基于血清4型禽腺病毒fiber-1蛋白間接ELISA檢測方法的建立

武曉倩，謝芝勛，羅思思，韋 悠，鄧顯文，李小鳳，萬麗軍，曾婷婷，謝麗基，任紅玉 (1.廣西大學 動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧 530004；.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001)

心包積液-肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)由血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)引起[1]，該病于1987年在巴基斯坦安卡拉地區(qū)首次報道，隨后蔓延到世界各地[2]，2015年起在中國多地暴發(fā)[3]。發(fā)病雞臨床表現(xiàn)為嗜睡、羽毛蓬松、精神沉郁和排黃綠色稀糞等癥狀，剖檢特征為心包有淡黃色積液，肝臟腫大黃染等[4]。HHS既可水平傳播也可垂直傳播，甚至可形成氣溶膠在空氣中傳播[5]，傳染力強、死亡率高，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，因此建立簡便快速的診斷方法十分重要。目前診斷HHS的方法主要有分子生物學方法如聚合酶鏈式反應(PCR)、實時熒光定量PCR(qPCR)、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)等[6]，這些方法準確快速，但成本高昂，對檢測人員要求較高。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法操作簡單，成本低廉，特異性好，適用于進行大規(guī)模的血清學檢測，所以建立能夠快速準確檢測FAdV-4抗體的ELISA方法對該病的防控意義重大。

I群禽腺病毒根據(jù)血清交叉中和試驗，可細分為12個血清型(1～7、8a、8b、9～11)[7]。FAdV-4編碼hexon、penton、fiber-1、fiber-2 4個主要的結(jié)構(gòu)蛋白，hexon和penton蛋白與其他血清型同源性都較高。宋文平等[7]研究發(fā)現(xiàn)hexon蛋白與其他血清型均有交叉反應。fiber-1和fiber-2蛋白僅與FA-dV-10同源性較高，與其他血清型同源性較低[9]。因此，用fiber蛋白作為包被抗原檢測FAdV-4抗體可能具有更好的特異性。此外，fiber-1蛋白是病毒復制的必需蛋白。PAN等[10]發(fā)現(xiàn)FAdV-4利用fiber-1結(jié)合宿主細胞CAR的D2結(jié)構(gòu)域，完成病毒與宿主細胞的結(jié)合；fiber-1蛋白還能誘導機體產(chǎn)生針對FAdV-4的特異性抗體，具有良好的免疫效果[11]，但目前基于fiber-1蛋白作為檢測抗原的相關(guān)研究還較少。因此本試驗成功原核表達fiber-1重組蛋白，并以此為包被抗原，建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法，為該病的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株與主要試劑FAdV-4毒株由本實驗室分離、純化、鑒定和保存；FAdV-1、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-10陽性血清及SPF雞陰性血清由本實驗室制備；雞新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、H5和H9亞型禽流感病毒(AIV)陽性血清由本實驗室保存；pET-32a載體、DNA提取試劑盒、高保真酶、Trans 5α感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)公司；DNA連接試劑盒、20T載體、EcoRⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)公司；氨芐青霉素、X-gal、IPTG、10%蛋白預制膠、高效RIPA裂解液、考馬斯亮藍快速染色液等購自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；His標簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀公司；HRP標記山羊抗雞二抗，ECL超敏化學發(fā)光試劑盒購自寶生物工程(上海)有限公司。

1.2 引物設(shè)計參考GenBank已經(jīng)公布SD1601/FAdV-4毒株(登錄號：MH006602.1)fiber-1基因序列，設(shè)計1對特異性引物，上游引物5′-CCGGAATTCATGTCGGCCCTAATCGC-3′；下游引物：5′-GGGCTCGAGTTAGGGGCCCGGAGCATT-3′，下劃線斜體部分分別為EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點，引物由華大基因有限公司合成，目的片段長度1 296 bp。

1.3 fiber-1基因的克隆按DNA提取試劑盒說明書操作，提取FAdV-4基因組DNA。以基因組為模板擴增fiber-1基因。將PCR產(chǎn)物凝膠回收，連接到20T載體上，轉(zhuǎn)入Trans 5α感受態(tài)細胞，鑒定陽性菌并送生工測序正確后，用EcoRⅠ和XhoⅠ 將pET-32a載體和fiber-1質(zhì)粒37℃雙酶切3 h;酶切產(chǎn)物凝膠回收后在16℃下連接14 h;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL(21)DE3感受態(tài)細胞，取陽性克隆菌經(jīng)雙酶切鑒定，送生工測序。測序結(jié)果用MegAlign軟件中的Clustal W方法比對分析，確保重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.4 fiber-1重組蛋白的誘導表達及誘導條件優(yōu)化將測序正確的陽性菌液按1%比例接種10 mL含氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 h后，留5 mL 作為種子液，余下5 mL與甘油混合后置于-80℃ 保存。以1∶100接種Amp+LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)4 h，加入0.6 mmol/L的IPTG，分別誘導表達1，2，3，4，5，6，7 h，誘導結(jié)束后取菌液沉淀，超聲裂解后進行SDS-PAGE電泳分析，篩選出最佳誘導時間；加入IPTG至終濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L以最佳誘導時間誘導，處理菌液進行SDS-PAGE電泳，用BandScan 4.3軟件進行分析，篩選最佳IPTG誘導濃度。

1.5 fiber-1重組蛋白的可溶性鑒定和純化以最佳條件誘導5 mL菌液，離心后用PBS重懸菌體沉淀，加入溶菌酶和蛋白酶抑制劑，反復凍融3次后在冰上超聲裂解菌體至溶液清澈，離心后取上清和沉淀SDS-PAGE電泳，確定表達產(chǎn)物的存在方式。根據(jù)蛋白純化試劑盒說明書，誘導600 mL菌液，離心后加入10倍沉淀體積的裂解液，冰浴超聲處理至無沉淀，4℃高速離心，用10倍沉淀體積的binding buffer充分溶解沉淀，離心15 min，取上清液上柱，與鎳柱填料充分混合后靜置分層，收集流穿液，用15倍柱體積的binding buffer沖洗柱子，再用咪唑終濃度為25，50，75，100，125，150，175，200，250，300 mmol/L的elution buffer依次洗脫，分管收集，每個梯度約5 mL。SDS-PAGE電泳確定重組蛋白純化效果，選擇純度較高的蛋白樣品進行透析復性，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.6 Western blot鑒定純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶封閉3～4 h后，用FAdV-4陽性血清1∶200稀釋作為一抗，HRP標記的山羊抗雞二抗1∶4 000稀釋，進行Western blot鑒定，ECL超敏化學發(fā)光試劑盒進行顯色，觀察結(jié)果。

1.7 fiber-1-ELISA反應條件優(yōu)化

1.7.1抗原最佳包被質(zhì)量濃度和血清最佳稀釋度的確定 利用方陣試驗初步確定包被抗原和一抗最佳稀釋度：將重組蛋白倍比稀釋為32，16，8，4，2，1 mg/L，每個梯度包被1列，陰、陽性血清稀釋為1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，每個稀釋度包被1行，按間接ELISA程序操作。重復3次，選擇陽性血清D450 nm接近1，P/N最大的孔所對應的條件為最佳條件。

1.7.2酶標二抗稀釋度、包被條件、封閉時間、一、二抗和顯色時間的確定 依次對酶標二抗稀釋度、抗原包被時間、封閉時間、一、二抗作用時間和顯色時間進行優(yōu)化篩選，確定fiber-1-ELISA的最佳反應程序。

1.9 特異性試驗用建立的ELISA方法檢測抗FAdV-1、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-10、NDV、IBDV、IBV、ARV、AIV-H5、AIV-H9陽性血清，設(shè)陰性對照，判定fiber-1-ELISA方法的特異性。

1.10 敏感性試驗隨機選擇3份FAdV-4陽性血清分別進行1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200稀釋，按ELISA最佳反應程序進行檢測，確定fiber-1-ELISA方法的敏感性。

1.11 重復性試驗隨機選取10份陽性血清，使用同一批次制備的抗原包被板，在3個不同時間檢測，每次設(shè)3個重復孔，進行批內(nèi)重復性試驗；在3個不同批次制備的抗原包被板上，同一時間對樣品進行檢測，進行批間重復性試驗。

1.12 臨床樣品檢測采用fiber1-ELISA方法檢測廣西某雞場采集的12日齡樣品30份，31日齡樣品32份，44日齡樣品31份，22周齡樣品83份，總計176份雞血清樣品進行檢測，分析流行情況。

2 結(jié)果

2.1 fiber-1基因擴增及克隆鑒定結(jié)果PCR擴增后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶大小約1 296 bp，與預期一致(圖1A)，克隆至pET-32a載體后進行雙酶切鑒定，得到1 296，5 866 bp 2個片段(圖1B)。陽性克隆菌送生工測序，測序結(jié)果表明目的基因成功連接至pET-32a載體。

A.fiber-1基因擴增(M.DL2000 DNA Marker；1～4.fiber-1基因擴增產(chǎn)物)；B.pET-32a-fiber-1的雙酶切鑒定(M.DL10000 DNA Marker；1.pET-32a； 2.pET-32a-fiber-1的雙酶切產(chǎn)物)圖1 pET-32a-fiber-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 誘導條件優(yōu)化結(jié)果以不同時間和不同IPTG濃度誘導重組蛋白后，SDS-PAGE電泳，經(jīng)BandScan 4.3軟件分析表明當IPTG終濃度為0.6 mmol/L，37℃誘導4 h時，重組蛋白表達量最高(圖2)。

A.最佳誘導時間篩選(M.蛋白Marker；1.空菌體表達產(chǎn)物；2～8.誘導1，2，3，4，5，6，7 h的表達產(chǎn)物)；B.最佳IPTG濃度篩選(M.蛋白Marker；1.空菌體表達產(chǎn)物；2～7.IPTG濃度0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的表達產(chǎn)物)圖2 pET-32a-fiber-1 蛋白最佳誘導條件篩選

2.3 可溶性分析和純化結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，表達產(chǎn)物主要在沉淀，以包涵體形式表達(圖3A)；純化后，在咪唑終濃度為100 mmol/L的洗脫液洗脫后得到較純且較濃的目的蛋白(圖3B)，經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度為256 mg/L。

A.pET-32a-fiber-1蛋白可溶性鑒定(M.蛋白Marker；1.全菌體；2.誘導菌液上清；3.誘導菌液沉淀)；B.pET-32a-fiber-1蛋白純化結(jié)果(M.蛋白Marker；1.空菌體對照；2.pET-32a-fiber-1純化前；3～7.純化后)圖3 pET-32a-fiber-1 蛋白的SDS-PAGE分析

2.4 Western blot鑒定Western blot檢測結(jié)果顯示，重組蛋白與FAdV-4陽性血清有特異性反應，表明重組蛋白有良好的反應原性(圖4)。

M.蛋白Marker；1.fiber-1蛋白；2.陰性對照圖4 Western blot 鑒定結(jié)果

2.5 fiber-1-ELISA方法的建立

2.5.1抗原最佳包被質(zhì)量濃度、血清最佳稀釋度的確定 經(jīng)過反應條件優(yōu)化，確定當pET-32a-fiber-1重組蛋白包被質(zhì)量濃度為4 mg/L，一抗血清稀釋為1∶200時，P/N值最大。

2.5.2酶標二抗稀釋度、包被條件、封閉時間、一、二抗和顯色時間的確定 經(jīng)試驗得出二抗最佳稀釋度為1∶10 000；抗原最佳包被條件為37℃包被1 h后4℃靜置14 h；最佳封閉時間為60 min；一、二抗最佳作用時間分別為60，30 min；TMB最佳顯色時間為9 min。

2.7 特異性試驗用建立的fiber-1-ELISA方法，檢測FAdV-1、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-10、NDV、IBDV、IBV、ARV、AIV-H5、AIV-H9陽性血清，除FAdV-4、FAdV-10外，其他陽性血清D450 nm值皆低于0.314，表明本試驗建立的方法特異性良好(圖5)。

圖5 fiber-1-ELISA 特異性試驗

2.8 敏感性試驗將隨機選擇的3份陽性血清1∶1 600稀釋后，D450 nm值均大于0.314，仍為陽性。1∶3 200稀釋后，D450 nm值都在臨界值以下(圖6)。

圖6 fiber-1-ELISA敏感性試驗

2.9 重復性試驗該方法批內(nèi)最大變異系數(shù)為7.1%，批間最大變異系數(shù)為6.9%，皆小于10.0%，表明建立的方法具有良好的重復性(表1)。

表1 fiber-1-ELISA批內(nèi)和批間重復性試驗結(jié)果(n=10)

2.10 臨床樣品檢測用本試驗建立的fiber-1-ELISA方法檢測廣西某雞場采集的176份臨床樣品，結(jié)果如表2所示，共檢出陽性樣品75份。

表2 不同日齡雞血清FAdV-4抗體檢測結(jié)果

3 討論

在Ⅰ群禽腺病毒的12個血清型中，F(xiàn)AdV-1與肌胃糜爛(AGE)有關(guān)，F(xiàn)AdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11通常誘發(fā)包涵體肝炎(IBH)，而FAdV-4引起心包積液-肝炎綜合征(HHS)[12]。自2015年以來，HHS在中國山東、河南等多個省份相繼暴發(fā)[13]，2016年3月在廣西地區(qū)有疑似病例出現(xiàn)，發(fā)病急，死亡率高，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重威脅[14]。建立一種能快速特異性檢測FAdV4抗體的ELISA方法是十分必要的。

既往研究中，PAN等[15]使用高純度和高濃度的FAdV-4病毒粒子作為包被抗原，建立了通用ELISA方法，無法特異性檢測FAdV-4；許多以重組hexon蛋白為包被抗原的ELISA檢測方法也未說明能夠區(qū)分禽腺病毒的其他血清型[16-17]。相比之下，fiber蛋白作為診斷抗原在敏感性和特異性上更佳。梅楠等[18]以重組fiber-2蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法，與FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8、FAdV-9和FAdV-11無交叉反應。HAO等[19]基于FAdV-8的fiber蛋白建立了特異性檢測FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b的ELISA方法，與其他型無交叉反應。本試驗以重組fiber-1蛋白為包被抗原，建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法，只與FAdV-4與FAdV-10發(fā)生特異性反應，不與其他常見禽病的陽性血清反應，也不與FAdV-1和FAdV-8a抗體發(fā)生交叉反應。fiber-1-ELISA方法與FAdV-10發(fā)生反應的原因可能是同屬于禽腺病毒C種，同源性高，序列差異小，具有相同的抗原表位，該結(jié)果與SHAO等[20]報道的一致。

fiber蛋白在病毒感染和發(fā)病機制中起著重要作用，被證明具有良好的免疫保護效果，也可以將FAdV-4與其他血清型的禽腺病毒區(qū)分開來[21-24]。本試驗成功構(gòu)建了pET-32a-fiber-1重組質(zhì)粒，獲得了高效表達的fiber-1重組蛋白。不同IPTG濃度誘導的蛋白量差別不大，肉眼較難區(qū)分，但未用IPTG誘導的表達量明顯較低，可見IPTG的誘導作用顯著。表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，原因可能是37℃條件下蛋白表達量過高，合成速度太快，沒有足夠時間折疊。本試驗采用梯度洗脫的方法得到了理想純度的蛋白，透析復性效果也較好。Western blot結(jié)果顯示fiber-1重組蛋白具有較好的反應原性，可作為檢測抗原。本試驗表達的重組蛋白也可以用于制備單克隆抗體，進行更多關(guān)于fiber-1蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能研究。

FENG等[25]研究發(fā)現(xiàn)FAdV-4對雞的致病性表現(xiàn)出年齡相關(guān)性，小于59日齡的雞表現(xiàn)出100%的發(fā)病率和死亡率，而180日齡的雞仍然會感染，但致病性顯著降低。本試驗檢測了不同日齡的176份血清樣品，12日齡30份樣品皆為陰性，31日齡陽性率為37.5%，44日齡樣品中陽性率為58.0%，表明該雞場低日齡雞群中存在腺病毒感染，應加強防控。

綜上所述，本試驗成功在大腸桿菌中表達并純化了fiber-1重組蛋白，并建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法，該方法特異性強，敏感性高，重復性好，可應用于檢測臨床樣品，進行免疫后抗體水平監(jiān)測，評估免疫效果，為HHS的防控提供技術(shù)支持。