可溶性淋巴細(xì)胞活化基因-3、α-突觸核蛋白水平對帕金森病診斷效能的臨床研究

錢小娟，蔣森，蔡倩，劉娜，張楊，楊新玲

帕金森病(PD)是一種常見的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，是目前嚴(yán)重危害國民健康和生活質(zhì)量的疾病之一[1]。PD主要的病理學(xué)特征為黑質(zhì)中路易小體(LBs)的積累和攜帶LBs的多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，LBs是存活于神經(jīng)元中的嗜酸性包涵體，富含多種蛋白，包括α-突觸核蛋白(α-syn)、Parkin蛋白、泛素等，其中α-syn是其最重要的成分。盡管許多遺傳和環(huán)境因素與PD的發(fā)展有關(guān)，但疾病的確切病因目前尚不清楚。越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)免疫炎癥及α-syn聚集體在神經(jīng)元間傳遞可能共同參與了PD的進(jìn)展[2]。淋巴細(xì)胞活化基因-3(LAG-3)是一種α-syn特異性膜蛋白受體，可與細(xì)胞外病理性α-syn結(jié)合，參與α-syn的內(nèi)吞和促進(jìn)α-syn傳遞，且加速了病理性α-syn誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷和神經(jīng)毒性的形成?？扇苄訪AG-3(sLAG-3)是成熟LAG-3裂解的產(chǎn)物，被認(rèn)為是輔助T細(xì)胞活性的重要指標(biāo)，一定程度可反映CNS的炎癥活動，在CSF和外周血中能穩(wěn)定表達(dá)[2-3]。更多的研究專注于探索新的生物學(xué)標(biāo)志物，如α-syn、多巴胺代謝物、促炎因子、miR-221等，然而臨床上仍缺乏診斷價值較高且能有效地用于PD診斷和預(yù)測疾病進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)記物[4]。

本研究探討了PD組與對照組中血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn表達(dá)水平的差異，分析了血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn與PD臨床癥狀及疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，研究了血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn對PD患者的診斷效能和血清sLAG-3與血漿和紅細(xì)胞α-syn的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2020年12月至2021年4月于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的47例PD患者作為PD組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師診斷、符合英國PD腦庫的原發(fā)性PD診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)患者能夠提供詳細(xì)真實的臨床資料并完成相關(guān)量表的測評。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)帕金森綜合征；(2)嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙不能配合檢查患者及合并腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及急慢性感染的患者。選取本院門診同期年齡、性別與PD患者相匹配的36名健康體檢者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無PD和PD家族史。(2)無其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：不能配合檢查患者及合并腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及急慢性感染患者。本研究所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 所有受試者均由專業(yè)神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師采集其病史和人口學(xué)資料，包括年齡、性別、吸煙飲酒史、慢性病史、Hoehn-Yahr(H-Y)分級、統(tǒng)一PD評分量表(UPDRS)、PD非運(yùn)動癥狀評價量表 (NMSS)及病程等。

1.2.2 sLAG3水平檢測 清晨抽取所有受試者空腹肘靜脈血4 ml，采用離心機(jī)以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，移取上清液至EP管，放-80 ℃冰箱保存。相關(guān)檢測均嚴(yán)格遵循對應(yīng)試劑盒的操作指南進(jìn)行，每個樣本做兩個復(fù)孔,最終數(shù)據(jù)取均值。

1.2.3 血漿和紅細(xì)胞α-syn水平檢測 用含有抗凝劑的抽取所有受試者空腹肘靜脈血4 ml，采用離心機(jī)以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血漿和紅細(xì)胞，分別置于EP管，放-80 ℃冰箱保存。采用ELISA檢測血漿和紅細(xì)胞α-syn水平。相關(guān)檢測均嚴(yán)格遵循對應(yīng)試劑盒的操作指南進(jìn)行，每個樣本做兩個復(fù)孔,最終數(shù)據(jù)取均值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般臨床資料及檢測指標(biāo)比較 見表1。

表1 一般臨床資料的比較[x±s,例(%),M(Q25,Q75)]資料PD組(n=47)對照組(n=36)t/Z/χ2值P值年齡(歲)64.98±10.9762.25±9.461.1910.237男性20(42.6)19(52.8)0.8560.355糖尿病5(10.6)6(16.7)0.6440.442高血壓14(29.8)11(30.6)0.0060.940吸煙9(19.1)6(16.7)0.8500.771飲酒5(10.6)7(19.4)1.2780.258sLAG3(ng/mL)0.94(0.78,1.04)0.72(0.55,0.85)-5.023<0.001 紅細(xì)胞α-syn(ng/mL)61.15(59.67,61.06)48.61(42.06,55.34)-6.584<0.001血漿α-syn(ng/mL)30.20(26.92,33.41)22.66(19.70,26.57)-6.469<0.001

兩組年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒史比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與對照組比較，PD組血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平與PD臨床特征的相關(guān)性分析 見表2。在PD組中，行Spearman相關(guān)分析顯示，血清sLAG-3水平與性別(R=0.421,P=0.003)和NMSS(R=0.323,P=0.027)相關(guān)，而與病程、H-Y分級、UPDRS Ⅲ、NMSS總分不相關(guān)(均P>0.05)。紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn水平與性別、病程、H-Y分期、UPDRS Ⅲ、NMSS總分均不相關(guān)(均P>0.05)。

表2 sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平與PD臨床特征的相關(guān)性分析血清sLAG-3RP值血漿α-synRP值紅細(xì)胞α-synRP值性別0.4210.003-0.0270.8570.0100.949病程-0.0020.988-0.2260.127-0.0200.895H-Y分期-0.0160.915-0.0320.829-0.0710.636UPDRSⅢ0.0270.858-0.1360.362-0.1950.189NMSS0.3230.027-0.2670.0700.0350.814

2.3 ROC曲線分析血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平對PD發(fā)病的診斷價值 見圖1、表3。將血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平作為檢驗變量，將PD和對照分組作為狀態(tài)變量制作ROC曲線，血清sLAG-3水平診斷PD的曲線下面積為0.822(95%CI：0.735～0.909)，敏感度61.7%、特異度86.1%。紅細(xì)胞α-syn水平診斷PD的曲線下面積為0.923(95%CI：0.871～0.976)，敏感度83.0%、特異度83.3%。血漿α-syn水平診斷PD的曲線下面積為0.916(95%CI：0.860～0.972)，敏感度為97.7%、特異度為66.7%。

圖1 sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平對PD診斷價值的ROC曲線

表3 ROC曲線分析血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平對PD發(fā)病的診斷價值變量ROC曲線下面積約登指數(shù)敏感度特異度sLAG-30.822(0.735～0.909)0.48361.7%86.1%紅細(xì)胞α-syn0.923(0.871～0.976)0.66383.0%83.3%血漿α-syn0.916(0.860～0.972)0.66797.7%66.7%

2.4 不同濃度sLAG-3分組中sLAG3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn表達(dá)水平的比較 見表4。根據(jù)sLAG-3水平ROC曲線取sLAG3最佳截斷值0.885 ng/ml，將所有受試者重新分組：高sLAG-3組和低sLAG-3組，比較兩組sLAG3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn表達(dá)水平的差異。高sLAG-3組中sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn表達(dá)水平均明顯高于低sLAG-3組水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 高sLAG-3組和低sLAG-3組sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn、血漿α-syn水平的比較[M(Q25,Q75),x±s]組別LAG-3紅細(xì)胞α-syn血漿α-syn低sLAG-3組(n=49)0.71(0.59,0.80)53.40±10.2726.17±5.37高sLAG-3組(n=34)0.98(0.94,1.08)60.74±8.7528.58±4.40t/Z值7.716-3.397-2.161P值<0.0010.0010.034

2.5 血清sLAG-3與紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn水平的二元Logistic回歸分析 見表5。將所有受試對象的血漿α-syn、紅細(xì)胞α-syn水平作為協(xié)變量，不同LAG-3濃度分組作為因變量，二元回歸分析顯示紅細(xì)胞α-syn水平與sLAG-3相關(guān)(P<0.05，OR=1.073)。

表5 血清sLAG-3與紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn水平的二元Logistic回歸分析變量BSEWalsP值OR值95%CI下限上限血漿α-syn0.0410.0520.6310.4271.0420.9411.155紅細(xì)胞α-syn0.0710.0286.2190.0131.0731.0151.134

3 討 論

病理性α-syn的擴(kuò)散是PD進(jìn)展的關(guān)鍵過程，目前研究[5]發(fā)現(xiàn)，α-syn在細(xì)胞間的傳遞有以下幾個途徑，如LAG-3、外泌體、小膠質(zhì)細(xì)胞、腸神經(jīng)、納米隧道管、經(jīng)典的內(nèi)吞和胞吐途徑等。LAG-3作為細(xì)胞表面的受體，優(yōu)先結(jié)合淀粉樣蛋白中的α-syn，從而啟動α-syn在細(xì)胞間的傳遞[6]。Zhang等[7]揭示了LAG-3 D1結(jié)構(gòu)域通常以有堿性的表面來結(jié)合α-syn的酸性碳末端，特別是其殘基118至140。病理性α-syn的形成不僅破壞α-syn的C端與形成淀粉樣蛋白的核心分子相互作用，還可以將C端凝聚在原纖維表面上，顯著提高α-syn與受體的結(jié)合親和力，加速α-syn在細(xì)胞間的傳遞。已有動物模型[8]證實了LAG-3參與病理性α-syn跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)PD的發(fā)生發(fā)展。LAG-3成熟后裂解形成的sLAG-3可通過血-腦屏障到達(dá)外周血中，并在血液中穩(wěn)定表達(dá)。

Guo等[9]采用MSD電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)測定CSF和血清中的sLAG-3，結(jié)果顯示，與對照組相比，PD患者CSF中的sLAG-3水平較低(P<0.001)，而兩組間血清sLAG-3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.16)。本研究及其他研究[10-12]結(jié)果提示PD患者的血清sLAG-3水平相對于對照組升高，上述結(jié)果不一致，差異部分可能為研究采用了不同的檢測技術(shù)，相比ELISA檢測技術(shù)，ECL技術(shù)具有更高的重復(fù)性、穩(wěn)定性、靈敏度和同質(zhì)性[13]。

Guo等[9]進(jìn)一步對3個LAG-3單核酸基因多態(tài)性進(jìn)行了基因分型，其中rs1922452-AA和rs951818-CC基因型被證實會增加中國女性PD的發(fā)病風(fēng)險。目前sLAG-3性別表達(dá)差異的原因有可能與基因變異、炎癥反應(yīng)及雌激素水平等有關(guān)。雌激素會影響神經(jīng)免疫功能并上調(diào)MHC Ⅰ和Ⅱ的表達(dá)，LAG-3作為免疫調(diào)節(jié)劑與MHC-Ⅱ分子有很高的親和力，雌激素可通過MHC-Ⅱ受體抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，調(diào)節(jié)CNS的神經(jīng)炎癥過程，對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[14]。本研究中，女性sLAG-3水平0.90(0.69,1.02)高于男性sLAG-3水平0.79(0.70,0.89)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.119)。該結(jié)果與已報道的結(jié)果不一致，主要是本研究納入的女性PD患者并非全是絕經(jīng)后女性，卵巢功能尚存，體內(nèi)的雌激素對炎癥反應(yīng)抑制較弱，神經(jīng)細(xì)胞仍受雌激素保護(hù)；樣本量較少，有實驗誤差，進(jìn)一步做單因素相關(guān)分析時發(fā)現(xiàn)，sLAG-3表達(dá)水平與性別相關(guān)(R=0.421,P=0.003)。目前對sLAG-3水平與疾病的嚴(yán)重程度、認(rèn)知、NMSS及病程的相關(guān)性研究結(jié)果不一致。郭丹丹[12]研究結(jié)果顯示，sLAG-3水平與H-Y有關(guān)，與UPDRS各部分評分、病程、NMSS不相關(guān)。Cui等[11]的一項多中心研究發(fā)現(xiàn)，sLAG-3水平與疾病運(yùn)動癥狀的嚴(yán)重程度不相關(guān)，與NMSS量表有相關(guān)性，尤其與非運(yùn)動癥狀中的日間過度嗜睡有關(guān)。在本研究發(fā)現(xiàn)，sLAG-3水平與H-Y分期、UPDRSⅢ、病程均不相關(guān)(P>0.05)，與NMSS量表相關(guān)(R=0.323,P=0.027)。綜上所述，sLAG-3水平與PD病情嚴(yán)重程度的關(guān)系尚不明確，本研究納入的PD患者多為服藥后的患者，抗PD藥物可能會削弱了sLAG-3與運(yùn)動癥狀嚴(yán)重程度的相關(guān)性，因此，未來需要納入更多初發(fā)病的PD患者做進(jìn)一步研究。以往對非運(yùn)動癥狀的研究[11,15]顯示，炎癥因素的增加與認(rèn)知功能下降、睡眠行為障礙、疲勞和抑郁等有關(guān)，由于sLAG-3是與細(xì)胞因子分泌相關(guān)的細(xì)胞免疫指標(biāo)，一定程度上可以反映PD非運(yùn)動癥狀的嚴(yán)重程度。

α-syn主要是細(xì)胞內(nèi)聚集蛋白。既往研究[16]發(fā)現(xiàn)，PD患者CSF中有α-syn寡聚體。α-syn寡聚體可透過血-腦屏障進(jìn)入外周血中，而血液中幾乎所有(99%)的α-syn都包含在紅細(xì)胞中，血漿僅含0.1%、外周血單核細(xì)胞包含0.05%、血小板包含0.2%。血漿α-syn研究結(jié)果非常不一致，可能與不同程度的溶血有關(guān)[17]。由于紅細(xì)胞是在制備過程中有分離和洗滌，因此溶血過程中被破壞的細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)含物的污染不太可能會影響到紅細(xì)胞α-syn水平。Foulds等[18]對血漿中α-syn表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比磷酸化α-syn表達(dá)水平明顯高于對照組，而總的α-syn和寡聚體α-syn水平兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Tian等[16]對紅細(xì)胞中的總α-syn、寡聚體α-syn和磷酸化α-syn(pS129)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比PD組總α-syn和磷酸化α-syn明顯高于對照組，而兩組間寡聚體α-syn差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，PD患者血漿及紅細(xì)胞中的α-syn明顯高于對照組，兩組紅細(xì)胞中的α-syn水平明顯高于血漿的α-syn水平，這與一些研究[4,19]結(jié)果一致。

目前對紅細(xì)胞和血漿中α-syn與PD病程、臨床癥狀嚴(yán)重程度研究結(jié)果尚不一致。Wang等[4]研究結(jié)果顯示，紅細(xì)胞α-syn水平與臨床特征無明顯的相關(guān)性，而血漿α-syn與病程、MoCA評分、H-Y分期、UPDRS存在明顯的正相關(guān)。Chahine等[20]發(fā)現(xiàn)血漿α-syn與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞和血漿α-syn水平與病程、H-Y分期、UPDRS、NMSS均不相關(guān)，這與研究[17,19]得出的結(jié)果一致?？赡艿脑驗棣?syn寡聚體對PD的更多作用于多巴胺神經(jīng)元凋亡的促發(fā)階段，包括改變細(xì)胞骨架、增加膜通透性、促進(jìn)Ca2+內(nèi)流等，而非多巴胺神經(jīng)凋亡的結(jié)果，因此推測，PD患者外周血α-syn水平檢測疾病進(jìn)展的價值較低。

本研究比較了sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn表達(dá)水平對PD的診斷效能，ROC曲線顯示，檢測血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn表達(dá)水平對診斷PD都有一定的診斷價值。根據(jù)sLAG-3最佳截斷值將所有受試者分組后顯示，高sLAG-3組中的紅細(xì)胞和血漿α-syn水平均高于低sLAG-3組。進(jìn)一步對紅細(xì)胞和血漿α-syn水平做回歸分析發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞α-syn與sLAG-3相關(guān)。α-syn寡聚體透過血-腦屏障進(jìn)入外周血，大部分聚集于紅細(xì)胞內(nèi)，而LAG-3作為細(xì)胞表面受體可特異性地結(jié)合α-syn寡聚體。由此推測，LAG-3可能參與了α-syn寡聚體聚集于紅細(xì)胞的過程，有促使紅細(xì)胞內(nèi)α-syn寡聚體形成的作用。

綜上所述，血清 sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn在PD組中有高表達(dá)；PD組中血清sLAG-3水平與性別、NMSS相關(guān)；血清sLAG-3與紅細(xì)胞α-syn水平有相關(guān)性，檢測血清sLAG-3、紅細(xì)胞α-syn和血漿α-syn水平對PD都有一定的診斷價值。