基于量子點(diǎn)免疫層析的布魯菌抗體診斷卡研制

祝令偉，紀(jì) 雪，陳 霞，陳 俊，盧葛錦，郭學(xué)軍，孫 洋，郎需龍* (.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所，吉林 長春 30；.中國疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實驗室，北京 006)

布魯菌是一種胞內(nèi)寄生革蘭陰性球桿菌，該菌能引起人和動物的布魯菌病(簡稱布病)，給流行地區(qū)和國家造成巨大經(jīng)濟(jì)損失并可嚴(yán)重影響人類健康，所以對布魯菌病的準(zhǔn)確鑒定是控制與根除布病的關(guān)鍵[1-2]。目前對于布病的血清學(xué)檢測主要采用平板凝集試驗、膠體金免疫層析、試管凝集試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗等[3]，而對現(xiàn)場檢測來說，方便、耗時短、靈敏度高的檢測產(chǎn)品已經(jīng)成為今后研發(fā)趨勢[4-5]。

量子點(diǎn)(quantum dot,QD)已經(jīng)成為一種新型的檢測指示劑[6]，其具有熒光強(qiáng)度高、發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，通過對表面的官能團(tuán)進(jìn)行不同的修飾后，可和生物大分子進(jìn)行偶聯(lián)作為一種新型指示劑，其光穩(wěn)定好、抗漂白能力強(qiáng)，對不同的抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過免疫層析等方法進(jìn)行結(jié)合，并利用一定波長激光激發(fā)呈現(xiàn)特定顏色反應(yīng)，從而可快速檢測樣本中微量抗原或抗體[7-8]。

本研究通過將量子點(diǎn)作為新型熒光標(biāo)記制備量子點(diǎn)免疫層析試紙條，可用于檢測動物血清中是否含布魯菌抗體，為相關(guān)疫病監(jiān)測產(chǎn)品的研發(fā)提供更好的選擇。

1 材料與方法

1.1 試劑、耗材與設(shè)備布魯菌陽性血清、布魯菌陰性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布魯菌LPS(杭州賢至生物科技有限公司)；獨(dú)立二抗抗原及獨(dú)立二抗抗體購自洛陽佰奧通實驗材料中心；羧基量子點(diǎn)微球北京納諾金生物科技有限公司(量子點(diǎn)熒光微球的激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長610 nm)；ELISA布魯菌抗體檢測試劑盒為青島立見生物公司；大腸桿菌O157:H7陽性血清、沙門菌陽性血清、牛結(jié)核病陽性血清本實驗室保存；小腸結(jié)腸耶爾森菌O9陽性血清為中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所保存。

PVC底板購自東莞市金耒力生物技術(shù)有限公司；Sartorius NC膜(德國賽多利斯)；8964玻纖(上海杰一生物技術(shù)有限公司)；8975玻纖(懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司)；吸水紙(懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司)。

噴金劃膜儀HM3035(上海金標(biāo)生物科技公司)；微電腦自動斬切機(jī)ZQ2002(上海金標(biāo)生物科技公司)；BIORAD凝膠成像設(shè)備(Universal Hood Ⅱ)。

1.2 量子點(diǎn)偶連及包被向0.1 mL量子點(diǎn)中加入0.3 mL MES緩沖液，經(jīng)10 μL 10 g/L EDC-HCl和10 μL 10 g/L NHS快速混勻后，37℃ 15 min進(jìn)行活化，8 000×g離心 20 min，棄上清，用10 mmol/L pH6.0 MES 緩沖液重懸至 0.2 mL，超聲輔助混勻。加入待標(biāo)記抗原或抗體，迅速混勻，37℃反應(yīng)1 h，超聲輔助混勻，加入封閉劑封閉后復(fù)溶。

1.3 試紙條制作將結(jié)合墊裁切成10 mm×300 mm 長條，劃膜噴金儀將標(biāo)記復(fù)溶的量子點(diǎn)標(biāo)記物(LPS標(biāo)記物和獨(dú)立二抗抗體標(biāo)記物以2∶1混合)噴涂到結(jié)合墊上，噴涂量為3 μL/cm。在25 mm 寬度賽多利斯CN140膜上劃出檢測線(T)和質(zhì)控線(C)，T線同樣采用LPS，C線用量子點(diǎn)標(biāo)記獨(dú)立二抗抗原，37℃鼓風(fēng)干燥箱過夜烘干。

1.4 試紙條組裝上海金標(biāo)HM3035噴金劃膜儀噴涂量子點(diǎn)微球和各檢測帶，上海金標(biāo)ZQ2002微電腦自動斬切機(jī)切條，各種噴涂后的耗材分別裁切為需要規(guī)格。按順序組裝，裝入定制卡殼和密封鋁箔袋保存或用于檢測。鋁箔袋中裝入干燥劑以保持試紙條性質(zhì)穩(wěn)定。使用BIORAD凝膠成像設(shè)備Universal Hood Ⅱ?qū)z測卡內(nèi)的試紙條進(jìn)行熒光成像質(zhì)檢。

1.5 試紙條使用方法制定優(yōu)化檢測試紙條使用方法，分別采用磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、蒸餾水等作為上樣緩沖液進(jìn)行檢測，根據(jù)不同上樣量制定量子點(diǎn)免疫層析試紙條使用條件，并制定檢測說明書。

1.6 試紙條特異性測試分別檢測羊布魯菌病陽性血清、結(jié)核菌陽性血清、大腸桿菌O157:H7陽性血清、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽性血清、沙門菌陽性血清、豬鏈球菌2型陽性血清各1份，血清樣本采用緩沖液10×稀釋點(diǎn)樣，層析10 min后讀取檢測結(jié)果。

1.7 試紙條敏感性測試將布魯菌病陽性血清采用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，稀釋倍數(shù)為1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024，1∶2 048，并采用量子點(diǎn)熒光微球檢測卡進(jìn)行測試。

1.8 臨床血清樣本測試將量子點(diǎn)檢測試紙條對臨床血清樣本進(jìn)行測試，并分別使用試管凝集試驗(SAT)、ELISA、市售布魯菌抗體膠體金試紙條等方法進(jìn)行比對試驗。

2 結(jié)果

2.1 試紙條構(gòu)建建立的量子點(diǎn)檢測試紙條樣品對布魯菌陽性血清及陰性血清檢測符合預(yù)期，且陽性血清樣本T線顯色強(qiáng)度高，使用BIORAD凝膠成像設(shè)備Universal Hood Ⅱ?qū)z測卡內(nèi)的試紙條進(jìn)行熒光成像見圖1。

圖1 試紙條熒光成像圖片

2.2 試紙條使用方法從包裝鋁箔袋中取出檢測卡，將其置于平坦的臺面，用滴管垂直滴加10～20 μL血清至加樣孔，采用微型巴斯德吸管滴加約80 μL緩沖液，檢測結(jié)果于10 min時讀取。結(jié)果見圖2，僅質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)1條亮帶，判定為陰性。在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)均出現(xiàn)條帶，判定為陽性。質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)條帶，判定為無效。通過試驗得知，生理鹽水、PBS、蒸餾水等均可作為緩沖液進(jìn)行樣本檢測。讀取時可使用365 nm波長熒光手電進(jìn)行激發(fā)檢測或采用相關(guān)波長儀器讀取檢測結(jié)果。

圖2 布魯菌抗體檢測試紙條(量子點(diǎn)法)檢測結(jié)果判定示意圖

2.3 量子點(diǎn)試紙條特異性測試使用試紙條分別檢測結(jié)核菌陽性血清、大腸埃希菌O157:H7陽性血清、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽性血清、沙門菌陽性血清、豬鏈球菌2型陽性血清等，未發(fā)生非特異性交叉反應(yīng)(圖3)。

1.布魯菌陽性血清；2.布魯菌陰性血清；3.結(jié)核菌陽性血清；4.大腸埃希菌O157:H7陽性血清；5.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽性血清；6.沙門菌陽性血清；7.豬鏈球菌2型陽性血清圖3 量子點(diǎn)檢測試紙條血清特異性測試

2.4 試紙條敏感性測試針對布魯菌病陽性血清進(jìn)行倍比稀釋后的樣品進(jìn)行檢測，可檢測到1∶512倍稀釋后的樣品，市售產(chǎn)品僅檢測到1∶64倍稀釋的血清稀釋樣品。本研究的量子點(diǎn)熒光檢測試紙條敏感性測試見圖4，從左至右1～11分別為1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024，1∶2 048倍布魯菌陽性稀釋血清，1∶512倍稀釋后仍可見到熒光檢測條帶。市售膠體金采用競爭法，出現(xiàn)條帶為檢測結(jié)果陰性。檢測結(jié)果見圖5，從左至右1～10分別為1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024倍布魯菌陽性稀釋血清，可見1∶128倍稀釋開始有弱的條帶出現(xiàn)，即為陰性。

1～11.1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024，1∶2 048倍布魯菌陽性稀釋血清圖4 量子點(diǎn)熒光檢測試紙條敏感性測試

1～10.分別為1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1 024倍布魯菌陽性稀釋血清圖5 市售膠體金檢測試紙條敏感性測試

2.5 試紙條臨床樣本檢測將構(gòu)建的檢測試紙條對不同種類動物布魯菌陽性血清進(jìn)行鑒別診斷，本研究所采用的試紙條對臨床樣本檢測和ELISA檢測結(jié)果一致(表1)。

表1 試紙條臨床樣本檢測結(jié)果 份

3 討論

布魯菌作為一種重要的人獸共患病，給養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大的損失[9]。在進(jìn)行養(yǎng)殖業(yè)防控策略中，進(jìn)行大范圍的檢疫凈化是一項重要的工作，及時、快速、準(zhǔn)確的診斷是進(jìn)行防控和消除布魯菌病的重要措施，在臨床檢測中，血清學(xué)鑒定是一項簡便、經(jīng)濟(jì)的做法[10]。

免疫層析技術(shù)是進(jìn)行動物疫病監(jiān)測中比較常用的快速檢測方法，目前已有多種基于膠體金技術(shù)的免疫層析試紙條的研制，但由于膠體金顆粒沒發(fā)光特性，僅依靠顏色進(jìn)行結(jié)果判定時導(dǎo)致其靈敏度降低[10-11]。本研究采用量子點(diǎn)結(jié)合免疫層析檢測技術(shù)，構(gòu)建量子點(diǎn)免疫層析布魯菌抗體檢測試紙條，所使用量子點(diǎn)與傳統(tǒng)染料相比，其激發(fā)波長較寬而發(fā)射波長較窄，發(fā)射熒光穩(wěn)定，在抗熒光漂白方面具有極大優(yōu)勢。以往膠體金試紙條或類似量子點(diǎn)層析試紙條研制方法，采用表達(dá)蛋白的外膜蛋白[12]、葡萄球菌蛋白A(SPA)[13]等作為結(jié)合抗原進(jìn)行布魯菌病抗體的檢測。本研究曾采用葡萄球菌蛋白A偶聯(lián)量子點(diǎn)微球并噴涂于樣品結(jié)合墊，對臨床不同種屬動物標(biāo)本進(jìn)行檢測時，由于蛋白A對不同種屬動物抗體結(jié)合能力具有一定差異，部分樣本出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。在對臨床樣本測試時，與市面上采購的同類型膠體金產(chǎn)品進(jìn)行比對，其特異性優(yōu)于膠體金檢測試紙條。在研究過程中，參考類似病原體的抗體層析試紙條檢測方法[14-15]，在樣品結(jié)合墊及檢測線均用布魯菌LPS進(jìn)行夾心法檢測的情況下，對結(jié)合墊及檢測線的抗原濃度比例進(jìn)行調(diào)試，可達(dá)到最佳檢測效果。另外，如在進(jìn)行免疫層析產(chǎn)品研發(fā)中，出現(xiàn)由于抗體競爭等原因，控制線較弱或無法出現(xiàn)的情況，可采用獨(dú)立二抗抗原及抗體作為控制線，從而解決測試紙條控制線條帶顯色微弱等各種問題[16]。

總體來說，采用量子點(diǎn)免疫層析檢測技術(shù)對病原微生物所導(dǎo)致的疫病進(jìn)行抗原或抗體檢測研究中，經(jīng)過條件優(yōu)化，既可使用儀器讀取，也可采用常規(guī)的熒光手電照射的方法，使臨床應(yīng)用更加準(zhǔn)確方便。