非洲豬瘟CD2v截短蛋白的原核表達及間接ELISA方法的建立

胡巧云,黃小久，唐小明，何世成，林 源，彭 志，石 建，王衛(wèi)國，劉道新，王昌建* (.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長沙 4004；．湖南中凈生物科技有限公司，湖南 長沙 40600)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，以毒力強、病程短、傳染迅速、發(fā)病率及致死率高為特征。自1921 年肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)ASF以來，該病毒一直在非洲大陸流行，2007—2017年逐漸擴散到歐洲國家[2]。2018年該病毒傳入我國，在國內(nèi)迅速傳播開來，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成非常慘重的經(jīng)濟損失[3]。目前，ASF已成為國內(nèi)豬病危害最為嚴(yán)重的疫病。

ASFV是一種蟲媒DNA病毒，是黃病毒科的唯一成員，基因組為170～193 kb，有151～167個讀碼框(open reading frames，ORFs)，編碼約54種結(jié)構(gòu)蛋白和超過100種非結(jié)構(gòu)蛋白。目前ASFV有24個基因型和8個血清型，我國的流行毒株屬于基因Ⅱ型和血清8型[4]。由于ASF的防控尚沒有有效的藥物及安全的疫苗，一直以生物安全防控為主，采取檢測加清除策略。目前OIE推薦的病原檢測方法包括PCR和熒光定量PCR，推薦的抗體檢測是ELISA方法進行抗體初篩，輔助以其他方法證實如免疫印跡試驗(IBT)、間接免疫熒光抗體試驗(IFA)和間接免疫酶試驗(IPT)，目前國內(nèi)基本上以熒光定量PCR核酸檢測方法為主[5-6]。隨著ASF在豬群循環(huán)2年多來，疫情發(fā)展趨勢變緩，出現(xiàn)感染潛伏期長，病程長，死亡率降低的現(xiàn)象，且感染早期不易檢測到[7]。當(dāng)豬群被弱毒株感染時，由于攜帶病毒時間長、排毒量低，依賴熒光定量PCR方法極有可能檢測不出，臨床ASF病原檢測需結(jié)合評估群體抗體水平來判斷群體感染情況[5]。

CD2v蛋白是ASFV的外膜蛋白，由EP402R基因編碼。由于該蛋白類似于T淋巴細(xì)胞表面受體CD2而得名，由信號肽序列和1個跨膜區(qū)組成，含有2個免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域。在感染過程中，CD2v蛋白與豬紅細(xì)胞表面的CD2受體發(fā)生特異性結(jié)合，介導(dǎo)ASFV粒子吸附在豬的紅細(xì)胞表面[8]，在病毒黏附和免疫逃避中起作用。ASFV Georgia株缺失CD2v基因后，感染豬對發(fā)病和毒血癥無明顯影響[9]。而我國近期分子流行病學(xué)報道顯示，臨床上出現(xiàn)了由于CD2v自然變異失去紅細(xì)胞吸附能力，攻毒試驗發(fā)現(xiàn)這些病毒均為弱毒，潛伏期長，致豬群的死亡率下降[10-11]。鑒于目前臨床流行毒株復(fù)雜情況，為更好的了解ASF的流行趨勢，適應(yīng)當(dāng)下的防控形勢，建立快速、特異性強和靈敏度高的ASFV診斷方法對于有效控制疫情，準(zhǔn)確鑒別、鑒定尤顯重要。

本研究用原核表達ASFV CD2v蛋白胞外區(qū)段作為包被抗原，建立了間接ELISA檢測方法，并評估了其特異性、敏感性和重復(fù)性，且與目前商品化的試劑盒做了比較，為ASF的檢測和防控提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料ASF陰性血清由本實驗室保存，為我國ASF發(fā)生以前的健康豬血清；豬藍(lán)耳病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、偽狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)和豬圓環(huán)病毒(PCV)等陽性血清由本實驗室保存；用于CD2v抗體檢測及敏感性試驗的ASFV陽性感染血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；大腸桿菌BL21(DE3)PLys感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker、彩虹180光譜蛋白Marker購自Solarbio公司；羊抗豬的HRP-IgG購自美國Jackson Immuno Research公司；PVDF膜購自Millipore 公司產(chǎn)品；ELISA所用底物、脫脂奶粉購自生工生物工程(上海)公司；超級ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo Scientific公司。2個國產(chǎn)試劑盒(國產(chǎn)1、國產(chǎn)2)來自大型診斷試劑公司，2個進口試劑盒(進口1、進口2)分別購自俄羅斯LJ公司和法國IDV公司。

1.2 CD2v蛋白的序列分析、預(yù)測及載體構(gòu)建以ASFV的HLJ18株基因組序列(MK333180)為參考，該病毒株CD2v蛋白有360個氨基酸，根據(jù)TMHMM軟件分析該蛋白的跨膜區(qū)段，以及Singal P 5.0分析該基因的信號肽疏水區(qū)域，預(yù)測結(jié)果為氨基酸1～206位為蛋白膜外結(jié)構(gòu)，氨基酸207～229位為蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，氨基酸230～360位為蛋白的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)，其中1～15位氨基酸為信號肽區(qū)域。因而選擇蛋白的胞外結(jié)構(gòu)即16～206的氨基酸序列表達截短的CD2v蛋白。序列經(jīng)大腸桿菌表達系統(tǒng)密碼子優(yōu)化后，兩端加入酶切位點BamHⅠ/XhoⅠ，連接至pET28a載體上，構(gòu)建表達載體命名為pET28a-CD2v。序列由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 重組蛋白的表達、純化與Western blot鑒定將測序正確的重組載體pET28a-CD2v質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，構(gòu)建菌株pET28a-CD2v/BL21(DE3)pLysS，用于蛋白的表達與純化。將含有重組質(zhì)粒的表達菌株過夜培養(yǎng)液，以1∶100接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)，至D600 nm值為0.6～0.8時，加入0.8 mol/L的IPTG誘導(dǎo)，37℃ 繼續(xù)搖床培養(yǎng)3 h。收集誘導(dǎo)的菌體進行SDS-PAGE鑒定其表達的情況。使用超聲波破碎的菌體，使用蛋白純化試劑盒(生工生物工程(上海)公司)按照說明書進行純化，用5 mmol/L的咪唑平衡層析柱，40 mmo/L的咪唑洗滌雜蛋白，用250 mmol/L 咪唑洗脫目的蛋白，純化后的蛋白用3M超濾離心管濃縮，用0.1 mol/L的PBS為緩沖液。

誘導(dǎo)后的pET28a/BL21(DE3)pLysS以及純化后的蛋白制作樣品后，進行SDS-PAGE電泳。將電泳產(chǎn)物使用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，與1∶200稀釋的ASF陽性血清室溫反應(yīng)1 h后，洗滌并加1∶50 000 稀釋的羊抗豬HRP-IgG室溫反應(yīng)1 h，再與ECL發(fā)光液反應(yīng)后在化學(xué)發(fā)光成像儀上觀察特異性條帶并拍照。

1.4 抗原和血清最佳稀釋度的確定在96孔ELISA板上，將抗原按照2倍倍比稀釋自上至下包被，陰、陽性血清自左至右2倍倍比稀釋，抗原的包被質(zhì)量濃度依次為100.000，50.000，25.000，12.500，6.250，3.125，1.563 μg/L；陰、陽性血清稀釋度為依次1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800。根據(jù)陽性血清D450 nm值(P)和陰性血清D450 nm值(N)的比值即P/N值篩選最佳抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度。確定抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度后，對羊抗豬HRP-IgG稀釋度1∶50 000，1∶100 000，1∶200 000，底物顯色時間5，10，15，20 min等條件進行優(yōu)化，最終確定間接ELISA的反應(yīng)條件。

1.6 特異性、敏感性和重復(fù)性試驗選取PRRSV、CSFV、PRV(gI)、PRV(gb)、FMDV陽性血清各5份，并設(shè)置ASFV陰、陽性血清對照，用本試驗優(yōu)化的間接ELISA方法進行檢測，以評價所建立ELISA方法的特異性。

將ASFV陽性血清按照2倍倍比稀釋(1∶4 ～1∶2 048)，CD2v-ELISA的檢測血清稀釋倍數(shù)為100，因而陽性血清最終稀釋倍數(shù)為1∶400 ～ 1∶204 800。同時利用其他ASF抗體檢測試劑盒(國產(chǎn)1、國產(chǎn)2、進口1、進口2)分別檢測，試劑盒檢測的血清稀釋倍數(shù)依次為100，50，20，20，對檢測陽性的血清最大稀釋倍數(shù)進行比較，評估所建立的方法的敏感性。

用同一批次包被的酶標(biāo)板檢測6份血清，每個血清6次重復(fù)，計算其變異系數(shù)(CV)以評價所建立的ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性；用3個不同批次包被的酶標(biāo)板檢測6份血清，每份血清重復(fù)3個孔，計算其變異系數(shù)(CV)以評價所建立ELISA方法的批間重復(fù)性。

1.7 CD2v-ELISA臨床樣本的檢測應(yīng)用本研究建立的CD2v-ELISA方法檢測來自ASFV監(jiān)測陽性的養(yǎng)殖場收集的血清154份，評估該建立的方法臨床應(yīng)用的效果。將檢測結(jié)果與來自4個ASF ELISA抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果進行比較，計算該方法與其他方法的結(jié)果符合率。

2 結(jié)果

2.1 CD2v蛋白表達純化及鑒定結(jié)果將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3)plyS中，獲得重組菌CD2v-ELISA/BL21(DE3)pLysS。挑取單菌落，IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)超聲波破碎菌體，獲得上清和沉淀，取上清過鎳柱純化。經(jīng)過SDS-PAGE膠電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的重組菌在略小于25 kDa處有目的條帶，表達量較高，與預(yù)期相符合。表達蛋白在上清液和包涵體中都有目的條帶，主要存在于上清液中。純化后的蛋白可以見到與目的蛋白大小一致的單一條帶，說明獲得純度較高的目標(biāo)蛋白。對純化的蛋白進行Western blot鑒定，目的蛋白處有特異條帶，說明表達及純化的蛋白具有跟血清中特異性抗體反應(yīng)的能力(圖1)。

M.蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的pET28a-CD2v/BL21(DE3)pLysS;2.誘導(dǎo)的pET28a-CD2v/BL21(DE3)pLysS;3.純化后的CD2v蛋白圖1 CD2v蛋白誘導(dǎo)表達SDS-PAGE(A)及Western blot 分析(B)

2.2 ELISA方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化優(yōu)化確定抗原包被質(zhì)量濃度和血清的最佳稀釋倍數(shù)，結(jié)果抗原包被最佳質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，血清稀釋倍數(shù)為1∶100時，P/N值最大。根據(jù)P/N值選擇羊抗豬HRP-IgG最佳的工作濃度為1∶100 000，底物顯色時間為10 min。優(yōu)化后的反應(yīng)條件見表1。

表1 CD2v-ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

圖2 陰性樣品結(jié)果正態(tài)分布圖

2.4 ELISA方法的特異性用建立的方法對PRRSV、CSFV、PRV(gE)、PRV(gb)、FMDV、PCV陽性血清各5份進行檢測，結(jié)果均為陰性，表明用CD2v蛋白建立的ELISA方法特異性良好(表2)。

表2 CD2v-ELISA的特異性試驗結(jié)果

2.5 ELISA方法的敏感性血清按照2倍倍比稀釋，CD2v-ELISA能檢測血清稀釋度為1∶12 800，說明該方法的檢測敏感性較高(表3)。與其他試劑盒敏感性比較，建立的ELISA方法低于試劑盒國產(chǎn)1、國產(chǎn)2和進口2，高于進口1(表4)。

表3 CD2v-ELISA的陽性血清敏感性試驗

表4 CD2v-ELISA與商品化試劑盒敏感性比較

2.6 方法的重復(fù)性批間重復(fù)性試驗用3個不同批次的抗原包被ELISA板，檢測6份臨床血清，每份血清重復(fù)3孔；批內(nèi)重復(fù)試驗用同一批CD2v蛋白包被的酶標(biāo)板，6份血清進行檢測，重復(fù)3孔。批間、批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)分別為5.23%～7.38%和2.46%～8.98%，兩者均小于10.00%(表5)，說明所建立的方法具有較好的重復(fù)性。

表5 CD2v-ELISA重復(fù)性試驗

2.7 CD2v-ELISA方法臨床樣品檢測結(jié)果采用建立的CD2v-ELISA方法對154份臨床血清進行了檢測，結(jié)果有74份陽性樣品，陽性率為48.05%。采用商品化試劑盒國產(chǎn)1、國產(chǎn)2、進口1和進口2 的檢測樣品陽性結(jié)果分別為77，77，64，82份，樣品陽性率分別為50.00%，50.00%，41.56%，53.25%。本研究建立的ASFV CD2v抗體ELISA檢測方法和2個國產(chǎn)ASF抗體檢測試劑盒，符合率為94.16% 和95.45%，與進口品牌ASF抗體檢測試劑盒相比符合率為88.13%和93.15%，說明所建立的方法與現(xiàn)有的試劑盒有較高的符合率(表6)。

表6 CD2v-ELISA與其他4種試劑盒對比符合率結(jié)果 %

3 討論

ASF自2018年傳入我國后，在國內(nèi)不斷蔓延和變異，豬群臨床疫病情況日趨復(fù)雜，為更好地了解豬群臨床疫病發(fā)展形勢，ASF的檢測需要結(jié)合臨床抗體結(jié)果。本研究利用生物軟件分析CD2v的跨膜區(qū)，表達了截短的CD2v重組蛋白作為包被抗原，獲得了純度較高的CD2v重組蛋白。且通過優(yōu)化包被抗原的濃度、血清稀釋倍數(shù)及對反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功建立了敏感、特異和穩(wěn)定的血清CD2v抗體的ELISA檢測方法。

CD2v蛋白在ASFV BA71V感染的細(xì)胞中可檢測到3種形式的表達，分別為89 kDa的全長糖基化蛋白，及約為63 kDa的N末端糖基化片段和約為26 kDa的C末端非糖基化片段[12]。CD2v 是在感染過程中誘導(dǎo)表達的，是ASFV感染晚期表達蛋白，在未感染的細(xì)胞中并不能檢測到CD2v的存在[12]。在感染Vero細(xì)胞的ASFV粒子蛋白質(zhì)組分析中，檢測到CD2v蛋白豐度較低，而核殼蛋白PP220、PP62及其衍生物和衣殼蛋白P72占據(jù)蛋白總量的2/3[13]。盡管CD2v蛋白占據(jù)ASFV蛋白總量不多，CD2v蛋白在ASF的感染過程中上調(diào)表達，被認(rèn)為可以識別細(xì)胞因子AP-1 從而增強病毒的感染性[14]。因而，有可能通過檢測CD2v血清抗體，來判斷ASF的感染。本研究使用原核表達的CD2v胞外區(qū)段蛋白，較為幸運地獲得了該蛋白在上清中的表達，使得后續(xù)的蛋白純化更為容易。該蛋白能很好的與感染血清抗體反應(yīng)，證實了原核表達CD2v蛋白的胞外區(qū)段與血清抗體有較好的結(jié)合能力，進而可以進一步使用該蛋白建立ELISA抗體檢測方法。

常用于ASF抗體檢測的結(jié)構(gòu)蛋白有P30、P54和P72。衣殼蛋白P72 是第1個被鑒定的病毒蛋白，能在感染動物中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，還有P30和P54也被鑒定為強免疫原性的蛋白，檢測這3種蛋白的抗體也是目前商品化ASF檢測試劑盒最常采用的策略[15]。本研究建立的ELISA檢測CD2v蛋白抗體，其敏感性稍低于檢測結(jié)構(gòu)蛋白P30、P54和P72蛋白抗體的試劑盒，可能是由于感染血清中CD2v蛋白抗體的豐度稍低于早期表達蛋白P30、P54和P72蛋白抗體。應(yīng)用該方法檢測臨床感染血清，檢測結(jié)果與國產(chǎn)及進口試劑盒相比，具有相對較高的符合率，說明CD2v抗體在感染血清中也具有較高的豐度，該蛋白具有檢測的應(yīng)用價值，建立的方法可以應(yīng)用于臨床樣品的檢測。

CD2v蛋白是ASF疫苗研究的重要候選蛋白，CD2v亞單位疫苗或聯(lián)合其他蛋白的亞單位疫苗、重組載體疫苗、基因缺失疫苗都具有一定的保護作用[16-17]。因而也有必要建立ASF CD2v蛋白的抗體檢測方法，為日后可能的疫苗應(yīng)用做好技術(shù)儲備。本研究成功建立了CD2v抗體ELISA方法，在臨床血清應(yīng)用中與已有的ASF抗體檢測試劑盒有較好的符合率。在臨床日益復(fù)雜的情況下，檢測CD2v抗體為了解臨床發(fā)病情況和ASF綜合防控提供更多的數(shù)據(jù)依據(jù)和新的技術(shù)手段。