右美托咪定對大鼠肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

李 航，張士霞，張瑋琪，艾麗平，張暖暖 (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

肝臟供血充足，質(zhì)地柔軟，輕微的損傷即可引起出血，術(shù)中出血不僅對患者不利，也會影響術(shù)者視野，因此在肝臟外科手術(shù)中通常需要阻斷肝臟血流[1]，手術(shù)結(jié)束再恢復(fù)肝臟血流，這便造成了肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)。HIRI在肝臟手術(shù)中發(fā)生幾率較大，對手術(shù)成功率和術(shù)后恢復(fù)程度影響也較嚴重，并且可通過多條途徑對機體造成損傷，如何降低HIRI是目前人類醫(yī)學(xué)和動物醫(yī)學(xué)共同面臨的難題。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用，對各種器官缺血再灌注損傷的保護作用已被廣泛報道，但其具體機制尚有待深入研究。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡途徑逐漸引起學(xué)者的關(guān)注，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的干預(yù)可能為HIRI提供新的保護手段。因此，本試驗通過建立大鼠HIRI模型，在給予不同劑量Dex后，檢測相關(guān)肝功能指標、肝臟氧化應(yīng)激、細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白表達情況，明確不同劑量Dex對HIRI的保護作用，探究Dex能否通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的肝細胞凋亡，為今后獸醫(yī)臨床開展HIRI的防治及進行相關(guān)機制研究提供理論依據(jù)及試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑鹽酸右美托咪定(購自上海陶素生化公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(購自美國愛德士公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；TUNEL細胞凋亡試劑盒(購自Roche公司)；PrieScriptTMRT Master Mix試劑盒和TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(購自大連 TaKaRa公司)；TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒(購自北京全式金生物公司)；β-actin一抗、p-PERK一抗、p-IRE-1α一抗，堿性磷酸酶標記的二抗(購自北京博奧森公司)；CHOP一抗(購自美國CST生物公司)。

1.2 模型制備健康雄性SD大鼠30只(購自河北醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心)，體質(zhì)量250～300 g，飼喂標準化鼠糧，不限飲水，試驗過程中保證飼養(yǎng)環(huán)境不變。SD大鼠隨機分為5組(6只/組)：假手術(shù)組(S組)、損傷組(IR組)、Dex低劑量組(DL組)、Dex中劑量組(DM組)和Dex高劑量組(DH組)。 IR組術(shù)前30 min腹腔注射生理鹽水(1 mL/kg)，開腹后輕輕拉出肝臟左葉和肝臟中葉，用無損傷血管夾夾住肝左葉及肝中葉的門靜脈和肝動脈，建立缺血再灌注模型，用生理鹽水潤濕的紗布覆蓋暴露在體外的肝臟。夾閉血管30 min后，撤掉血管夾，將肝臟復(fù)位。S組術(shù)前30 min腹腔注射生理鹽水(1 mL/kg)，開腹后分離肝中葉及左葉至膈肌及腹壁的韌帶，不夾閉任何血管，將肝臟暴露體外，用生理鹽水浸濕的紗布覆蓋肝臟和切口30 min。Dex低、中、高劑量組分別于肝臟缺血前30 min腹腔注射Dex 20，50，100 μg/kg。心臟采血，分離血清于-80℃ 冰箱保存，用于肝功能指標檢測。斷頸處死大鼠，開腹取肝中葉及肝左葉，一部分放入福爾馬林中固定，用于TUNEL檢測；另一部分放入-80℃冰箱保存用于氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡相關(guān)基因、蛋白檢測。

1.3 肝功能檢測全自動生化分析儀檢測血清中ALT含量的變化水平。

1.4 肝臟氧化應(yīng)激指標檢測取-80℃凍存的肝臟組織100 mg加入900 μL的生理鹽水制備10%肝臟組織勻漿，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，4℃、2 500 r/min，離心10 min，取上清后采用BCA法進行蛋白定量，根據(jù)檢測試劑盒說明書檢測肝臟組織勻漿中氧化應(yīng)激指標MDA、SOD含量的變化水平。

1.5 肝細胞凋亡率檢測取肝臟組織制作病理切片，依次經(jīng)二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和75%乙醇脫水、3%H2O2溶液封閉、加入蛋白酶K溶液去除組織蛋白，蒸餾水漂洗。按TUNEL試劑盒說明書進行操作，光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察肝臟細胞凋亡情況。細胞核被染成棕色為凋亡細胞，藍紫色為正常細胞。每張切片隨機選擇10個視野，記錄總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)，計算凋亡率。

1.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和相關(guān)凋亡基因的mRNA檢測采用qRT-PCR方法開展基因水平檢測。使用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒從肝臟中提取總RNA，使用PrieScriptTMRT Master Mix試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ，在LightCycler?96中實時定量PCR。引物(表1)由上海生工合成。采用兩步法，擴增條件如下：95℃ 30 s預(yù)變性；95℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火延伸，反應(yīng)40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法分析相對mRNA的表達。

表1 引物序列

1.7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和相關(guān)凋亡蛋白的檢測采用Western blot方法開展蛋白水平檢測。使用RIPA細胞裂解液從肝臟中提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，超純水將各組蛋白濃度調(diào)整一致，100℃水浴5 min，使蛋白變性，加入蛋白上樣緩沖液，分裝保存。配制濃度為12%的分離膠，上樣進行電泳。電泳停止后轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜孵育一抗二抗，將PVDF膜浸泡于BCIP/NBT顯色液中，避光顯色。將顯色的膜掃描進電腦，使用Image J軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 Dex對肝臟缺血再灌注大鼠肝功能的影響肝功能檢測結(jié)果顯示，與S組相比，IR、DL和DH組大鼠血清中ALT含量極顯著升高(P<0.01)，DM組差異不具有顯著性(P>0.05)；與IR組相比，DL、DM和DH組血清中ALT含量極顯著降低(P<0.01)(圖1)。

圖1 血清中ALT的含量變化

2.2 Dex對肝臟缺血再灌注大鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響氧化應(yīng)激檢測結(jié)果顯示，與S組相比，其余各組大鼠肝臟組織中MDA含量極顯著增多(P<0.01)，DH組大鼠肝臟組織中SOD活力顯著降低(P<0.05)，IR、DL組大鼠肝臟組織中SOD活力極顯著降低(P<0.01)；與IR組相比，各給藥組大鼠肝臟組織中MDA含量極顯著降低(P<0.01)，各給藥組大鼠肝臟組織中SOD活力極顯著升高(P<0.01)(圖2)。

A.肝臟組織MDA含量變化；B.肝臟組織SOD活力變化圖2 Dex對肝臟氧化應(yīng)激的影響

2.3 Dex對肝臟缺血再灌注大鼠肝細胞凋亡率的影響TUNEL檢測結(jié)果顯示，與S組相比，其余各組大鼠肝細胞凋亡率均極顯著升高(P<0.01)；與IR組相比，DL組大鼠肝細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，DM和DH組大鼠肝細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)(圖3，4)。

圖3 肝臟細胞凋亡率的變化

A.S組；B.IR組；C.DL組；D.DM組；E.DH組圖4 肝臟細胞凋亡變化 (×400)

2.4 肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和相關(guān)凋亡基因的表達水平qRT-PCR結(jié)果顯示，與S組相比，IR組大鼠肝臟PERK和ATF-6 mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)，DL組大鼠肝臟PERK和ATF-6 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)；與IR組相比，各用藥組大鼠肝臟PERK和ATF-6 mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，其中DM組大鼠肝臟PERK和ATF-6 mRNA表達量相對最低(圖5)。

A.肝臟組織中PERK mRNA表達的變化；B.肝臟組織中ATF-6 mRNA表達的變化圖5 肝臟組織中PERK和ATF-6 mRNA的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示,與S組相比，DM組大鼠肝臟Caspase-12 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，DM組大鼠肝臟GRP-78 mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)，其余各組大鼠肝臟GRP-78和Caspase-12 mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)，DM組大鼠肝臟Caspase-12 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)；與IR組相比，各用藥組大鼠肝臟GRP-78和Caspase-12 mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，其中DM組大鼠肝臟GRP-78 和Caspase-12 mRNA表達量相對最低(圖6)。

A.肝臟組織中GRP-78 mRNA表達的變化；B.肝臟組織中Caspase-12 mRNA表達的變化圖6 肝臟組織中GRP-78和Caspase-12 mRNA的表達

2.5 肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白的表達水平Western blot結(jié)果顯示，與S組相比，IR和DH組大鼠肝臟p-PERK、p-IRE-1α和CHOP 蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01)，DL組大鼠肝臟p-PERK蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，大鼠肝臟p-IRE-1α和CHOP蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)，DM組大鼠肝臟p-IRE-1α、p-IRE-1α和CHOP蛋白表達量差異不具有顯著性(P>0.05)；與IR組相比，但各用藥組大鼠肝臟p-PERK和CHOP蛋白表達量均極顯著降低(P<0.01)，DM和DH組大鼠肝臟p-IRE-1α蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)，DL組p-IRE-1α蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。其中DM組大鼠肝臟p-PERK、p-IRE-1α和CHOP蛋白表達量相對最低(圖7)。

A.肝臟組織中p-PERK蛋白表達的變化；B.肝臟組織中p-IRE-1α蛋白表達的變化；C.肝臟組織中CHOP蛋白表達的變化；D.蛋白表達圖7 肝臟組織中p-PERK、p-IRE-1α和CHOP蛋白的表達

3 討論

ALT主要存在于肝細胞中，正常生理條件下血清中含量極少，在各種病毒性肝炎的急性期或藥物中毒導(dǎo)致肝細胞壞死時，肝細胞膜受到損壞，ALT得以被大量釋放入血液中[2]。本試驗中，IR組大鼠血清中ALT含量顯著高于S組，說明HIRI造成了一定的肝功能損傷；用藥組大鼠血清中ALT含量有降低，表明Dex能有效降低HIRI造成的肝功能損傷。

氧化應(yīng)激平衡在缺血過程中起關(guān)鍵作用，是導(dǎo)致肝細胞損傷的重要途徑之一[3]。MDA是氧化應(yīng)激過程中脂質(zhì)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，可直接損害肝細胞膜和線粒體膜等細胞膜性結(jié)構(gòu)，MDA是氧化損傷的標志物[4]。SOD是機體主要的氧自由基清除酶之一，可參與清除細胞中氧自由基，是抗氧化應(yīng)激的標志物[5]。本試驗中IR組大鼠肝臟MDA含量最高，SOD活性最低，表明HIRI會導(dǎo)致肝細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低SOD活力，這與王全勝等[6]研究結(jié)果相符。各用藥組大鼠肝臟MDA含量較低，SOD活性較強，表明Dex能有效降低HIRI導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

細胞凋亡是缺血再灌注過程中細胞損傷的重要形式，是一種程序性的細胞死亡[7]。正常機體會定量引導(dǎo)細胞凋亡來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，當機體受到傷害時，細胞凋亡增加，過量的細胞凋亡則會給機體帶來損傷。在HIRI過程中氧化應(yīng)激、鈣超載、凋亡因子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種因素都可以誘發(fā)細胞凋亡[8]。本試驗中IR組大鼠肝細胞凋亡率顯著高于S組大鼠肝細胞凋亡率，表明HIRI能夠引起嚴重的肝細胞凋亡；各用藥組大鼠肝細胞凋亡率均有所降低，表明Dex可有效減少HIRI造成的肝細胞凋亡。

HIRI導(dǎo)致的缺血缺氧及鈣超載失衡會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，功能紊亂，進一步引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)的發(fā)生。發(fā)生ERS時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP-78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號感受蛋白PERK、IRE1-α和ATF-6[9]分離，與堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的錯誤折疊或未折疊蛋白結(jié)合，從而清除這些蛋白[10]。與GRP-78分離后的3種信號感受蛋白開始各自感應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號并發(fā)揮效應(yīng)，開啟細胞凋亡通路[11]。Caspase-12是附于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜的一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡關(guān)鍵蛋白酶[12]，它參與的IRE-1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12通路是目前研究發(fā)現(xiàn)的唯一一條完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的細胞凋亡通路[13]，Caspase-12的表達水平可直接反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡水平。CHOP是一個特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，是促凋亡的重要信號分子，在正常情況下表達水平很低，ERS時，CHOP可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號感受蛋白激活，表達量大幅增加，激活下游凋亡基因和死亡受體的表達[14]。本試驗中IR組大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和相關(guān)凋亡基因PERK、ATF-6、GRP-78和Caspase-12 mRNA的表達量較S組顯著升高；與IR組相比，各給藥組均降低。IR組大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白p-IRE-1α、p-PERK和CHOP的表達量較S組均顯著升高；與IR組相比，各給藥組均降低。這一結(jié)果表明Dex可有效減少HIRI造成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

為了探討Dex給藥劑量對保護HIRI作用的影響，本試驗對不同劑量的Dex作用效果進行了研究。結(jié)果得出，不同劑量Dex對HIRI大鼠肝臟均具有一定的保護作用，低劑量Dex效果相對較差，對HIRI的保護效果不明顯；中劑量Dex對HIRI的保護效果相對較好，而高劑量Dex的效果介于低劑量與中劑量之間，這與ROBERT等[15]先前的研究結(jié)果一致，由此推測Dex對HIRI的保護作用在一定劑量范圍內(nèi)具有劑量依賴性，但存在藥物作用封頂效應(yīng)，是否因為大劑量的Dex導(dǎo)致血壓下降部分抵消了其器官保護作用，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，HIRI能導(dǎo)致肝功能損傷、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和細胞凋亡。Dex可以從促進肝功能恢復(fù)，減輕肝臟氧化應(yīng)激，降低肝細胞凋亡率等方面減輕HIRI所致的肝臟損傷。中等劑量(50 μg/kg)Dex可對HIRI產(chǎn)生顯著的保護作用，其保護機制可能是通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志蛋白GRP-78的表達，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感受蛋白PERK、ATF-6、IRE-1α以及凋亡信號分子Caspase-12、CHOP的表達來減輕HIRI。