圓柏大痣小蜂幼蟲齡期測定

呂 東，趙 祜，趙興鵬，趙 明，趙國生，王藝林，劉 瑩，陳 敏*，王光宇*

(1. 甘肅省祁連山水源涵養(yǎng)林研究院,甘肅張掖 734000 ； 2.北京林業(yè)大學林木有害生物防治北京市重點實驗室，北京 100083)

圓柏大痣小蜂MegastigmussabinaeXuetHe是膜翅目Hymenoptera大痣小蜂科Megastigmidae大痣小蜂屬Megastigmus的寡食性害蟲(徐志宏和何俊華, 1989; 李孟樓, 2002; Petretal., 2017)。幼蟲以祁連圓柏SabinaprzewalskiiKom.種仁為食，并與球果的生長發(fā)育同步，其生活史大部分時間都在球果種仁內為害，具有隱蔽性且不易觀察。該蜂在肅南縣境內植株果實蟲害率高達100%，其他地方的果實蟲害率也達到90%以上，分布于整個祁連山林區(qū)，危害面積達16 567 hm2。近年來，由于圓柏大痣小蜂種群的自然擴張和人為種苗運輸，在西藏自治區(qū)中部的熱振國家森林公園的大果圓柏JuniperustabeticaKom.種仁內也發(fā)現(xiàn)圓柏大痣小蜂為害(索南措等, 2020)。關于圓柏大痣小蜂幼蟲蟲齡劃分及測定方面的研究未見報道，明確其幼蟲各發(fā)育階段的特征，有利于準確了解圓柏大痣小蜂幼蟲的發(fā)育情況并開展相應的防治措施。

Dyar(1890)通過總結27種鱗翅目幼蟲齡期的研究發(fā)現(xiàn)，大部分鱗翅目幼蟲的頭寬在每次成功蛻皮后都呈有規(guī)律的幾何式增長，稱作Dyar氏法則，并認為骨化結構會在幼蟲蛻皮的過程中有規(guī)律地增長，可作為分齡過程中的可靠指標。在一些天牛的幼蟲中，非骨化指標也可被用來劃分幼蟲齡期，如氣門長(寬)、剛毛數(shù)、體寬及體長等(黎保清等, 2012; 王小藝等, 2012; 潘龍等, 2015)。

本研究通過測定自然條件下圓柏大痣小蜂幼蟲上顎關節(jié)寬、頭寬、體寬和體長4項指標，并結合頻次分布等方法確定幼蟲的齡數(shù)及齡期，為進一步明確圓柏大痣小蜂的生物學特性及該害蟲的合理防治提供理論基礎，同時也為野外調查和快速判斷幼蟲蟲齡提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

圓柏大痣小蜂的幼蟲和蛹均通過解剖祁連圓柏球果獲得，祁連圓柏受害果采集于甘肅省張掖市肅南裕固族自治縣頭灘地區(qū)的祁連圓柏林(海拔2 700 m)。采集日期自2019年6月16起至2020年5月15日結束，開始的兩個半月(6月16日-8月27日)大約每半個月采集一次，其余各齡幼蟲間隔約1個月，于樣地采集球果至實驗室解剖獲得。為準確獲取1齡幼蟲，在圓柏大痣小蜂成蟲羽化中期摘取1年生祁連圓柏球果，于實驗室常溫條件保存，每天解剖觀察幼蟲是否孵化。幼蟲解剖后先置于75%酒精中浸泡麻痹后轉移至0.1 M，pH 7.4 PBS緩沖液中保存待測。

1.2 幼蟲形態(tài)指標的測定與齡期劃分方法

幼蟲各齡期測量指標均利用Leica M205 FA體視顯微鏡獲取。測量共選擇圓柏大痣小蜂幼蟲的4個形態(tài)指標：上顎關節(jié)寬-Y1(上顎兩側最寬處距離)；頭寬-Y2(頭兩側最寬處距離)；體寬-Y3(第6體節(jié)寬)和體長-Y4(頭至體末長)，如圖1所示。

圖1 圓柏大痣小蜂幼蟲蟲齡劃分的4個測量指標Fig.1 Four variables measured for separating instars of Megastigmus sabinae larvae注：Y1，上顎關節(jié)寬；Y2，頭寬；Y3，體寬；Y4，體長。Note: Y1, Mandible joint width; Y2, Head width; Y3, Body width; Y4, Body length.

用Origin 2018繪制圓柏大痣小蜂幼蟲的各項測量指標的頻次分布圖，初步確認幼蟲齡數(shù)。根據(jù)分齡結果計算主要指標的平均值、標準差、變異系數(shù)、Crosby指數(shù)等。當變異系數(shù)<20%、Crosby指數(shù)<10%時，分齡準確，該指標符合要求(Craig, 1975)。生長率和Crosby指數(shù)按如下公式計算(王小藝等, 2005)。最后根據(jù)Dyar氏法則，利用SPSS 23.0中的回歸分析對幼蟲不同指標的生長曲線進行擬合。

式中G為生長率(growth rate)，即Dyar氏指數(shù)，也稱Brooks指數(shù)(Loerch and Cameron, 1983)。xn和xn-1為相鄰兩齡幼蟲分齡指標。Cn為Crosby指數(shù)，Gn和Gn-1為相鄰兩齡幼蟲的生長率。

獲得各齡期指標的范圍后，選擇頻數(shù)分布重疊程度最小的指標，以各齡期第一次測定的時間為各齡幼蟲的齡期開始時間，作圖觀察幼蟲不同時間上顎關節(jié)寬大小，以估算各齡幼蟲的齡期(根據(jù)全年調查的圓柏大痣小蜂生活史情況，5齡幼蟲以至化蛹初期的時間為準)。

2 結果與分析

2.1 圓柏大痣小蜂幼蟲齡數(shù)劃分

通過測量625頭圓柏大痣小蜂幼蟲的4項指標，并分別繪制頻數(shù)分布圖，結果表明：上顎關節(jié)寬、頭寬和體寬3個指標的頻數(shù)分布均具有明顯的5個峰值，而體長指標對齡期劃分不明顯。其中，上顎關節(jié)寬的峰值分別在0.116、0.148、0.188、0.212和0.236 mm；頭寬的峰值分別為0.250、0.350、0.460、0.580和0.710 mm；體寬的峰值分別為0.525、0.700、0.975、1.375和1.700 mm。根據(jù)Dyar氏法則初步判斷圓柏大痣小蜂幼蟲的齡數(shù)為5齡。

在測量的4個指標中，上顎關節(jié)寬的頻次分布圖出現(xiàn)的峰值最為明顯，且5個峰的重疊度相對較小。頭寬與體寬的頻次分布圖也出現(xiàn)了5個明顯的峰，也可以作為齡期劃分的形態(tài)指標，但這兩個指標為非骨化結構，受營養(yǎng)條件、環(huán)境等因素的影響較大，相鄰齡期重疊程度較高。對各齡幼蟲的上顎關節(jié)寬、頭寬和體寬進行處理的各項結果顯示，這3項分齡指標在不同齡數(shù)之間的各項指標均值均具有顯著差異且變異系數(shù)均小于20%，Crosby指數(shù)均小于10%，幼蟲生長率在1.1～1.4之間。因此圓柏大痣小蜂幼蟲被劃分為5個齡期(表1)。

圖2 圓柏大痣小蜂幼蟲頻次分布圖Fig.2 Frequency distribution of Megastigmus sabinae larvae

2.2 圓柏大痣小蜂幼蟲齡期

在測定結果中，上顎關節(jié)寬的頻數(shù)分布重疊程度最小，因此以上顎關節(jié)寬作為估算各齡期時間的最佳標準。已知各齡幼蟲上顎關節(jié)寬的范圍，將每次采樣時測得的幼蟲上顎關節(jié)寬數(shù)據(jù)作圖(圖3)，以各齡期第一次采樣的時間為幼蟲的脫皮時間(5齡幼蟲至化蛹初期為準)估算各齡期時間。1～5齡幼蟲分別為30、200、30、30、15 d，共305 d，主要以2齡幼蟲越冬，極少數(shù)以1齡、3齡幼蟲越冬。幼蟲于次年3月中旬開始發(fā)育，4月中旬發(fā)育至3齡，經(jīng)2次蛻皮于6月中下旬化蛹。

圖3 圓柏大痣小蜂幼蟲齡期時間劃分圖Fig.3 Time division of Megastigmus sabinae larvae instar

3 結論與討論

目前，劃分和確定幼蟲種群齡期主要通過室內個體飼養(yǎng)測定和自然界的種群眾數(shù)齡期測定兩種方法，由于幼蟲的生存條件不同，兩者之間所測定的幼蟲齡期往往存在一定差異(戴志一, 1980)，前者主要適用于鱗翅目及部分膜翅目等食葉幼蟲的齡期結構(王建偉, 2011)。由于不同科屬間幼蟲骨化程度較高的部位有差別，因此在測量不同幼蟲中選擇的指標也略有不同，如鞘翅目天?？朴紫x通常選擇頭殼、前胸背板、上顎等部位的指標作為分齡的依據(jù)(王小藝等, 2012; 任驥, 2014)；鱗翅目幼蟲通常選擇頭殼、上顎、復眼間距及體長(寬)等指標(楊美紅等, 2012; 陳琪等, 2015; 孫玉劍等, 2018)；膜翅目幼蟲則大多選擇頭殼寬、上顎長(寬)、體長(寬)等指標(范麗清, 2008; 劉長月等, 2011)，另外，還可通過測定膜翅目幼蟲的尾鋏長(寬)來進行劃分(閆家河等, 2020)。這些生長指標的測量值反映了幼蟲不同階段的生長情況，同時也能夠反映出齡期劃分的合理性。

李秉新等(1991)在描述圓柏大痣小蜂生活習性的時曾提到過圓柏大痣小蜂幼蟲分為5齡，但并未介紹各蟲齡的具體判斷方法。本研究通過測量圓柏大痣小蜂幼蟲上顎關節(jié)寬、頭寬、體寬和體長4項指標，并計算這4項指標的均值、標準誤差、變異系數(shù)、Brooks指數(shù)和Crosby指數(shù)，將幼蟲劃分為5齡。通過對各項分齡指標的平均值進行指數(shù)擬合，發(fā)現(xiàn)上顎關節(jié)寬、頭寬與體寬這3項指標與齡數(shù)間的關系均符合Dyar氏法則，且均可以解釋種群90%以上的個體發(fā)育情況，進一步表明圓柏大痣小蜂幼蟲劃分為5齡是準確的，上顎關節(jié)寬為最理想的分齡指標。在對體長的劃分時發(fā)現(xiàn)齡期劃分不明顯，且重疊度較高，因此不宜用于幼蟲齡數(shù)的劃分。另外，由于上顎關節(jié)寬度較小，野外調查和室內研究中通過測量上顎關節(jié)寬來判斷幼蟲齡期較為困難，因此，可參考圓柏大痣小蜂幼蟲各齡期的頭寬與體寬測量范圍(表1)來進行快速判斷。

根據(jù)調查與分析結果估算幼蟲總共歷期為305 d，1～5齡幼蟲的各齡時間分別為30、200、30、30、15 d。吳洪源等(1992)認為圓柏大痣小蜂主要以3齡幼蟲越冬，本研究通過結合上顎關節(jié)寬對齡期的劃分與調查時間來進行判斷，認為圓柏大痣小蜂越冬時的蟲齡主要為2齡而并非3齡。

本研究明確了圓柏大痣小蜂的幼蟲齡期數(shù)和最佳分齡指標，同時獲得各齡期上顎關節(jié)寬、頭寬、體寬3項指標的范圍值，為進一步開展該害蟲的生物學生態(tài)學、防控技術等研究提供指導。