牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌動(dòng)物致病性及其β毒素基因生物信息分析

吳 丹，黃家旗，羅潤(rùn)波，郭欣冉，呂家煌,2，宋仁德，索朗斯珠* (.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 2004；.青海玉樹藏族自治州畜牧獸醫(yī)工作站，青海 玉樹 85000)

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringenstype C，CpC)屬革蘭陽(yáng)性產(chǎn)芽胞桿菌[1]，環(huán)境耐受性強(qiáng)[2]，致病因子多種多樣，為典型的條件致病菌[3]。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α和β 2種重要外毒素，其中β毒素具有細(xì)胞毒性和致死性，是該菌的重要致病因子[4]。當(dāng)宿主生活環(huán)境發(fā)生不適變化或機(jī)體健康狀況下降時(shí)該菌大量增殖并產(chǎn)生毒素，常引起牦牛腹瀉、壞死性腸炎、腸毒血癥以及猝死等疾病[5]，由此造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失常年困擾著養(yǎng)殖戶[6]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素可由B型產(chǎn)氣莢膜梭菌和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌，由HUNTER等[7]最早從1株C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)液中純化得到。編碼β毒素的cpb基因在一種含有IS1151的質(zhì)粒上，其開放閱讀框(ORF)位于該質(zhì)粒的333～1 340 位之間，共編碼336個(gè)氨基酸。該基因前1～27個(gè)氨基酸組成一段信號(hào)肽，可引導(dǎo)β毒素穿過(guò)細(xì)胞膜并排出到細(xì)胞外，在外排過(guò)程中信號(hào)肽被酶解切除，形成一段含有309個(gè)氨基酸的成熟β毒素蛋白分子[8]。β毒素的抗原基因定位和致病機(jī)理尚不清楚，本試驗(yàn)以牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株Qinghai-06(GenBank登錄號(hào)：MW980095)為研究對(duì)象，從分子生物學(xué)信息的角度對(duì)成熟的β毒素基因及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為下一步構(gòu)建牦牛源重組β毒素基因、表達(dá)牦牛源重組β蛋白、以及為后續(xù)更深入地研究β毒素細(xì)胞毒作用乃至致病機(jī)理提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2020年夏末秋初，青海玉樹自治州多地發(fā)生牦牛腹瀉疫病，西藏農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室從腹瀉糞樣中成功分離出牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌多株，本試驗(yàn)選取其中1株牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株Qinghai-06(GenBank登錄號(hào)：MW980095)進(jìn)行動(dòng)物致病性研究并對(duì)其β毒素基因作生物信息分析。選取4周齡、SPF級(jí)、體質(zhì)量18～22 g的昆明系小鼠100只，購(gòu)自河南斯克貝斯生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器高純度dNTPs、DNA聚合酶、細(xì)菌DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN生化科技有限公司；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基(TSC)、梭菌增菌培養(yǎng)基(RCM)、厭氧肉湯培養(yǎng)基(FT)、羊血瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌脫纖維綿羊血購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；微量分光光度儀由杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；核酸蛋白檢測(cè)儀、高速離心機(jī)由德國(guó)艾本德公司生產(chǎn)。

1.3 細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增將保存的菌株解凍后接種于羊血瓊脂培養(yǎng)皿，隨后挑取單菌落于FT培養(yǎng)基，41℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)16 h，制得種子液。使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA，-20℃凍存?zhèn)溆?。根?jù)參考文獻(xiàn)合成產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rDNA細(xì)菌通用引物[9]、4種常見(jiàn)致死性毒素(α、β、ε、ι)引物[10]、腸毒素(CPE)[11]、壞死性腸炎B樣毒素(NetB)[12]及β毒素基因引物(不含信號(hào)肽和終止密碼子)[13]對(duì)菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用50 μL總體系，引物信息見(jiàn)表1。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 PCR引物信息

1.4 菌株生長(zhǎng)特性按體積分?jǐn)?shù)5%接種量吸取1.3中種子液轉(zhuǎn)接150 mL無(wú)菌FT培養(yǎng)基，振蕩混勻后分裝至15支試管中，放入41℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)。每隔2 h取出1只試管，吸取適量菌液，12 000 r/min 離心10 min，棄去上清，用等量無(wú)菌生理鹽水懸浮。以無(wú)菌生理鹽水做空白對(duì)照對(duì)微量分光光度儀進(jìn)行調(diào)零，測(cè)定菌液D600 nm值，連續(xù)測(cè)量24 h。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液D600 nm值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)曲線。另取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株的菌液，測(cè)定相應(yīng)稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的D600 nm值，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)出相應(yīng)D600 nm值所對(duì)應(yīng)的CFU值。繪制D600 nm與稀釋倍數(shù)和D600 nm與活菌菌落CFU的相關(guān)曲線及關(guān)系式。

1.6 小鼠內(nèi)臟組織的病理變化觀察選取攻毒后急性死亡(24 h內(nèi))小鼠和慢性死亡(72 h后)小鼠內(nèi)臟組織于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片和H.E染色后，光鏡下觀察小鼠內(nèi)臟組織病理變化。

1.7 β毒素基因克隆將PCR擴(kuò)增出的β毒素基因凝膠電泳條帶切下，嚴(yán)格按照膠回收試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行DNA膠回收純化，并利用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定DNA濃度和純度。利用pMDTM18-T Vector克隆試劑盒，將回收的β毒素基因DNA片段與pMDTM18-T載體連接，通過(guò)熱激法將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，隨后利用含有Amp+的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液，按照質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明提取質(zhì)粒，并委托擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 β毒素基因編碼蛋白分析利用生物軟件分析β毒素蛋白：DNAMAN 4.0軟件將β毒素基因堿基序列翻譯成氨基酸序列；在線軟件ProtParam分析β毒素基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)；在線軟件ProtScale分析β毒素蛋白的親水性；在線軟件SOPMA分析β毒素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；在線軟件NetPhos分析β毒素蛋白的磷酸化位點(diǎn)；IEDB和BCPREDS分析β毒素蛋白的抗原表位；在線軟件SWISS-MODEL建立β毒素蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌各基因PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖1)：16S rDNA PCR引物擴(kuò)增出1 465 bp的條帶；4種常見(jiàn)致死性毒素PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖在325(α毒素)、196 bp(β毒素)出現(xiàn)條帶；腸毒素(CPE)和壞死性腸炎B樣毒素(NetB)PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖未出現(xiàn)條帶；β毒素基因PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖在927 bp處出現(xiàn)條帶。結(jié)果表明，16S rDNA PCR、毒素分型、CPE、NetB以及β毒素基因擴(kuò)增條帶與預(yù)期條帶相符合，本試驗(yàn)所用菌株Qinghai-06為牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，可用于下一步試驗(yàn)研究。

M.DL2000 DNA Marker；N.陰性對(duì)照；1.16S rDNA；2～5.4種常見(jiàn)致死性毒素α、β、ε、ι；6.腸毒素(CPE)；7.壞死性腸炎B樣毒素(NetB)；8.β毒素基因圖1 細(xì)菌各基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 生長(zhǎng)曲線牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株Qinghai-06的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。由圖可知，0～2 h為細(xì)菌繁殖較少的遲緩期；2～6 h為細(xì)菌幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；6～20 h為菌群生長(zhǎng)平衡的穩(wěn)定期，菌液D600 nm值最大值為2.242；20～24 h為細(xì)菌死亡數(shù)大于繁殖數(shù)的衰亡期。

圖2 牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株Qinghai-06生長(zhǎng)曲線

2.3 菌液D600 nm與稀釋倍數(shù)、菌落數(shù)CFU的關(guān)系經(jīng)SPSS 19.0軟件分析得出，菌液D600 nm與稀釋倍數(shù)成指數(shù)關(guān)系(圖3A)，其關(guān)系式為：y=-0.857ln(x)+2.236，R2=0.995，P<0.01為極顯著，表明試驗(yàn)操作準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)可靠；菌液D600 nm與菌落數(shù)CFU成線性關(guān)系(圖3B)，其關(guān)系式為：y=0.881x-0.017，R2=0.999，P<0.01為極顯著，可用于菌液D600 nm與菌落數(shù)CFU之間相互換算。

圖3 菌液D600 nm與稀釋倍數(shù)(A)、菌落數(shù)CFU(B)的關(guān)系

表2 LD50試驗(yàn)各組劑量與小鼠死亡情況

經(jīng)SPSS 19.0軟件分析(表3)，牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)感染小鼠的LD50為0.408×108CFU/mL，95%置信區(qū)間為0.308×108～0.549×108CFU/mL。

表3 SPSS軟件對(duì)LD50的計(jì)算結(jié)果

2.5 死亡小鼠病理剖檢

2.5.1一般剖檢 攻毒后小鼠精神萎靡、飲食量下降、行動(dòng)遲緩。低濃度攻毒組，小鼠逐漸出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、肌肉顫抖、眼瞼下垂、流淚、腹部脹大、陰道出血，慢性死亡。高濃度攻毒組，基本無(wú)任何癥狀就急性死亡。對(duì)急性死亡和慢性死亡小鼠進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)腹腔都有積液，小腸出血。對(duì)照組未見(jiàn)任何異常。小鼠腹腔解剖見(jiàn)圖4。

A.對(duì)照組；B.急性死亡組；C.慢性死亡組圖4 攻毒小鼠腹腔解剖圖

2.5.2組織病理變化 由小鼠組織病理變化切片(圖5)可知：通過(guò)切片、染色后和對(duì)照組相比，觀察到急性死亡小鼠各臟器基本未見(jiàn)明顯病理改變。慢性死亡小鼠腸道有不同程度的細(xì)胞溶解現(xiàn)象；腦部神經(jīng)元未見(jiàn)變性、壞死，間質(zhì)血管見(jiàn)輕微充血；腎小管見(jiàn)變性伴有透明管型，間質(zhì)未見(jiàn)充血、水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肝臟細(xì)胞見(jiàn)空泡變性；脾臟巨噬細(xì)胞和組織細(xì)胞增生，紅髓見(jiàn)輕微淤血。心臟、肺臟、胃均未出現(xiàn)病理變化。

2.6 β毒素蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析經(jīng)過(guò)DNAMAN軟件翻譯得出：β毒素基因序列長(zhǎng)927 bp，共編碼309個(gè)氨基酸，其中核苷酸序列不包含信號(hào)肽序列和終止密碼子。氨基酸序列如表4所示。

表4 牦牛源CpC β毒素基因氨基酸序列

經(jīng)過(guò)在線軟件Prot-Param對(duì)β毒素蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析可知：牦牛源CpC β毒素基因分子式為C1535H2396N406O502S9，相對(duì)分子質(zhì)量為34.9 ku，pI=5.52，負(fù)電荷(Asp+Glu)殘基總數(shù)36個(gè)，正電荷(Arg+Lys)殘基總數(shù)31個(gè)，脂肪指數(shù)：72.52。該基因編碼蛋白含有全部20種氨基酸(表5)，其中S(Ser)和T(Thr)含量最高，均占10.7%；C(Cys)含量最少，僅1個(gè)，占0.3%。在體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)半衰期為1.4 h，在酵母體內(nèi)半衰期3 min，大腸桿菌體內(nèi)的半衰期>10.0 h。不穩(wěn)定指數(shù)為 35.91，屬穩(wěn)定蛋白。

表5 牦牛源CpC β毒素蛋白氨基酸含量

2.7 β毒素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析利用在線軟件SOPMA對(duì)β毒素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)情況(圖6)分析可知，β毒素蛋白有4種二級(jí)結(jié)構(gòu)存在(表6)，其中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(占53.07%)最多，α-螺旋(2.59%)最少。α-螺旋分布區(qū)域：3～4，90～92，206，230，265；β-轉(zhuǎn)角分布區(qū)域：24～25，68～69，73～74，137，166～167，204，225～226，234～235，238～239，264，301～303；β-折疊分布區(qū)域：5～9，18～23，29～33，45～53，61～67，76～78，93，99～104，113～117，125～136，140～142，156～157，160～163，169～173，181～188，202～203，205，207～210，231～233，240～245，254～259，266～270，294～299，306～309；無(wú)規(guī)則卷曲分布區(qū)域：1～2，10～17，26～28，34～44，54～60，70～72，75，79～89，94～98，105～112，118～124，138～139，143～155，158～159，164～165，168，174～180，189～201，211～224，227～229，236～237，246～253，260～263，271～293，300，304～305。

h.α-螺旋；e.β-折疊；t.β-轉(zhuǎn)角；c.無(wú)規(guī)則卷曲圖6 牦牛源CpC β毒素二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表6 牦牛源CpC β毒素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成

2.8 β毒素蛋白親水性預(yù)測(cè)及分析經(jīng)過(guò)在線軟件Protscale對(duì)β毒素蛋白的親水性分析(圖7)可知，多肽鏈67號(hào)位的亮氨酸(L)評(píng)分最高為1.278，260號(hào)位的谷氨酸(E)評(píng)分最低為-2.356，親水性總平均值(GRAVY)：-0.567，為親水性蛋白。其親水性蛋白分布區(qū)域：1～17，19～31，33～45，51～60，70～90，106～110，117～135，141～166，168～204，207～218，221～230，247～252，254～275，284～292，300～304。

圖7 牦牛源CpC β毒素基因親水性分析

2.9 β毒素蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析利用在線軟件NetPhos 3.1 Server 對(duì)β毒素基因編碼蛋白的激酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖8)，Ser(S)得分高于0.5的個(gè)數(shù)為25個(gè)；Thr(T)得分高于0.5的個(gè)數(shù)為20個(gè)；Tyr(Y)得分高于0.5的個(gè)數(shù)為8個(gè)。表明該蛋白可能存在53個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)這些氨基酸殘基磷酸化后，蛋白便帶上電荷，從而使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)活性變化以及在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。

圖8 牦牛源CpC β毒素蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.10 β毒素蛋白B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測(cè)通過(guò)在線軟件 IEDB對(duì)β毒素蛋白B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測(cè)(圖9A)，最低分0.268，最高分0.677，平均分0.524，共預(yù)測(cè)到11個(gè)線性抗原表位，主要分布區(qū)域：5～45，52～59，71～96，107～129，135～155，165～179，187～205，213～236，261～272，281～292，300～305。利用在線軟件BCPREDS，采用預(yù)測(cè)長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸，特異性75%以上，并通過(guò)重疊過(guò)濾的方法對(duì)β毒素蛋白B細(xì)胞線性抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖9 B)，共得到10個(gè)符合條件的線性抗原表位，分別起始于2，30，51，81，114，138，174，210，245，276。綜合2種預(yù)測(cè)方法β毒素蛋白B細(xì)胞線性抗原表位可能存在的區(qū)域有：2～21，30～45，52～59，81～96，114～129，138～155，174～179，187～193，213～229，261～265，281～292。

A.在線軟件 IEDB分析結(jié)果； B.在線軟件BCPREDS分析結(jié)果圖9 牦牛源CpC β毒素蛋白B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測(cè)

2.11 β毒素蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)β毒素蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得到2個(gè)模型顯示(圖10)。模型1：β毒素蛋白為單體，含1個(gè)Zn2+配體，主要由β-折疊形成的β-折疊結(jié)構(gòu)域和無(wú)規(guī)則卷曲形成的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)域；GMQE為0.80。模型2：β毒素蛋白為單體，無(wú)配體，主要由β-折疊形成的β-折疊結(jié)構(gòu)域和無(wú)規(guī)則卷曲形成的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)域；GMQE為0.65。其中模型1可信度高，更接近真實(shí)結(jié)構(gòu)，可用于虛擬篩選、分子對(duì)接等功能結(jié)構(gòu)研究。

A.模型1;B.模型2圖10 牦牛源CpC β毒素蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

首先，本試驗(yàn)利用振蕩比濁法對(duì)牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株Qinghai-06生長(zhǎng)特性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)速率快，對(duì)數(shù)期僅需4 h，而單雪梅等[14]研究的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株(C60)對(duì)數(shù)期卻需要8 h。牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌菌量多、濃度高，在平衡期其D600 nm值可以達(dá)到2.242，而王開功等[15]研究的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株(C57)在平衡期其D630 nm值最高僅達(dá)到0.95左右，單雪梅等[14]研究的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株(C60)在平衡期其D630 nm值最高僅達(dá)到1.80左右。其原因可能是由于不同毒素型的產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)特性不同，不同培養(yǎng)液也對(duì)D值有著不同影響。隨后，本研究通過(guò)動(dòng)物攻毒試驗(yàn)記錄死亡小鼠，利用SPSS軟件分析計(jì)算該菌株對(duì)昆明系小鼠的半數(shù)致死量，得出該菌株對(duì)感染小鼠的LD50為0.408×108CFU/mL，95%置信區(qū)間為0.308×108～0.549×108CFU/mL，屬于強(qiáng)致死性菌株，可用于致病性研究。

隨后，本試驗(yàn)采集攻毒后死亡小鼠內(nèi)臟，制成病理切片，通過(guò)H.E染色鏡檢發(fā)現(xiàn)牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起腸、腦、腎臟、肝臟、脾臟組織病理變化，在心臟、肺臟、胃組織未見(jiàn)病理變化。其主要引起小鼠腸道有不同程度的細(xì)胞溶解現(xiàn)象；腦部神經(jīng)元未見(jiàn)變性、壞死，間質(zhì)血管見(jiàn)輕微充血；腎小管見(jiàn)變性伴有透明管型；肝臟細(xì)胞見(jiàn)空泡變性；脾臟巨噬細(xì)胞和組織細(xì)胞增生，紅髓見(jiàn)輕微淤血。通過(guò)小鼠病理切片分析可以在以后臨床治療牦牛產(chǎn)氣莢膜梭菌疫病時(shí)采取有效的、合理的、直接的治療措施，為提高該疫病的臨床診斷水平積累了基本的技術(shù)資料。

產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素是一種毒力較強(qiáng)的成孔毒素，具有細(xì)胞毒性和致死性，在外分泌過(guò)程被切除掉信號(hào)肽形成胰蛋白酶敏感蛋白[16]。β毒素具有細(xì)胞活性，同時(shí)能夠增大毛細(xì)血管滲透性、增加血壓、降低心率，也是一種非典型神經(jīng)毒素[17]。了解β毒素蛋白的抗原表位，一方面有助于為β毒素致病機(jī)制的研究提供思路，另一方面可以針對(duì)性的做好β毒素的免疫預(yù)防工作[18]。本研究通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素基因及其編碼蛋白分析發(fā)現(xiàn)：β毒素基因序列長(zhǎng)927 bp(不包含信號(hào)肽序列和終止密碼子)，共編碼309個(gè)氨基酸。β毒素蛋白分子式為C1535H2396N406O502S9，相對(duì)分子質(zhì)量為34.9 ku，等電點(diǎn)為5.52，屬于穩(wěn)定的、含多個(gè)潛在激酶磷酸化位點(diǎn)的單體親水性蛋白，含1個(gè)Zn2+配體，其中265位含有唯一的半胱氨酸。其三級(jí)結(jié)構(gòu)與冶貴生等[19]預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Ⅰ相似，可信度高。經(jīng)生物軟件預(yù)測(cè)，β毒素蛋白無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)主要集中于10～100區(qū)段和140～300區(qū)段；親水性氨基酸主要集中于140～304區(qū)段；潛在磷酸化位點(diǎn)主要集中于10～80和150～220區(qū)段；B細(xì)胞線性抗原表位主要集中于110～290區(qū)段。綜合二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、磷酸化位點(diǎn)可以預(yù)測(cè)出牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素蛋白有效抗原表位主要集中于140～290區(qū)段，其結(jié)果比王玉建等[20]對(duì)菌株KP064408.1預(yù)測(cè)的β毒素蛋白有效抗原表位主要在aa108～aa320區(qū)段有所縮小，但冶貴生等[19]的預(yù)測(cè)結(jié)果190～193與211～214位氨基酸成為抗原表位的可能性最大，在本試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果之內(nèi)。本試驗(yàn)從多個(gè)角度對(duì)牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素進(jìn)行預(yù)測(cè)，提高了預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，可為下一步構(gòu)建牦牛源重組β毒素基因，表達(dá)牦牛源重組β蛋白，以及為后續(xù)更深入的研究β毒素的細(xì)胞毒性作用乃至致病機(jī)理提供重要理論依據(jù)。