吉林省牛病毒性腹瀉病毒與牛腸道病毒混合感染的流行病學調(diào)查

董 坤，胡俊英，張芷源，章 凡，胡卉琪，常曉冉，王浴光，米日古麗·買吐送，王新平，2*(.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 30062；2.教育部人獸共患病研究重點實驗室，吉林 長春 30062)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)，又稱黏膜病 (mucosal disease,MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起動物的一種呈現(xiàn)多臨床類型表現(xiàn)的傳染病，臨床上以腹瀉、消化道黏膜發(fā)炎、壞死和糜爛為典型特征[1-2]。母牛在懷孕前3個月內(nèi)感染BVDV可引起胎牛對病毒產(chǎn)生免疫耐受，這種犢牛出生后雖然血清抗體呈陰性，但可終身攜帶病毒，并不斷向周圍環(huán)境排毒，是最危險的傳染源，給該疫病的防控帶來困難。此外，BVDV感染無論呈顯性感染還是隱性感染均可產(chǎn)生免疫抑制作用，導致感染動物的抵抗力下降，進而增強對其他疫病的易感性。目前，國內(nèi)已有多個省市自治區(qū)報道有牛病毒性腹瀉的暴發(fā)流行[3-6]。

牛腸道病毒(bovine enterovirus，BEV)感染是國內(nèi)近年來新發(fā)的動物傳染病，臨床上以消化道和呼吸道癥狀為主要特征[7-8]。引起腸道病毒感染的病原體為小RNA病毒科、腸道病毒屬中的成員。該病毒直徑25～30 nm呈二十面體結構。根據(jù)病毒的最新分類，腸道病毒屬包含12個腸道病毒種和3個鼻病毒種，其中E種和F種腸道病毒引起牛的感染[9-10]。BEV感染最早于1959年首次由MOLL等[11]報道，之后許多國家也先后報道本病的暴發(fā)流行[12-14]。國內(nèi)李英利等[7]于2011年首次從腹瀉的犢牛體內(nèi)分離出F種腸道病毒；邢澤黎等[15]于2012年從吉林省某發(fā)病牛場分離出國內(nèi)首株E種腸道病毒HY12，并建立了檢測BEV抗原的雙抗體夾心ELISA方法[16]。之后也有報道其他地區(qū)的BEV感染[17-18]。

由于BVDV與BEV感染臨床上均以腹瀉為主要特征，臨床表現(xiàn)極其相似，難以區(qū)分，當發(fā)生混合感染時，難以做出確切診斷，給疫病的診斷與凈化增加了困難。目前，國內(nèi)有關BVDV的報道雖然很多，但與BEV混合感染情況尚不清楚，急需進行相應的流行病學調(diào)查。本研究應用檢測BVDV與BEV抗原的雙抗體夾心ELISA方法，分別對吉林省不同地區(qū)牛群BVDV與BEV感染進行流行病學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)吉林省不同地區(qū)、不同年齡及不同品種的牛群均存在BVDV與BEV混合感染情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及檢測糞便樣品共計738份，采自 2019-2020年吉林省不同地區(qū)的牛場，其中長春204份、延邊192份、白山153份、白城72份、四平117份。樣品的檢測采用BVDV及BEV雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒[16,19]。根據(jù)檢測結果，確定BVDV、BEV及兩者混合感染的流行病學情況。

1.2 主要試劑、儀器及細胞抗BVDV CC13B毒株E2基因的兔源多克隆抗體、抗BEV HY12毒株VP1基因的鼠源多克隆抗體由本實驗室制備與保存；羅丹明標記羊抗鼠二抗、FITC標記的羊抗兔二抗購自Sigma；DMEM購自Gibco(美國)公司；胎牛血清(FBS)購自海克隆生物公司；DNA Marker、Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶等購自TaKaRa生物技術有限公司；PCR擴增儀購自杭州博日科技有限公司；電泳儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 引物的設計與RT-PCR檢測根據(jù)基因文庫收錄的BVDV與BEV部分標準毒株核苷酸序列，分別以保守區(qū)設計特異性引物，用于擴增目的基因序列。引物(表1)由上海生工有限公司合成。將處理好的樣品接種于MDBK細胞后，應用反轉錄試劑盒提取細胞總RNA并反轉錄成cDNA，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA作為模板，特異性引物擴增病毒的目的基因。PCR反應程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，共計35個循環(huán)；72℃ 10 min。

表1 引物信息

1.4 免疫學檢測應用IFA試驗對部分陽性樣品進行免疫學鑒定，具體過程如下：選擇代表性BVDV/BEV混合感染樣品，接種MDBK細胞，同時設陰性對照。待細胞出現(xiàn)40%左右的病變后，使用甲醇于-20℃冰箱固定20 min；PBS-T洗滌后，以抗HY12毒株鼠源多克隆抗體和抗CC13B毒株兔源多克隆抗體作為一抗，于37℃孵育60 min；PBS-T洗滌后，加入羅丹明標記羊抗鼠二抗和FI-TC標記的羊抗兔二抗孵育35 min；PBS-T洗滌后，經(jīng)DAPI核染色，封片置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 吉林省不同地區(qū)BVDV與BEV單一感染的檢測結果對2019-2020年采集于吉林省不同地區(qū)的738份糞便樣品進行BVDV和BEV的檢測與分析，結果在738份樣品中，檢測出BVDV感染率為21.68%(160/738)，BEV感染率為14.23%(105/738)。其中，長春BVDV感染率最高為42.65%(87/204)，延邊、白山、白城、四平BVDV感染率分別為17.71%(34/192)，11.76%(18/153)，12.50%(9/72)，10.26%(12/117)。白城地區(qū)BEV感染率最高為20.83%(15/72)，長春、延邊、白山、四平地區(qū)BEV感染率分別為18.63%(38/204)，8.33%(16/192)，15.03%(23/153)，11.11%(13/117)。上述結果表明，吉林省不同地區(qū)的牛群均存在BVDV與BEV感染(圖1)。

圖1 吉林省不同地區(qū)牛群BVDV、BEV單一感染檢測結果

2.2 不同地區(qū)BVDV與BEV混合感染的檢測結果對上述BVDV與BEV檢測結果運用統(tǒng)計學方法進行分析，結果顯示，吉林省BVDV/BEV混合感染率為7.99%(59/738)(圖2)。為了解BVDV/BEV混合感染在吉林省不同地區(qū)分布情況，對檢測結果進一步進行分類。結果顯示，長春混合感染率最高，為14.71%(30/204)；四平混合感染率最低，為3.42%(4/117);延邊、白山、白城混合感染率為3.65%(7/192)，7.84%(12/153)，8.33%(6/72)。表明BVDV/BEV混合感染在吉林省不同地區(qū)之間存在差異(圖3)。

圖2 BVDV和BEV單一與混合感染率檢測結果

圖3 吉林省不同地區(qū)BVDV和BEV混合感染率檢測結果

2.3 不同品種的牛群BVDV與BEV感染結果為了解不同品種BVDV與BEV感染情況，對不同品種牛群進行檢測(表2)。其中，荷斯坦牛的BVDV與BEV單一及混合感染率均最高,延邊牛BEV感染率最低(8.33%)。利木贊牛及其他牛群的BVDV感染最低(10.26%)，其BVDV與BEV的混合感染率也最低(3.42%)。上述結果表明，吉林省不同品種的牛群存在BVDV與BEV的單一與混合感染。

表2 不同品種牛群BVDV與BEV的感染情況

2.4 不同年齡牛群BVDV和BEV混合感染結果為了解不同年齡牛群對BVDV/BEV混合感染的情況，將上述結果運用統(tǒng)計學方法進行分析(圖4)，結果顯示，犢牛混和感染率最低為3.39%(2/59)，育成?；旌透腥韭蕿?.47%(5/59)，青年牛混和感染率為30.51%(18/59)，成年牛混和感染率為57.63%(34/59)，表明各年齡的牛群均存在不同程度的BVDV和BEV混合感染。

圖4 吉林省不同年齡段BVDV和BEV混合感染率

2.5 BVDV與BEV感染的RT-PCR鑒定隨機選取ELISA檢測為陰性與陽性的樣品，應用設計的BVDV與BEV特異性引物，進行RT-PCR擴增。結果PCR分別擴增出與預期大小相符的目的片段，BVDV片段大小為297 bp，BEV的片段大小為505 bp。部分代表性BVDV/BEV混合感染的樣品中可同時檢測出大小為297，505 bp的片段(圖5)。

A.RT-PCR擴增BVDV結果(M.DL2000 DNA Marker；1～6.BVDV陽性樣品)；B.RT-PCR擴增BEV結果(M.DL2000 DNA Marker；1～4,6.BEV陽性樣;5.BEV陰性樣品)；C.一步式RT-PCR擴增BVDV/BEV結果(M.DL2000 DNA Marker；1,14.BVDV及BEV陰性樣品對照;2,7,9～10,12～13.BVDV/BEV混合感染的陽性樣品;3～6.BEV陽性樣品;8,11.BVDV陽性樣品)圖5 RT-PCR鑒定BVDV與BEV感染結果

2.6 BVDV與BEV混合感染的免疫學鑒定為驗證BVDV與BEV混合感染結果，選擇代表性樣品接種MDBK細胞進行病毒分離，同時應用檢測BVDV與BEV的IFA試驗進行免疫學鑒定。結果顯示，可同時從BVDV與BEV雙陽性樣品接種的細胞中檢測到BVDV和BEV抗原信號。感染BVDV的細胞漿內(nèi)呈綠色熒光，感染BEV的細胞胞漿內(nèi)呈紅色熒光。同時感染BVDV與BEV的細胞呈黃色熒光(圖6)，進一步證明吉林省牛群存在BVDV與BEV混合感染情況。

A.BVDV CC13B抗體檢測結果；B.腸道病毒HY12抗體檢測結果；C.DAPI染色接毒細胞核結果；D.免疫熒光確證BVDV與BEV混合感染結果圖6 代表性BVDV與BEV混合感染樣品接種MDBK細胞后免疫熒光鑒定結果 (×20)

3 討論

近年來，國內(nèi)臨床上以腹瀉為主要特征的疫病與日俱增，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。 BVDV與BEV作為引起牛群呈現(xiàn)腹瀉的重要病原體，如發(fā)生混合感染可使疫病變得更加復雜，引起更為嚴重的疾病與經(jīng)濟損失。國內(nèi)外學者認為BVDV或BEV感染后易與其他病原微生物發(fā)生混合感染，導致牛群死亡率增加。研究發(fā)現(xiàn)，牛腹瀉性疾病難以根除是由于BVDV與輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌、沙門菌及其他病原微生物發(fā)生混合感染所致[20-21]。宋維彪等[22]對青海省海北州展開了牦牛感染BVDV、BEV的病原學調(diào)查與分析，采用RT-PCR方法對當?shù)夭杉?82份糞便樣品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)青海北州地區(qū)的牦牛中存在較高的BVDV/BEV混合感染。陳新諾等[23]對青藏高原地區(qū)牦牛感染BVDV和BEV的情況進行了分子流行病學調(diào)查，結果顯示，青海省湟中縣138份腹瀉牦牛糞便樣品也存在較高的BVDV與BEV混合感染現(xiàn)象。但是，國內(nèi)其他地區(qū)的牛群是否存在BVDV/BEV混合感染現(xiàn)象尚不清楚。

本研究采用BVDV、BEV雙抗體夾心ELISA抗原試劑盒[16,19]，對吉林省5個地區(qū)的樣品進行檢測，結果顯示BVDV感染率為21.68%，BEV感染率14.23%，BVDV/BEV混合感染率為7.99%。進一步分析發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛與西門塔爾牛具有較高的BVDV/BEV混合感染率(7.84%～13.04%)，而延邊牛、利木贊及其他牛群混合感染率為3.42%～3.65%。對不同年齡段牛的檢測結果顯示，犢牛、育成牛、青年牛及成年?；旌细新蕿?.39%～57.63%，說明隨著年齡的增長，BVDV/BEV感染率逐漸升高。此外，本研究以PCR與免疫熒光試驗對部分ELISA檢測結果進行了鑒定，試驗結果與ELISA檢測結果一致。上述結果填補了吉林省BVDV/BEV混合感染的流行病學本底空白，為今后防控及凈化奠定了理論基礎。

流行病學調(diào)查是疫病防控的重要環(huán)節(jié)與前提。本研究檢測吉林省不同地區(qū)的樣品，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同年齡與品種的檢測結果存在差異，這可能與當?shù)仞B(yǎng)殖場規(guī)模大小、免疫程序以及病毒本身變異及多樣性有關。不同品種之間的BVDV、BEV感染情況有一定差異性，這可能是由于地區(qū)間自然地理、生物安全及飼養(yǎng)方式不同所致。依據(jù)本研究的調(diào)查結果，推測犢牛BVDV/BEV存在混合感染的原因可能是懷孕動物感染犢牛所致。有關成年牛BVDV/BEV混合感染率較高，一方面可能是由于動物感染BVDV后有免疫耐受現(xiàn)象并產(chǎn)生免疫抑制作用，導致感染動物的抵抗力下降，造成更易感染BEV[24]；另一方面，牛群接觸病原微生物的不斷積累，病毒變異及多樣性，使BVDV/BEV混合感染機率增加。本研究探究了吉林省牛群BVDV與BEV單一及混合感染的流行分布情況，為吉林省乃至全國牛腹瀉性疫病的防控及凈化提供了重要的流行病學依據(jù)。