肺炎克雷伯菌所致奶牛肺炎的病原分析及治療

賈 麗，李 可，梁艷艷，侯銘源，田夢悅，楊 明，林倩穎，張 婷，馬玉忠 (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

肺炎是嚴(yán)重危害奶牛生產(chǎn)的一種常見呼吸道疾病[1]。肺炎克雷伯菌是奶牛肺炎的主要致病菌之一[2]。由于抗生素的大量使用，細(xì)菌耐藥性逐漸增加，導(dǎo)致使用抗生素防治奶牛肺炎的難度逐漸加大[3]。為了有效地預(yù)防和控制本病的流行，本試驗采集石家莊地區(qū)患肺炎奶牛的鼻腔分泌物，分離病原菌，進(jìn)行致病性試驗、藥敏試驗、多重耐藥及進(jìn)化樹分析，并對患病奶牛進(jìn)行治療，為該地區(qū)肺炎克雷伯菌所致奶牛肺炎的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑普通瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、LB肉湯培養(yǎng)基購自北京澳博星生物技術(shù)公司；革蘭染液購自濰坊漢唐生物公司；藥敏片購自杭州濱和微生物公司；2×Taq PCR MasterMix (KT201)和DL2000 DNA Marker (MD114)購自北京天根公司；恩諾沙星注射液購自上海中牧康公司；麻杏石甘散購自杭州科寶生物公司。

1.2 病料來源石家莊地區(qū)規(guī)模化奶牛場的病牛，2歲左右，表現(xiàn)為呼吸急促、咳嗽、流鼻涕、精神沉郁、食欲不振、體溫升高等癥狀，肺部聽診可聽到明顯的濕性羅音。采集病牛鼻拭子，并結(jié)合如下試驗進(jìn)一步確診。

1.3 疑似菌株的獲取將樣品初步處理后，接種于普通瓊脂平板上，37℃ 培養(yǎng)12～18 h，挑取疑似菌落進(jìn)行多次純化，直至出現(xiàn)優(yōu)勢菌落。挑取疑似肺炎克雷伯菌菌落，在EMB培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)。在LB肉湯中增菌，放入甘油中保菌。

1.4 革蘭染色鏡檢、生化鑒定及細(xì)菌DNA的提取挑取上述疑似菌落，進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。參照文獻(xiàn)[4]的鑒定方法對疑似菌株進(jìn)行生化試驗。參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行DNA的提取。

1.5 16S rDNA PCR基因擴(kuò)增以上述提取的DNA為模板，使用16S rDNA通用引物27F (5′-A-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)與1429R(5′-G-GTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進(jìn)行PCR分子鑒定。50 μL體系：2 ×Taq PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 4 μL，ddH2O 17 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其目的條帶，將PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送往上海生工公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行比對，確定菌種信息。

1.6 分離菌株小鼠致病性試驗SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量(20 ± 2) g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將小鼠隨機(jī)分成試驗組和對照組。調(diào)整菌液濃度至1×108CFU/mL，試驗組每只小鼠腹腔注射菌液0.3 mL，對照組注射等量無菌生理鹽水，觀察記錄小鼠的臨床癥狀和病死情況。剖檢病死小鼠，觀察器官病變，并采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。

1.7 藥敏試驗按照NCCLS(2017年)推薦的K-B紙片法對分離的病原菌進(jìn)行藥敏試驗。依照CLSI[6]的標(biāo)準(zhǔn)判定藥物敏感性。

1.8 系統(tǒng)發(fā)育分析選取NCBI上的K.Pneumoniaesubsp.PneumoniaeDSM 30104、K.PneumoniaeR-70，使用MEGA 7.0制作系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9 治療試驗隨機(jī)將肺炎奶牛分為4組(A～D組)。A組為敏感抗生素治療組，B組為中藥治療組，C組為敏感抗生素+中藥治療組，D組為患病不治療組；另選健康奶牛設(shè)為E組，作為對照組。所有奶牛在治療期間正常飼喂，自由飲水，觀察用藥后奶牛的恢復(fù)情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)從84份樣品中發(fā)現(xiàn)32株疑似肺炎克雷伯菌。菌株在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、扁平、乳白色的中等菌落(圖1A)，在EMB上為圓形、粉紅色、有閃光、黏稠的大菌落(圖1B)。革蘭染色陰性(圖1C)，可見兩端鈍圓、單個或成對排列的短粗桿菌。

A.普通瓊脂平板上菌落形態(tài);B.伊紅美藍(lán)瓊脂平板上菌落形態(tài);C.分離菌的形態(tài) (×1 000)圖1 分離菌的形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察

2.2 生化鑒定32株疑似菌均能發(fā)酵各種糖類，產(chǎn)氣產(chǎn)酸，不產(chǎn)生H2S，VP試驗呈陽性，能分解尿素，MR、吲哚試驗為陰性，能利用檸檬酸鹽，與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中肺炎克雷伯菌的生化特性基本吻合，故均疑似為肺炎克雷伯菌，分離率為38.1%(32/84)。

2.3 分離菌株16S rDNA PCR鑒定將分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳，獲得的目的條帶在1 500 bp 左右(圖2)。經(jīng)BLAST在線比對：32株分離株與肺炎克雷伯菌的同源性高于99%，確定為肺炎克雷伯菌。

M.DL2000 DNA Marker;1～12.菌株;13.陰性對照圖2 部分分離株16S rDNA PCR檢測

2.4 小鼠致病性試驗165只BALB/c小鼠，隨機(jī)分成33組，每組5只。第1～32組為試驗組，第33組為對照組。各試驗組小鼠接種肺炎克雷伯菌后，出現(xiàn)精神沉郁、結(jié)膜蒼白、流淚、抽搐等癥狀(圖3)。3 d內(nèi)，28個試驗組的小鼠全部死亡，致死率為87.5%(28/32)。其余4組，2～5 d表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退，部分出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。剖檢死亡小鼠(圖4～5)，可見腸壁變薄，腸腔內(nèi)充氣，腸黏膜出血，肺臟嚴(yán)重充血、淤血、水腫、纖維化，其他實質(zhì)內(nèi)臟器官充血、淤血；對照組剖檢正常(圖6)。取小鼠心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟等組織進(jìn)行涂片染色鏡檢，可見革蘭陰性短桿菌。挑取病變組織接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，可見典型的肺炎克雷伯菌菌落生長。

圖3 小鼠攻毒后臨床癥狀

圖4 攻毒組小鼠剖檢變化

圖5 攻毒后實質(zhì)器官病變

圖6 對照組的實質(zhì)器官

2.5 藥敏試驗32株肺炎克雷伯菌對恩諾沙星的敏感率最高(96.875%，31/32)，對多黏菌素B、阿米卡星的敏感率分別為93.750%(30/32)，90.625%(29/32)；對氨芐西林的耐藥率最高(100.0%)，對多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、頭孢唑啉的耐藥率分別為87.500% (28/32)，84.375% (27/32)，87.500% (28/32) (表1)。

表1 32株肺炎克雷伯菌的藥敏試驗

由表2可知，32株分離菌中耐7種藥物的最多，占分離菌株的34.3%。

表2 32株分離株多重耐藥性

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析根據(jù)多重耐藥結(jié)果，選取同時對7種及以上抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌為代表菌株，命名為KP-SJ-1、KP-SJ-2、KP-SJ-3～17。如圖7所示，17個代表菌株中KP-SJ-1～16與K.PneumoniaeR-70聚為一簇，表明這16株菌與K.PneumoniaeR-70親緣關(guān)系近；KP-SJ-17與K.Pneumoniaesubsp.PneumoniaeDSM 30104位于同一分支，置信率大于90%。

圖7 17株代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.7 治療試驗將最敏感的恩諾沙星用于治療試驗，中藥選用麻杏石甘散。本試驗32頭患病奶牛分為4組：A組(恩諾沙星治療組，8頭)，恩諾沙星注射液 30 mg/kg，肌肉注射，每天2次，連用7 d；B組(麻杏石甘散治療組，8頭)，麻杏石甘散 0.4 g/kg，拌料，每天2次，連用7 d；C組(恩諾沙星+麻杏石甘散治療組，8頭)，恩諾沙星注射液(30 mg/kg，肌肉注射)+麻杏石甘散(0.4 g/kg，拌料)，每天2次，連用7 d；D組(患病組，8頭)，不予治療；選8頭年齡相近，并處于同一階段的健康奶牛設(shè)為E組，作為對照組。治療結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果顯示，7 d后，C組的治愈率最高(100.0%)；A和B組的治愈率分別為75.0%(6/8)和62.5%(5/8)。B和D組的死亡率分別為12.5%(1/8)和37.5%(3/8)。恩諾沙星和麻杏石甘散聯(lián)合應(yīng)用，治療效果最佳。

表3 肺炎克雷伯菌所致奶牛肺炎的治療效果(n=8)

3 討論

肺炎克雷伯菌屬于條件性致病菌，能引起多種動物的敗血癥，發(fā)病率和死亡率較高[7]。此次試驗中，從84份樣品中分離得到32株肺炎克雷伯菌，分離率為38.10%，重慶某地的分離率達(dá)19.70%[8]，江蘇某地的分離率為6.27%[9]，西藏部分地區(qū)的分離率為7.76%[10]，表明肺炎克雷伯菌的分離率存在地域性差異。此次分離的肺炎克雷伯菌對小鼠致死率為87.50%。本試驗分離的菌株具有較高的分離率和較強(qiáng)的致病性，應(yīng)引起足夠重視。

生化鑒定結(jié)果與王樂等[11]報道的奶牛源肺炎克雷伯菌的生化鑒定結(jié)果基本一致。此外16S rDNA序列分析是一種能彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定法中的不足，能對細(xì)菌進(jìn)行高效鑒定的一種方法[3]。對分離株的16S rDNA序列分析結(jié)果表明，該菌與肺炎克雷伯菌的同源性達(dá)到99.0%以上，說明在應(yīng)用傳統(tǒng)方法進(jìn)行細(xì)菌鑒定的同時，結(jié)合使用16S rDNA鑒定法，能更準(zhǔn)確地得出結(jié)果。

在獸醫(yī)臨床上，由于抗生素大量使用，肺炎克雷伯菌會產(chǎn)生抗生素水解酶，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使細(xì)菌所致疾病的防治變得困難[12]。藥敏試驗顯示，肺炎克雷伯菌對不同的抗生素的敏感性不同：在β-內(nèi)酰胺類抗生素中，對氨芐西林、頭孢唑啉和頭孢曲松的敏感率在21.875%以下，這與王樂等[11]對奶牛乳房炎肺炎克雷伯菌的研究結(jié)果一致。在氨基糖苷類抗生素中，對鏈霉素、慶大霉素的敏感率在31.250%以下。在四環(huán)素類抗菌藥中，對多西環(huán)素的敏感率在12.500%以下。在磺胺類藥物中，對復(fù)方新諾明的敏感率僅為15.625%。對多西環(huán)素和復(fù)方新諾明的敏感率較低的原因可能在于這些藥物的使用頻率高，在治療時盡量減少此類藥物的使用。所有菌株對氨芐西林均耐藥，林雅等[8]對肉牛上呼吸道分離出的肺炎克雷伯菌耐藥性進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)氨芐西林的耐藥率為100.00%，這與本研究結(jié)果一致。從分離菌株的多重耐藥結(jié)果來看，耐7種抗生素的分離菌株最多，占分離菌的34.30%。杜琳等[7]報道了我國部分地區(qū)奶牛克雷伯菌的多重耐藥率為54.35%，這與本試驗結(jié)果一致，說明肺炎克雷伯菌的耐藥情況呈嚴(yán)重趨勢。由進(jìn)化樹可知，17株耐藥性較強(qiáng)的代表菌株中的大部分在同一分支上，表明部分多重耐藥性強(qiáng)的菌株存在較近的親緣關(guān)系。此次分離的菌株對喹諾酮類抗菌藥恩諾沙星均敏感。在此次研究中發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對阿米卡星的敏感率較高為90.625%，高亞桃等[13]對河北省奶牛呼吸道病病原進(jìn)行檢測,同樣發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌對阿米卡星中度敏感，說明阿米卡星可以作為治療藥物進(jìn)行選擇。SUH等[14]在韓國肺炎克雷伯菌的耐藥性研究中顯示部分菌株對黏菌素敏感，韓坤等[15]對貂源肺炎克雷伯菌研究結(jié)果顯示，所有分離株都對多黏菌素敏感，王佳佳等[16]對兔源肺炎克雷伯菌進(jìn)行鑒定時發(fā)現(xiàn)其對多黏菌素B敏感，本研究中肺炎克雷伯菌對多黏菌素B的敏感率為93.750%，這與上述研究結(jié)果相符，說明地區(qū)和物種不同，不會影響肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性。

在治療效果方面，麻杏石甘散具有清肺化痰、止咳平喘等作用[17]，恩諾沙星對克雷伯菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，本試驗中C組的治療效果頗為顯著，說明中西藥結(jié)合治療的方式最佳。

在奶牛肺炎的治療上，建議奶牛場先進(jìn)行病原體的分離鑒定和藥敏試驗，選出有效的抑菌藥物，結(jié)合傳統(tǒng)的中獸醫(yī)療法，以達(dá)到良好的治療效果。同時，要加強(qiáng)對此類疫病的監(jiān)測，合理使用藥物，來有效地控制奶牛肺炎。