基于腸-乳腺軸淺談奶牛“內源性乳腺炎”的病理機制及防控措施

胡曉宇，趙才軍，曹永國，付云賀，張乃生 (吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062)

奶業(yè)在國家的社會、經濟中占有重要地位，其發(fā)展已成為評價一個國家畜牧業(yè)發(fā)達程度的重要標志。乳腺炎是奶牛最常見的多發(fā)病，是公認的危害奶業(yè)生產的頭號疾病。該病病因復雜，致病途徑及發(fā)病機制尚未完全闡明，且防制困難，單純靶向乳腺局部治療效果有限。通常認為，乳腺炎主要是細菌等病原通過乳頭進入乳腺引起的局部炎癥反應。但筆者通過在生產實踐中對奶牛乳腺炎發(fā)病規(guī)律的觀察、文獻報道的梳理以及課題組最新研究成果的總結，發(fā)現乳腺炎的發(fā)生，除相對于外界病原感染引起的外源性致病途徑外，尚存在內源性致病途徑，創(chuàng)新性的提出“內源性乳腺炎”這一病理概念?；诖耍鄬τ谝罁≡瓕W、病理學和癥狀學等分類方式，本研究提出乳腺炎新的病因學分類方式，即基于致病途徑將乳腺炎分為外源性乳腺炎和內源性乳腺炎。乳腺炎這一新的病理學概念的闡明和分類方式的建立，不僅為乳腺炎的致病途徑和發(fā)病機制做出重要的創(chuàng)新性解讀，改變對誘發(fā)乳腺炎的病原均來自于外界環(huán)境的傳統(tǒng)認知；同時，提示選用具有調控瘤胃內環(huán)境及菌群的制劑，靶向腸-乳腺軸，可能是防制“內源性乳腺炎”的有效方法和途徑。

1 “內源性乳腺炎”病理概念的提出——乳腺炎的發(fā)生除與外界病原感染有關外，尚存在內源性致病途徑

乳腺炎泛指乳腺組織的各類炎癥，其主要特點是乳汁發(fā)生理化性質及細菌學變化，乳腺組織發(fā)生病理學變化。乳腺炎病因復雜，與飼養(yǎng)管理、環(huán)境衛(wèi)生、產后機體與乳房狀態(tài)、遺傳特性、擠奶不當等多種因素有關，目前認為最為關鍵的還是病原微生物的感染。根據病原微生物、病理變化、臨床癥狀和病程長短等，現有多種不同的分類方法。我國目前主要采用美國國家乳房炎委員會(NMC)根據乳房及乳汁中有無肉眼可見的變化，將乳房炎分為隱性乳房炎[乳房和乳汁均無眼觀變化，但乳汁體細胞數(SCC)升高]和臨床型乳房炎(乳汁和乳房均有眼觀變化)的分類方法。課題組前期調查發(fā)現，有些奶牛特別是高產奶牛的乳腺炎，臨床癥狀不明顯，僅表現出SCC升高，也分離不到常見致病菌，且多伴發(fā)或繼發(fā)于前胃馳緩和亞急性瘤胃酸中毒(SARA)等消化系統(tǒng)性疾病。同時，在臨床實踐中針對乳腺的局部治療效果有限。又有《醫(yī)宗金鑒》所示：“乳癰由肝氣郁結、胃熱壅滯而成”，即反芻動物因食精料過多，致使胃熱壅盛，氣血凝滯，遂成乳癰。更有現代醫(yī)學之父希波克拉底提出“一切疾病始于腸道(all disease begins in the gut)”和傳統(tǒng)中醫(yī)文化提出“欲得長生，腸中常清，糞毒入血，百病蜂起”的理論，提示高精飼料應激等因素導致奶牛胃腸道穩(wěn)態(tài)失衡，可能是乳腺炎的重要內源性誘因。

瘤胃是反芻動物特有的消化器官，相當于人和單胃動物的大腸，定殖著種類繁多，數量龐大的微生物群落，大多數重要的物理和生化過程都在瘤胃中且在微生物的參與下完成。越來越多的研究發(fā)現，腸道菌群不僅對胃腸道健康至關重要，還參與代謝性、自身免疫性和感染性等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程[1-3]。研究表明，在健康和患乳腺炎奶牛的瘤胃菌群結構和功能之間存在顯著性差異[4]。并且給奶牛長期飼喂高精料，可導致乳汁中SCC增加[5]，而添加菊粉可以通過改善奶牛瘤胃微生物及其代謝物結構緩解隱性乳腺炎[6]。此外，近年來臨床實踐上通過服用益生菌來治療乳腺炎，也取得了良好效果[7]。提示瘤胃菌群與乳腺2個看似毫無關系的器官，可能存在密切聯系。本課題組前期研究發(fā)現，通過給小鼠飲水中添加抗生素擾亂腸道菌群，在沒有外界病原菌感染的情況下，可導致血乳屏障滲透性增加和乳腺炎的發(fā)生[8]。并且將患乳腺炎奶牛的糞便和瘤胃液移植給小鼠，可直接導致小鼠乳腺炎(部分結果尚未發(fā)表)[9]。證明瘤胃菌群紊亂與乳腺炎直接關聯。另有研究發(fā)現，長期飼喂高精料可導致奶牛瘤胃源內毒素(LPS)通過血液進入乳腺，影響乳腺的氧化應激和乳蛋白生成[10]。本課題組前期同樣發(fā)現，對奶牛飼喂高精料誘導SARA模型導致SCC升高的同時，瘤胃內豐度升高的致病菌和LPS等代謝產物大量出現于乳腺[11]。提示瘤胃菌群紊亂可通過促進瘤胃內有害菌及其代謝產物遷移至乳腺，誘發(fā)乳腺炎。

以上臨床和試驗中的發(fā)現表明，乳腺炎的發(fā)生，除與已知的外界病原微生物感染等因素介導的外源性致病途徑外，尚存在由瘤胃菌群及其代謝物介導的內源性致病途徑，因而推導出“內源性乳腺炎”病理概念，即相對于外界病原感染乳腺導致的局部炎癥反應，在非外界病原感染情況下，由于飼料改變等應激因素，導致胃腸道菌群紊亂，黏膜屏障滲透性增加，胃腸道內致病菌及其代謝產物通過內源性途徑遷移至乳腺，致使乳汁中SCC升高，致發(fā)乳腺炎(圖1)。

圖1 奶?！皟仍葱匀橄傺住辈±砑僬f

2 “內源性乳腺炎”病理機制的解析——腸-乳腺軸介導途徑

腸道菌群對腸外遠端器官的調節(jié)是近年來國內外研究的熱點、難點和新興領域。隨著腸-腦軸、腸-肺軸和腸-肝軸等的提出與解析，發(fā)現腸道菌群紊亂可導致腸道內有害菌及其代謝產物以內源性途徑遷移至腦、肺臟、肝臟等腸外遠端器官，引發(fā)相關疾病。近年來，隨著腸-乳腺軸的提出，更是將腸道與乳腺2個看似不相關的器官聯系在一起，雖然腸-乳腺軸的介導途徑尚不清晰，但在借鑒相關研究報道和本課題組前期研究結果的基礎上，推測腸-乳腺軸主要是通過瘤胃源性細菌和/代謝產物和/神經遞質和/免疫細胞4種途徑介導和調控乳腺炎的發(fā)生發(fā)展。

(1)瘤胃細菌遷移：通常認為乳汁菌群來源于胎兒口腔或皮膚、乳腺皮膚、或環(huán)境中的細菌，但最近有研究提出腸道中的細菌可以通過血液或淋巴循環(huán)途徑遷移至乳腺(圖2)[12]。研究表明，哺乳母親體內存在含有吞噬細菌的循環(huán)淋巴樣細胞，并且在哺乳期的母乳中可以檢測到腸道細菌存在[13]。并且，懷孕和哺乳期小鼠腸道細菌從腸道遷移至乳腺的頻率增加[14]。此外，免疫細胞，特別是樹突狀細胞(dendritic cell,DCs)可以保留活的腸道細菌數天，并通過淋巴循環(huán)將它們帶到腸系膜淋巴結，隨后遷移到遠端器官，包括哺乳期的乳腺[15-16]。

圖2 腸道細菌遷移至乳腺途徑[12]

對于奶牛等反芻動物而言，瘤胃細菌從瘤胃遷移至乳腺的途徑可能同樣存在(圖3)[17]。YOUNG等[18]對收集的同一頭健康奶牛的乳汁、血液和糞便樣本菌群分析發(fā)現，三者均存在瘤胃球菌屬(Rumi-nococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，推測奶牛腸道細菌可能通過內源性途徑遷移到泌乳的乳腺。此外，一項對牛的左氏原壁菌(Protothecazopfii,P.zopfii)性乳腺炎的流行病學研究表明，P.zopfii誘導的乳腺炎可能是由于該菌從腸道遷移至乳腺所致[19]。另有研究表明，子宮病原體可以通過血液從奶牛的腸道轉移到子宮[20]。本課題組最近的研究同樣表明，高精料誘導奶牛SARA模型導致瘤胃內乳腺炎致病菌寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)的豐度顯著升高，并且該菌大量出現于乳腺[21]，進一步研究發(fā)現將熒光標記的寡養(yǎng)單胞菌灌服給小鼠，導致小鼠腸屏障和血乳屏障滲透性增加，且在血液以及乳腺組織中檢測到帶有熒光標簽的該細菌，提示瘤胃內寡養(yǎng)單胞菌可以通過內源性途徑遷移至泌乳的乳腺，誘發(fā)乳腺炎(結果尚未發(fā)表)。

圖3 反芻動物體內的腸-乳腺[17]

(2)瘤胃源細菌代謝物遷移：肝臟是機體重要的解毒器官。一旦瘤胃內致病菌和有害代謝物進入血液且超過了肝臟的解毒能力，就會造成過多的炎性介質循環(huán)于血液中，導致機體發(fā)生系統(tǒng)性低度炎癥反應[22]。當奶牛泌乳時，由于乳腺血流量增加，會導致炎癥介質進入乳腺，破壞血乳屏障，誘發(fā)乳腺炎。研究表明，奶牛長期飼喂高精料會導致瘤胃內LPS大量釋放入血，誘導機體發(fā)生系統(tǒng)性慢性炎癥，同時激活乳腺鈣貯運通道，誘導乳腺組織出現內質網應激、細胞凋亡和炎癥反應[23]。并且LPS可以隨著血液循環(huán)進入泌乳的乳腺，影響乳腺的氧化應激狀態(tài)和乳蛋白合成[5,10]。本課題組前期研究同樣發(fā)現，高精料誘導SARA模型的奶牛瘤胃內釋放的LPS導致瘤胃屏障滲透性增加，進而入血，損害肝功能，從而循環(huán)至乳腺，破壞血乳屏障，誘發(fā)乳腺炎(圖4)[21,24]。此外，合成乳成分的主要原料短鏈脂肪酸(SCFAs)主要來源于瘤胃微生物對奶牛攝入的碳水化合物發(fā)酵而產生的生理過程表明，瘤胃內SCFAs可以通過內源性途徑遷移至乳腺。此外，SCFAs還是調節(jié)血乳屏障的重要物質，本課題組前期研究發(fā)現給小鼠灌服產丁酸的益生菌能夠通過代謝的丁酸進入乳腺，維持血乳屏障的完整性，從而抑制金葡菌感染誘導的乳腺炎[8]。

圖4 瘤胃源LPS進入泌乳乳腺，破壞血乳屏障，誘發(fā)乳腺炎[21,24]

(3)瘤胃源性神經遞質：乳腺除了受感覺神經調節(jié)外，還受ENS和ANS的調控。研究表明，交感神經興奮釋放的去甲腎上腺素(NE)通過調節(jié)緊密連接蛋白occludin和ZO-1的表達，增加腸屏障滲透性[25-26]。此外，神經遞質兒茶酚胺(catecholamine)和乙酰膽堿(acetyl choline，ACH)均能調節(jié)腸黏膜通透性[27]。芍藥苷可以通過刺激ACH釋放減輕大鼠功能性消化不良，同時增加腸屏障緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達[28]，并且活化α7煙堿乙酰膽堿受體顯著緩解了心肺轉流術誘導的腸屏障滲透性的增加[29]。此外，組胺可以通過影響ZO-1和鈣黏蛋白(P-cadherin)的表達調節(jié)腎小球的濾過功能[30]。而影響腸屏障的NE、ACH、catecholamine以及組胺等神經遞質均可以由腸道菌群產生[27]。血乳屏障的結構與血腦屏障和腸屏障及其相似，均是由上皮細胞間的緊密連接蛋白組成(圖5)[31]。據此，腸道菌群代謝產生的調控腸屏障的神經遞質同樣對血乳屏障的通透性具有調節(jié)作用，而血乳屏障滲透性的增加，則是導致乳腺炎易感性增加的重要因素。此外，研究還發(fā)現，腸道細菌能夠刺激腸內分泌細胞(enteroendocrine cell，ECs)分泌血清素(serotonin，5-HT)[32]。5-HT除了調節(jié)血壓之外，還可以通過血液循環(huán)進入乳腺，影響乳腺健康[33]。更有研究表明，循環(huán)系統(tǒng)中高濃度的5-HT與血乳屏障滲透性增加和乳汁中SCC升高密切相關[34]。

圖5 血乳屏障結構[31]

(4)瘤胃源性免疫細胞遷移：免疫細胞是機體內一類多樣化的細胞群，其中一部分免疫細胞會在血液中循環(huán)并在接收到來自組織損傷的信號后遷移到患處，而其他免疫細胞則會駐留在組織中并捕獲入侵的微生物，隨后遷移到淋巴結激活宿主的免疫反應。免疫細胞遷移到腸受腸道菌群以及腸道菌群參與介導的細胞因子、趨化因子和神經遞質的調控[35]。研究發(fā)現，腸道菌群可以通過刺激2型固有淋巴細胞(ILC2s)從腸道遷移至肺臟調節(jié)肺臟炎癥反應，而抗生素擾亂腸道菌群則會影響肺臟和腸道中ILC2s的數量和遷移[36]。也有研究證明，腸道菌群可以通過促進3型固有淋巴細胞(ILC3s)進入新生小鼠的肺臟緩解肺炎[37]。FITZPARICK等[38]還發(fā)現腸道菌群可以通過促進表達IgA的漿細胞遷移至大腦，調節(jié)腦部炎癥反應。也有研究提出腸黏膜固有層的一些免疫細胞可以遷移到乳腺[39]。此外，RAMANAN等[40]發(fā)現，在懷孕后期，母體腸道菌群可調控表達IgA的漿細胞產生并遷移至乳腺，進而促進子代腸道RORγ+Treg細胞的發(fā)育，有助于新生兒抵抗腸道炎癥。

3 “內源性乳腺炎”防制的探索——靶向腸-乳腺軸調控瘤胃內環(huán)境及菌群

如果瘤胃菌群紊亂是經由腸-乳腺軸來介導調控“內源性乳腺炎”的發(fā)生發(fā)展過程，那么靶向瘤胃內環(huán)境及菌群的穩(wěn)態(tài)調控可能就是防制“內源性乳腺炎”的有效途徑和方法。益生菌在奶牛乳腺炎的防制應用中取得了很大的進展。通過對乳腺炎患者服用發(fā)酵乳桿菌 CECT5713或唾液乳桿菌CECT5714可顯著降低乳汁中細菌總數以及疼痛感和復發(fā)率[41]。此外，一項為期16周的臨床試驗表明，在哺乳期服用發(fā)酵乳桿菌CECT5716比未服用該益生菌的女性乳腺炎發(fā)病率下降51%[42]。在反芻動物研究中同樣發(fā)現，腸道中乳腺炎致病菌豐度的增加和乳酸菌等益生菌豐度的降低與奶牛乳腺炎有關[43]。另有臨床試驗研究發(fā)現，添加酵母和乳酸菌能夠顯著降低患隱性乳腺炎山羊乳汁中SCC和炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度，同時降低乳汁中腸球菌(Enterococcus)和鏈球菌(Streptococcus)等乳腺炎致病菌的豐度[44]。最近又有研究發(fā)現添加益生元菊粉，可以通過改善奶牛瘤胃菌群及其代謝產物緩解隱性乳腺炎并改善乳品質[6]，以及添加解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens-9)可以通過改變腸道菌群緩解山羊的隱性乳腺炎[45]。糞菌移植近年來被認為是治療腸道菌群紊亂誘發(fā)相關疾病的有效途徑。研究發(fā)現，瘤胃菌群移植能顯著緩解奶牛SARA[46]，此外，通過糞便移植同樣能顯著改善犢牛腹瀉[47]。本研究前期研究發(fā)現，對腸道菌群紊亂誘發(fā)乳腺炎的小鼠移植健康小鼠的糞便，能夠顯著改善因腸道菌群紊亂所誘導的乳腺炎癥[8]。

4 結論

綜上所述，乳腺炎的發(fā)生，相對于已知的外界病原感染等因素介導的外源性致病途徑外，尚存在由瘤胃菌群及其代謝物介導的內源性致病途徑，由此產生“內源性乳腺炎”病理概念，即針對飼料變更等應激因素導致奶牛瘤胃內環(huán)境失衡，瘤胃菌群紊亂，有益菌及其代謝產物減少，而有害菌及其代謝產物增多，同時瘤胃菌群代謝的神經遞質紊亂，這些有害菌及其代謝物一方面影響瘤胃內免疫細胞向乳腺遷移；另一方面通過破壞瘤胃上皮細胞的緊密連接蛋白表達，引起胃腸道屏障通透性增加，促使有害菌及代謝物進入血液，引起機體“系統(tǒng)性慢性低度炎癥”，當奶牛發(fā)生泌乳應激時，伴隨著循環(huán)旺盛的乳腺血液和淋巴液，瘤胃內有害菌及其代謝產物以內源性途徑進入乳腺，破壞血乳屏障，引起“內源性乳腺炎”?；凇皟仍葱匀橄傺住钡亩x，本課題組提出針對于致病途徑將乳腺炎分為外源性乳腺炎和內源性乳腺炎，豐富乳腺炎的病因學和病理學理論。并且建議開辟通過靶向瘤胃菌群調節(jié)“腸-乳腺軸”防制乳腺炎新的途徑和方法。以期為深入認識和破解乳腺炎發(fā)病機制與防制難題提供新的理論與臨床指導，拓展科學前沿。