一種基于凝膠過濾層析的水皰性口炎病毒(VSV)的純化方法

孫 赫，岳玉環(huán)，趙永坤，吳廣謀，田 園，張守峰，張國(guó)利*，李澤鴻 (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 1301)

水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)作為21世紀(jì)最有應(yīng)用前景的癌癥治療載體而備受關(guān)注。VSV可以引起馬、牛和豬等的高度接觸傳染性水皰性疾病，屬于定義明確的彈狀病毒科；臨床上受感染動(dòng)物以口腔黏膜、牙墊、舌頭、嘴唇、鼻孔、蹄子和乳頭的典型水泡為主要特征，很容易和口蹄疫、豬水皰病、豬水皰疹等相混淆[1]。據(jù)查證，多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有易感性，人只是偶爾感染，產(chǎn)生類似流感樣癥狀；可以判斷此病毒具有潛在的人畜共患性[2]，并可能在與病毒密切接觸的人群中引起流感樣疾病。

VSV主要有2種血清型，分別為水皰性口炎印第安納病毒(vesicular stomatitis Indiana virus，VSV-IND)和水皰性口炎新澤西州病毒(vesicular stomatitis New Jersey virus，VSV-NJ)。不同血清型的VSV基因組長(zhǎng)度略有差異，但基因組織和構(gòu)成相似；長(zhǎng)11.0～11.3 kb，具有最簡(jiǎn)單的基本結(jié)構(gòu)，負(fù)鏈RNA從基因組的3′→5′端依次編碼核蛋白(nucleoprotein，N)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)、糖蛋白(glycoprotein，G)、大轉(zhuǎn)錄酶蛋白(large transcriptase protein，L)5種蛋白[3]。N蛋白為病毒衣殼蛋白的主要成分，保護(hù)著病毒RNA免受各種核酸酶的消化，相對(duì)分子質(zhì)量為47 kDa；P蛋白由222個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為25 kDa；M蛋白是一種連接蛋白，能夠使核衣殼與嵌有糖蛋白的脂質(zhì)膜相連，相對(duì)分子質(zhì)量為26 kDa；G蛋白是病毒的主要表面抗原，相對(duì)分子質(zhì)量為57 kDa；L蛋白決定著病毒RNA的轉(zhuǎn)錄活性，相對(duì)分子質(zhì)量為241 kDa[4]?；蚪M上的基因轉(zhuǎn)錄以遞減的產(chǎn)量進(jìn)行，原因是由于3′啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性在每個(gè)基因連接處減弱，病毒基因組的3′端基因轉(zhuǎn)錄更加豐富，近于5′端少量轉(zhuǎn)錄。

在過去的幾十年里，慢病毒基因療法在研究和臨床上的出現(xiàn)和成功，而成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[5]。VSV糖蛋白微型載體，在基因治療和基因編輯應(yīng)用方面具有未開發(fā)的潛力[6]。此外，由于其多功能性，VSV模型已廣泛應(yīng)用于癌癥、腫瘤治療，作為一種有效的溶瘤病毒[7]、疫苗載體和研究異源病毒包膜蛋白的基因傳遞工具。要最大限度地發(fā)揮這類媒介的潛力，病毒的純化是必不可少的?，F(xiàn)有的病毒純化方法主要分為2種，分別是密度梯度離心法和層析法[8]。層析法相比較密度梯度離心法而言，更具專業(yè)性和規(guī)范性，適用于生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practices，GMP)和批量生產(chǎn)。本研究通過凝膠過濾層析法對(duì)收獲的病毒液上清進(jìn)行2輪的蛋白純化，經(jīng)鑒定后，最終得到純度較高的VSV純品。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibico公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；T25、T75培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning公司)；BHK細(xì)胞系(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所夏咸柱院士贈(zèng)予)；1.5 mL 無酶離心管(美國(guó)Axygen公司)；VSV毒株(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所生物技術(shù)應(yīng)用與基因工程藥物實(shí)驗(yàn)室保存)；Millex-GP針頭式0.22 μm濾膜(美國(guó)Millipore公司)；PBS緩沖液(武漢莫納生物有限公司)；硫酸銨顆粒、HRP抗體稀釋液、牛血清白蛋白(北京索萊寶股份有限公司)；10 000 kDa超濾離心管(美國(guó)Merck公司)；VSV-G-Tag抗體、羊抗兔IgG-HRP(武漢博士德生物有限公司)；ProteinA-HRP(美國(guó)Abcam公司)；Focurose 6FF(武漢匯研生物有限公司)；一步式RT-PCR試劑盒、病毒RNA提取試劑盒(日本TaRaKa公司)。

1.2 VSV的制備從液氮中取出凍存的BHK細(xì)胞，于37℃水浴快速融化，300×g離心3 min后接種T75培養(yǎng)瓶中；每個(gè)T75培養(yǎng)瓶的BHK細(xì)胞密度約為6×106cell/mL，每瓶加入15 mL新鮮配置的含10%胎牛血清的DMEM(1%青霉素和鏈霉素)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，開始加入VSV毒株感染細(xì)胞；與此同時(shí)，培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基也相應(yīng)換成1%胎牛血清的DMEM(1%青霉素和鏈霉素)。

1.3 病毒液的收集及預(yù)處理密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞開始出現(xiàn)CPE反應(yīng)后，相隔2 h觀察1次；如出現(xiàn)60%～70% CPE反應(yīng)后，細(xì)胞刮片刮離細(xì)胞，移液器反復(fù)吹洗瓶壁上的細(xì)胞數(shù)次，使病毒粒子完全從細(xì)胞中釋放出來。將收集的病毒液在-80℃和0℃之間反復(fù)凍融3～5次，12 000×g離心15 min后棄去沉淀，取上清置于-80℃保存。

1.4 VSV的純化緩沖液的配置：將PBS(0.1 mol/L)速溶試劑置于1 L超純水中，調(diào)pH 7.2；取4 g NaOH固體加入1 L超純水，配置NaOH(0.1 mol/L)溶液。通過Waters高壓液相純化系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)按照以下步驟，即可得到高純度的VSV。

第1輪純化：取融化后的病毒液上清100 mL，根據(jù)飽和硫酸銨計(jì)算表，取26 g硫酸銨加入病毒液中，玻璃棒攪拌均勻，形成42.35%飽和硫酸銨溶液，4℃靜置30 min。12 000×g離心15 min后棄上清，將沉淀全部溶解在2 mL PBS中，0.22 μm濾膜過濾后備用。

第2輪純化：用500 mL PBS平衡Focurose 6FF柱，流速為1 mL/s。柱床平衡后，設(shè)置吸光度為280 nm，檢測(cè)器調(diào)零。將第1輪純化的病毒液上樣，密切關(guān)注吸收峰值圖。選取各個(gè)吸收峰收集，目標(biāo)吸收峰為第1次出現(xiàn)的吸收峰，取第1吸收峰的樣品用10 kDa的超濾離心管進(jìn)行濃縮。當(dāng)所有吸收峰最后歸于平衡后，使用0.1 mol/L NaOH清洗柱床，水洗后1‰疊氮鈉封柱。通過SDS-PAGE對(duì)收集的純化樣品進(jìn)行分析，依據(jù)條帶位置判斷純化樣品的準(zhǔn)確性。

1.5 ELISA、Western blot分析病毒的免疫原性ELISA：取純化VSV樣品用碳酸鹽緩沖液10倍稀釋包被于酶標(biāo)板中，每孔100 μL，37℃靜置1 h；5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，加入稀釋1 000倍的VSV-G-Tag抗體孵育1 h；PBST洗滌后，二抗為2 000倍稀釋的ProteinA-HRP孵育1 h；洗滌后TMB顯色15 min，每孔50 μL終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀D450 nm檢測(cè)數(shù)值。

Western blot：取純化VSV樣品進(jìn)行SDS-PAGE，切膠后轉(zhuǎn)硝化纖維素薄膜，15 V 1 h，用含5% BSA的TBS室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；加入1 000倍稀釋的VSV-G-Tag抗體室溫孵育2 h；TBST洗滌后，加入2 000倍稀釋的羊抗兔IgG-HRP孵育2 h，洗滌后ECL法上機(jī)(Tanon5200，上海天能科技有限公司)檢測(cè)。

1.6 RT-PCR鑒定病毒的血清型據(jù)NCBI庫(kù)中已知的VSV-IND-P和VSV-NJ-L基因序列設(shè)計(jì)特異性引物[9]，分別為VSV-IND-P：F-5′-GCAGATGATTCTGACAC-3′，R-5′-GACTCTCGCCTGATTGTA-3′；VSV-NJ-L：F-5′-TTGGTTCGGAACTTGGATTC-3′，R-5′-ACTCATGCGGTATTTACCCTTG-3′。根據(jù)說明，使用病毒總RNA提取試劑盒從純化病毒液中提取RNA。采用一步式RT-PCR試劑盒擴(kuò)增相應(yīng)的蛋白基因片段，反應(yīng)體系在50 μL溶液中進(jìn)行：Enzyme Mix 2 μL、Buffer 25 μL、VSV-IND-P/VSV-NJ-L正、反向引物各2 μL、RNA 1 μL、dH2O 20 μL。反應(yīng)條件：50℃ 30 min、95℃ 15 min預(yù)變性；94℃ 1 min 變性，50℃ 1 min退火，72℃ 3 min延伸，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min、4℃孵育10 min，2%瓊脂糖凝膠電泳分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50將純化的VSV用1%DMEM在滅菌試管內(nèi)作連續(xù)的10倍稀釋，分別取0.1 mL加入已經(jīng)長(zhǎng)成單層的Wish細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中。每個(gè)稀釋度的病毒液接種8個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2連續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察，直至終點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)后按照公式計(jì)算：(高于50%病毒感染的百分率-50%)/(高于50%病毒感染的百分率-低于50%病毒感染的百分率)；上式獲得的結(jié)果加上高于50%病毒感染或死亡稀釋度的對(duì)數(shù)，即0.1 mL VSV病毒液的TCID50。

1.8 VSV成品的電鏡分析將VSV病毒懸液滴在封口膜上，使用支持膜的載網(wǎng)倒扣在懸液上靜置2 min。夾起載網(wǎng)，用濾紙從載網(wǎng)邊緣吸去多余液體，立即將載網(wǎng)倒扣在負(fù)染液滴上2%磷鎢酸水溶液(PTA)(pH6.8)，靜置1～2 min。夾起載網(wǎng)，用濾紙吸去多余染液，置透射電子顯微鏡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 VSV的純化結(jié)果由于細(xì)胞上清VSV病毒液中含有部分牛血清成分，極難通過密度梯度離心完全去除。為此探索了其他純化路徑，經(jīng)過不同濃度的飽和硫酸銨試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)42.35%的飽和硫酸銨可以沉降極大部分病毒顆粒和很少部分的其他雜質(zhì)成分，如此便成功進(jìn)行了第1輪高鹽除雜，達(dá)到了初步純化的目的。在第2輪凝膠過濾層析結(jié)果中，分析吸收峰曲線(圖1)和SDS-PAGE(圖2)。吸收峰曲線中可以看到病毒粒子的特征吸收峰高度達(dá)到了0.90，相比而言，雜蛋白的吸收峰峰值僅有0.13，說明了第1輪凝膠過濾層析中已經(jīng)完整的把大部分VSV純化出來。同時(shí)也在SDS-PAGE結(jié)果圖中印證了這一結(jié)果，在泳道1中蛋白成分特別復(fù)雜，說明仍有一部分培養(yǎng)基成分；而在泳道2～4中，條帶單一，目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為47 kDa，與VSV的N蛋白大小一致，其余病毒蛋白由于表達(dá)量的原因未顯影。經(jīng)過2輪純化，成功純化出含量較多純度尚可的VSV粒子。

圖1 VSV純化曲線圖

M.蛋白Marker；1.42.35%飽和硫酸銨沉淀結(jié)果；2～4.VSV純化吸收峰的特征峰型；5.雜蛋白吸收峰的峰尖樣品圖2 純化VSV的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

M.蛋白 Marker；1.純化樣品圖3 純化樣品Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3 VSV血清型的鑒定RT-PCR 擴(kuò)增病毒蛋白基因，分析2%瓊脂糖凝膠電泳圖，在泳道2～4可以看到614 bp的明顯條帶(圖4)，泳道5～7沒有觀察到明顯條帶，說明此毒株為VSV-IND血清型。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2～4.VSV-IND-P樣品；5～7.VSV-NJ-L樣品圖4 純化樣品RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 VSV的滴度測(cè)定根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算培養(yǎng)3 d后病毒的TCID50(表1)，(92.3%-50.0%)/(92.3%-33.3%)+2≈2.72，因此該病毒的TCID50是0.1 mL 10-2.72稀釋的病毒液，查反對(duì)數(shù)得524，即該病毒524倍的稀釋液0.1 mL 等同于1個(gè)TCID50。

表1 TCID50的測(cè)定結(jié)果

2.5 VSV的電鏡觀察分析電鏡結(jié)果(圖5)，該病毒顆粒大小為(45～70) nm×(100～200) nm，在電鏡下呈子彈狀或錐體狀，未經(jīng)固定的樣品呈多邊形，符合彈狀病毒的基本特征。

綜上試驗(yàn)結(jié)果可以看出，通過2輪純化步驟成功地獲得了VSV，成功達(dá)到了預(yù)期結(jié)果，最終純化樣品滴度合格、純度可觀，且仍具有VSV的活性和免疫原性。

3 討論

VSV作為彈狀病毒的基本模型，在越來越多的領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)了其強(qiáng)大用途[11]。在疫苗研究方面，基于VSV改良的重組病毒疫苗載體防制傳染病方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。由于VSV具有遺傳穩(wěn)定性、低毒性、高滴度性的特點(diǎn)，重組VSV疫苗平臺(tái)相當(dāng)火熱，例如Erbevo品牌出售的rVSV-ZEBOV疫苗于2019年獲準(zhǔn)在美國(guó)和歐盟使用[12]。在癌癥治療方面，VSV成為溶瘤載體的主要候選物[13]，其腫瘤選擇性和溶解潛力已被證明可用于多種癌癥類型，包括宮頸癌和乳腺癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等[14-16]。

作為如此強(qiáng)大的基因治療模型，少不了高純度的病毒純化步驟。在本研究中，通過對(duì)不同飽硫酸銨濃度的探究，最終鎖定42.35%的飽和硫酸銨濃度，可以達(dá)到既滿足大量VSV沉降的目的，又滿足少量雜蛋白存在的情況。所以增設(shè)了第1輪飽和硫酸銨沉淀高鹽除雜的步驟，但仍有不足，根據(jù)試驗(yàn)SDS-PAGE結(jié)果，還可以更加細(xì)化飽和硫酸銨濃度以及增加其他蛋白純化步驟。在病毒原液上清中，發(fā)現(xiàn)了病毒粒子的大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他雜蛋白的大小，所以選用了凝膠過濾層析的方法[17]，由于分子篩的效應(yīng)，大分子物質(zhì)由于通過路程較短會(huì)率先通過層析柱，而相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)會(huì)進(jìn)入層析柱材料內(nèi)部，通過的路程將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過大分子蛋白，據(jù)此從而達(dá)到分離目的蛋白的目的[18]；由于柱料是高度交聯(lián)6%的瓊脂糖，同時(shí)也起到了保護(hù)目的蛋白的作用。從VSV純化曲線峰圖結(jié)果來看，正好印證這一原理。分析2輪的純化步驟，發(fā)現(xiàn)如不通過飽和硫酸銨沉淀，直接進(jìn)行凝膠過濾層析，會(huì)大大影響目的病毒粒子的純化效率和純度。通過簡(jiǎn)單的處理，分2步進(jìn)行純化，非常有利于高純度病毒粒子的制備。綜上，本研究通過借鑒和摸索，成功開創(chuàng)出一套簡(jiǎn)易實(shí)用的VSV純化方案，整個(gè)過程用時(shí)較短、省錢省工，普通實(shí)驗(yàn)室當(dāng)日即可完成。同時(shí)，凝膠過濾層析很容易符合GMP藥物生產(chǎn)規(guī)范，為VSV基因藥物模型的研究和改造奠定了有力的基礎(chǔ)。