、易與隱蔽抗原結(jié)合等特點，臨床上既可用于腫瘤治療，也可作為診斷工具[8-9]，具有很大發(fā)展空間?；诖?，本研究在駝源天然噬菌體納米抗體展示庫中，以生物素化HER-2 抗原為靶點，篩選特異性抗HER-2納米抗體，并與人IgG1 Fc 片段偶聯(lián)，對重組納米抗體進行表達與鑒定分析，以期為以HER-2為靶點的疾病檢測、診斷與治療藥物研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

天然噬菌體納米抗體展示庫、大腸桿菌TG1以及輔助噬菌體KM13 均為本實驗室保存；SKBR-3 細胞購自中科院細胞典藏庫；HER-2 抗原及生物素化HER-2 抗原購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司；鏈霉親和素磁珠（InvitrogenTMDynabeadsTMM-280 Streptavidin）購自Thermo Fisher Scientific 公司；HRP 標記的羊抗人IgG（H+L）、FITC 標記的羊抗人IgG（H+L）購自Proteintech 公 司；Albumin Bovine、ELISA 包 被 液、ELISA 終止液、TMB 單組份顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司；氯化鈉、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純；酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)XOID 公司；脫脂奶粉購自BD公司；HRP 標記的小鼠抗M13 抗體購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thiogalactoside，IPTG）購自Sigma 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自BI 公司；DNA 測序由上海生工生物工程有限公司提供；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

離心機購自Sigma 公司；金屬浴購自無錫沃信儀器有限公司；酶標儀購自Thermo Fisher Scientific 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海齊欣科學儀器有限公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；渦旋混勻器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；水平和垂直電泳儀購自Bio-Rad公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自GenScript 公司。

1.2 方法

1.2.1 抗HER-2 納米抗體的篩選 1）磁珠清洗：取200 μL 鏈霉親和素磁珠用PBS 清洗2 次，棄去洗滌PBS，用新的PBS 補充至200 μL。2）離心管封閉：用含有2%脫脂牛奶的PBS 封閉2 個1.5 mL 離心管，室溫孵育1 h，棄去封閉液。3）磁珠封閉：在1.5 mL 離心管中用2% PBSM 封閉100 μL 清洗過的鏈霉親和素磁珠，轉(zhuǎn)動臺室溫孵育1 h，棄去封閉液補充100 μL PBS。4）磁珠和噬菌體文庫預孵育：另取2 個1.5 mL 離心管，分別加入救援后的噬菌體文庫及50 μL 磁珠，轉(zhuǎn)動臺室溫孵育1 h 后，棄磁珠，收集噬菌體（抗體）。5）生物素化抗原結(jié)合噬菌體（抗體）：在已封閉過的2 個1.5 mL 離心管中分別加入500 μL 削減后的噬菌體抗體，向其中1 個離心管加入500 μL 經(jīng)PBS 稀釋的5 μg 生物素化HER-2 抗原，另1 個離心管加入500 μL PBS 作為陰性對照。6）磁珠結(jié)合篩選生物素化抗原-噬菌體（抗體）：轉(zhuǎn)動臺室溫孵育1 h，分別加入50 μL 封閉后的磁珠，轉(zhuǎn)動臺室溫孵育30 min，收集磁珠。7）磁珠洗滌：用含有0.2%Tween-20 的PBS（即PBST）洗滌磁珠7 次，接著用2% PBSM 洗滌2 次，最后用PBS洗滌1 次；每洗滌2～3 次換新的離心管。8）噬菌體（抗體）洗脫：洗滌完成后，分別向離心管中加入800 μL pH 為2.7 的甘氨酸-鹽酸，在渦旋混勻器上渦旋8 min 洗脫噬菌體。9）噬菌體（抗體）中和：棄磁珠并向洗脫液中立即加入100 μL pH為9.1 的Tris-HCl 進行中和。10）噬菌體（抗體）侵染TG1 和篩選：取中和液500 μL 加入4 mL OD600 約為0.5 的TG1 菌液中，37 ℃侵染30 min。侵染后的培養(yǎng)物9 000 r·min-1離心5 min，棄上清用100 μL 無抗2×YT 培養(yǎng)基重懸沉淀，涂布于含有100 μg·mL-1氨芐青霉素（ampicillin，Amp）及2 mol·L-1葡萄糖的2×YT 固體培養(yǎng)基上（每個固體培養(yǎng)基20 μL 重懸菌液），過夜培養(yǎng)后收集平板上的菌落用于下一輪篩選，共篩選3 輪。從第2 輪開始，生物素化抗原使用量依次為5 μg、3 μg，且洗滌次數(shù)增加。

1.2.2 phage-ELISA 鑒定陽性克隆 從第3 輪篩選后的固體培養(yǎng)基上隨機挑取50 個單菌落，按照文獻[10]所述，獲得噬菌體抗體即上清。將獲得的上清與2% PBSM 按4∶1 比例混合后于37 ℃孵育1 h 作為一抗。1）包被：提前一天將HER-2抗原經(jīng)ELISA 包被液稀釋至10 μg·mL-1，按每孔100 μL 加至96 孔酶標板4 ℃過夜包被，同時用PBS 包被作為陰性對照，噬菌體KM13 包被作為陽性對照。2）封閉：次日，用0.05% PBST 洗板3次，每孔加入200 μL 5% PBSM 于37 ℃封閉2 h，洗板3 次。3）一抗孵育：每孔加入100 μL 一抗37 ℃孵育1 h，洗板3 次。4）二抗孵育：每孔加入100 μL 按1∶5 000 比例稀釋的HRP 標記小鼠抗M13 抗體，37 ℃孵育1 h 后再次洗板。5）顯色及檢測：加入TMB 單組份顯色液，每孔100 μL，37 ℃避光孵育15～20 min，加入終止液100 μL/孔，于酶標儀上測定450 nm 處OD 值。樣品孔OD 值大于陰性對照孔OD 值3 倍及以上界定為陽性克隆，并取相應菌液進行測序。

1.2.3 納米抗體的表達及純化 將測序得到的經(jīng)Blast 比對確定為VHH 的序列，與人IgG1 Fc段偶聯(lián)后連入載體pET-30a 的NdeI-XhoI 位點之間，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TOP10 克隆菌株。挑取陽性克隆子測序并酶切鑒定后，轉(zhuǎn)入表達菌株大腸桿菌Arctic Express。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆擴大培養(yǎng)后，加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol·L-1，11 ℃、200 r·min-1振搖過夜，誘導融合蛋白表達。離心后收集菌體沉淀用PBS 重懸后進行超聲破碎（功率400 W，工作4 s，間歇8 s，共20 min），并對得到的融合蛋白粗提液經(jīng)Ni 柱親和純化。

1.2.4 重組抗HER-2 納米抗體的驗證 采用表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）測定重組抗HER-2 納米抗體與HER-2 抗原的親和力，Western blot 法對其特異性進行驗證。取5 μg HER-2 抗原（1 μg·μL-1），加入5 μL 6×蛋白上樣緩沖液及20 μL 去離子水，混勻后在金屬浴上95 ℃變性10 min，上樣進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用含5% BSA 的TBST 室溫封閉1 h，按1∶1 000 加入純化后的重組抗HER-2 納米抗體作為一抗，于低溫搖床上4 ℃過夜孵育。次日，洗膜后按1∶5 000 加入HRP 標記的羊抗人IgG，室溫孵育1 h 后洗膜并顯影。

1.2.5 SKBR-3 細胞的復蘇與培養(yǎng) 將SKBR-3細胞復蘇后，加入5 mL DMEM 完全培養(yǎng)基于T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，及時觀察細胞狀態(tài)并進行傳代、凍存。

1.2.6 細胞免疫熒光 將處于對數(shù)生長期的SKBR-3 細胞用胰酶消化后進行細胞計數(shù)，制成1×105個/mL 細胞懸液，向放置了細胞爬片的六孔板中每孔加入2 mL，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，4%組織細胞固定液室溫固定30 min，PBS 清洗3 次，0.1% Triton 通透10～20 min，PBS 清洗3 次。用含5% BSA 的PBS封閉1 h 后，按1∶20 加入重組抗HER-2 納米抗體于4 ℃冰箱過夜孵育。次日，用PBS 清洗3 次，按1∶1 000 加入FITC 標記的羊抗人IgG 抗體室溫孵育1 h，PBS 清洗3 次，用DAPI 染液染色后進行封片，于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 抗HER-2 納米抗體的篩選

采用生物素-鏈霉親和素液相篩選法，經(jīng)3輪篩選后，從每一輪擴大培養(yǎng)的平板上，隨機挑取15 個菌落，phage-ELISA 檢測450 nm 波長處的吸光度值，初步驗證抗HER-2 納米抗體的富集。如圖1 所示，吸光度值逐漸升高，表明3 輪篩選后目的抗體得到了一定程度的富集。在第3 輪篩選后的平板上隨機挑取50 個菌落，經(jīng)ELISA鑒定為陽性克隆（圖2），并選取對應菌液測序。測序后經(jīng)比對得到一條目的序列，并在ExPASy網(wǎng)站對其理化性質(zhì)進行分析（表1）。

圖1 各輪篩選中吸光度值的變化

圖2 陽性單克隆吸光度值

表1 抗HER-2 納米抗體理化參數(shù)分析

2.2 原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

基于PAS 的方法設(shè)計全長拼接引物，合成基因HER-2-人IgG1 Fc 并與pET-30a 載體連接，轉(zhuǎn)入TOP10 菌株。挑取陽性克隆子測序，結(jié)果表明序列與預期相符（圖3）。提取重組pET-30a 質(zhì)粒并進行酶切鑒定（圖4），片段符合預期大小，表明原核載體構(gòu)建成功。

圖3 測序結(jié)果與預期序列部分比對圖

圖4 重組pET-30a 質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 納米抗體的表達及純化

將重組質(zhì)粒pET-30a-HER-2-人IgG1 Fc轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express 中，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落加入IPTG 低溫誘導表達，發(fā)現(xiàn)目標蛋白主要存在于沉淀中（圖5A）。對包涵體變復性重溶目標蛋白，經(jīng)Ni 柱親和純化后進行SDSPAGE 分析，結(jié)果顯示純化的目的蛋白符合預期大小，且純度較高（圖5B）。

圖5 蛋白表達及純化SDS-PAGE 分析

2.4 納米抗體的鑒定

采用SPR 技術(shù)對重組抗HER-2 納米抗體與HER-2 抗原的親和力進行檢測，親和力測定曲線及擬合曲線見圖6A。使用Biacore 8K 分析軟件計算親和力值，為9.34 μmol·L-1，說明重組抗HER-2納米抗體與HER-2 抗原親和力較高。以HER-2分子為抗原，純化得到的重組抗HER-2 納米抗體為一抗，進行Western blot 實驗，結(jié)果表明重組抗HER-2 納米抗體可以與HER-2 抗原特異性結(jié)合（圖6B）。SKBR-3 細胞表面高表達HER-2，因此以SKBR-3 細胞鋪板進行免疫熒光實驗，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡拍照后的結(jié)果顯示重組抗HER-2 納米抗體可與SKBR-3 細胞結(jié)合（圖7）。

圖6 重組抗HER-2 納米抗體的鑒定

圖7 重組抗HER-2 納米抗體SKBR-3 細胞免疫熒光（×200）

3 討論

致癌基因HER-2 與人類乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]，HER-2 基因的過度表達抑制了內(nèi)部環(huán)境中的抗腫瘤免疫[13]。據(jù)報道，HER-2 基因過表達與包括乳腺癌和胃癌在內(nèi)的許多癌癥的預后較差有關(guān)[14]。曲妥珠單抗是批準用于HER-2 基因過表達的乳腺癌和胃癌患者的第一種單克隆抗體藥物[15]。研究[16-17]表明，曲妥珠單抗和化學治療藥物的聯(lián)合使用可以有效改善乳腺癌患者的無病生存率和總體生存率。曲妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇和多西紫杉醇已被證實可以降低HER-2 陽性乳腺癌患者的病死率并能改善預后[18-20]。然而，曲妥珠單抗并不是對所有患者都有效，有些患者最終會獲得耐藥性[21]。此外，不可逆轉(zhuǎn)的心臟毒性，特別是充血性心力衰竭，是使用曲妥珠單抗后不可忽視的不良反應，曲妥珠單抗還可以破壞心肌細胞線粒體的功能[22]。因此，發(fā)明一種更有效、副反應更少、更容易獲得的靶向藥物迫在眉睫。

納米抗體于1993 年首次報道，是在駱駝外周血液中存在的一種天然缺失輕鏈的抗體[23]，是目前已知的可結(jié)合目標抗原的最小分子[24]。納米抗體適合于原核表達和各種真核表達系統(tǒng)[25-26]，可廣泛應用于治療抗體藥物、診斷試劑、親和純化基質(zhì)和科學研究的開發(fā)，并成為新一代治療性生物醫(yī)學和臨床診斷試劑中的新興力量。例如，基于納米抗體構(gòu)建的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T 細胞能更好地靶向腫瘤微環(huán)境，抑制黑色素瘤實體瘤的生長[27]。Mo 等[28]研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將抗CD105 納米抗體與CAR 結(jié)構(gòu)相連，產(chǎn)生的抗人CD105 CAR-T 細胞在體外表現(xiàn)出對CD105+靶細胞的特異性殺傷效應，體內(nèi)可顯著抑制CD105+移植瘤的生長。Deken 等[29]將針對HER-2的單價納米抗體與光敏劑偶聯(lián)，結(jié)合光學成像驗證了納米抗體-光敏劑偶聯(lián)物在腫瘤中的積聚，且在照射后能夠在體外誘導選擇性的細胞殺傷，特別是HER-2 過表達的細胞。此外，納米抗體可應用于分子成像，靶向性好，腫瘤部位攝取率高[30-31]。

本研究以HER-2 為靶點，采用生物素-鏈霉親和素液相篩選法，增加了篩選到目的抗體的可能性，并且提高了目的抗體的特異性。在駝源天然噬菌體納米抗體展示庫中經(jīng)過三輪淘篩后，獲得了一條抗HER-2 納米抗體序列。納米抗體分子質(zhì)量小，其快速清除的特點對于成像診斷是有利的，但它在治療學中的應用可能不夠。為了延長納米抗體的半衰期，常見的策略是與白蛋白或Fc 結(jié)構(gòu)域融合。另外，納米抗體本身可能不足以用于腫瘤治療，因為它缺乏能夠介導細胞毒作用的Fc 結(jié)構(gòu)域[32]。因此，在腫瘤治療中，納米抗體相比單克隆抗體更需要與毒素或細胞毒劑偶聯(lián)?；诖?，本研究將篩選到的目的納米抗體序列與人IgG1 Fc 片段偶聯(lián)，通過原核表達系統(tǒng)表達并純化后，經(jīng)SPR 技術(shù)與Western blot 初步鑒定，得到的重組抗HER-2 納米抗體親和力與特異性均較好。細胞免疫熒光實驗也證實，重組抗HER-2 納米抗體可以與SKBR-3 細胞表面的HER-2 分子特異性結(jié)合。

綜上所述，本研究篩選了抗HER-2 納米抗體序列，與人IgG1 Fc 段偶聯(lián)后通過原核表達并純化，所得到的重組抗HER-2 納米抗體經(jīng)實驗證實其親和力與特異性均良好，能與表面高表達的HER-2 細胞結(jié)合，為后續(xù)用于分子成像或疾病的檢測治療提供了有力的技術(shù)支持。