烤煙新品系‘獅柳煙’的特征特性及SSR分子標記鑒定

李顯富 楊惠 安雪琴 王陳梓駿 戴秀梅 張建奎

摘要：為了培育烤煙新品種，提高煙葉產量和質量，滿足煙草生產對烤煙新品種的需求，本研究從貴州省石阡縣栽種多年的地方煙草品種中系統(tǒng)選育出了優(yōu)良烤煙新品系‘獅柳煙’。以烤煙主栽品種‘K326’和‘云煙87’作為對照，通過連續(xù)三年田間試驗和實驗室品質測試，對‘獅柳煙’的植物學性狀、農藝性狀、經濟性狀、煙葉外觀質量、物理指標、化學成分、感官評吸質量進行評價，并建立其SSR分子標記。結果表明，‘獅柳煙’平均單株留葉數(shù)24片/株，分別比‘K326’、‘云煙87’多3片/株、5片/株；平均單產2233.4 kg/hm2，均價24.47元/kg，產值54434.2元/hm2，上等煙率51.11%，上中等煙率94.81%，經濟指標優(yōu)于‘K326’和‘云煙87’；煙葉顏色為檸檬黃，外觀品質較好，化學成分協(xié)調性好，感官評吸品質優(yōu)于對照；SSR分子標記引物PT3024、PT40021可以穩(wěn)定地在‘獅柳煙’與‘K326’和‘云煙87’之間擴增出特異性條帶。因此，‘獅柳煙’產量高、質量優(yōu)，是一個高產優(yōu)質烤煙新品系。

關鍵詞：烤煙（Nicotiana tabacum L.）；選擇育種；‘獅柳煙’；SSR分子標記

中圖分類號：S572文獻標志碼：A論文編號：cjas20191200290

Identification of Characteristics and SSR Molecular Markers of A New Flue-cured Tobacco Strain‘Shiliuyan’

LI Xianfu1， YANG Hui2， AN Xueqin1， WANG Chenzijun2， DAI Xiumei2，3， ZHANG Jiankui2，3（1Tongren Branch of Guizhou Tobacco Corporation， Tongren 554300， Guizhou， China；2College of Agronomy and Biotechnology/ Engineering Research Center of Southern Upland Agriculture， Ministry of Education， Southwest University， Chongqing 400715， China；3Chongqing Tobacco Science Research Institute， Chongqing 400715， China）

Abstract： The objective is to breed new varieties of flue-cured tobacco， improve the yield and quality of tobacco leaves and meet the needs of tobacco production. A new flue-cured tobacco strain‘Shiliuyan’was selected from the local tobacco varieties planted in Shiqian County of Guizhou Province. Using the main commercial varieties‘K326’and‘Yunyan87’as control， the botanical characters， agronomic traits， economic characters， appearance quality， physical indexes， chemical components and sensory evaluation quality of tobacco leaves of‘Shiliuyan’were evaluated through field tests and laboratory quality tests of three consecutive years. The SSR molecular markers of‘Shiliuyan’were also established. The results showed that the number of effective leaves per plant of‘Shiliuyan’was 24， 3 leaves more than‘K326’and 5 leaves more than‘Yunyan87’， respectively. The economic indicators of‘Shiliuyan’， including the yield of 2233.4 kg/hm2， average price of 24.47 Yuan/kg， production value of 54434.2 Yuan/hm2， the rate of superior grade leaves of 51.11% ， the rate of superior and middle grade leaves of 94.81% ， were better than those of‘K326’and‘Yunyan87’. The color of tobacco leaves of‘Shiliuyan’was lemon yellow， and the strain had good appearance quality， good coordination of chemical components and better sensory evaluation quality than those of the control. The SSR molecular marker primer PT3024 and PT40021 could stably amplify specific bands among‘Shiliuyan’，‘K326’and‘Yunyan87’. In brief，‘Shiliuyan’is a new flue-cured tobacco strain with high yield and good quality of tobacco leaves.

Keywords： Flue-cured Tobacco （Nicotiana tabacum L.）； Selection and Breeding；‘Shiliuyan’； SSR Molecular Marker

0引言

煙草品種是煙葉生產的基礎，通過品種改良提高煙葉品質和產量，以滿足卷煙工業(yè)的要求，是一條投資少、收效大的途徑。據(jù)報道，煙草品種對煙葉產量的貢獻率約為20%～35%，對煙葉品質的貢獻率高達50%[1-2]。中國煙草生產長期以來一直存在栽培品種單一化問題，目前主要推廣烤煙品種局限在‘云煙87’、‘K326’等少數(shù)品種，其中，‘K326’是美國諾斯樸金種子公司（Northup King Seed Company）于1981年育成的烤煙良種，由雜交組合McNair 225（McNair30×NC95）雜交選育而成，中國于1985年從美國引進了該品種[3]，1989年通過全國煙草品種審定委員會審定后開始推廣，至今在中國已經推廣栽培了35年；‘云煙87’是云南省煙草農業(yè)科學研究院從云煙二號與‘K326’的雜交后代中系譜選擇而成的烤煙品種，2000年通過全國煙草品種審定委員會審定[4]，在中國已經推廣應用了20年。‘K326’和‘云煙87’這2個品種不僅推廣年限長，而且還存在較強的親緣關系，已出現(xiàn)抗病性、煙葉產量和品質下降的問題。中國煙區(qū)面積大，幅員廣闊，生態(tài)條件差異大，急需各地因地制宜選育當?shù)氐奶厣緹熎贩N，以滿足生產需求。選擇育種（selection breeding）是根據(jù)育種目標，對現(xiàn)有品種群體中出現(xiàn)的自然變異類型進行選擇鑒定和比較試驗，培育作物新品種的育種途徑，是最早應用于育種實踐，而現(xiàn)在和將來仍不失其應用價值的育種途徑。本研究采用選擇育種途徑，從貴州省石阡縣本莊鎮(zhèn)獅柳村栽種多年的地方煙草品種中系統(tǒng)選育出了一個優(yōu)良烤煙新品系‘獅柳煙’。對烤煙新品系‘獅柳煙’的性狀表現(xiàn)及其特異性進行鑒定，為其進一步應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1參試品種（系）

烤煙新品系‘獅柳煙’由貴州省煙草公司銅仁市公司從貴州省石阡縣本莊鎮(zhèn)獅柳村栽種多年的地方煙草品種中選出優(yōu)良單株，2013—2016年分別于春秋兩季在貴州銅仁和海南陵水兩地加代，經進一步單株選擇、套袋自交保純選育而成。本研究以全國性烤煙推廣品種‘K326’作為主對照，以西南地區(qū)的烤煙主栽品種‘云煙87’為副對照。

1.2試驗方法

1.2.1田間試驗方法2016—2018連續(xù)3年在貴州銅仁進行品種比較試驗，試驗地位于松桃縣大興鎮(zhèn)，土壤類型為黃泥土，海拔730 m，試驗地土地平整，肥力均勻。試驗采用隨機區(qū)組設計，3次重復。

1.2.2植物學與農藝性狀調查方法依據(jù)中國煙草行業(yè)標準《YC/T 142—2010煙草農藝性狀調查方法》，根據(jù)參試品種（系）的整體表現(xiàn)，定性調查參試品種（系）的株型、葉形、葉耳、葉面、葉尖、葉緣等植物學性狀。每個試驗小區(qū)選擇20株，定量測定株高、莖圍、節(jié)距、有效葉數(shù)、腰葉長、腰葉寬、大田生育期等農藝性狀指標。

1.2.3經濟性狀調查方法在煙葉生長成熟后，分品種（系）、按小區(qū)進行采收、烘烤、分級、稱重，以此計算經濟性狀指標。

煙葉采收根據(jù)煙葉田間長勢長相，嚴格把握煙葉田間成熟度，按照“按部位采收、多熟多采、少熟少采、不熟不采”的原則。下部葉適時早收，成熟標準宜寬；中部葉適熟采收，成熟標準宜嚴；上部葉充分成熟采收，頂部4～6片葉成熟后集中一次采烤。

煙葉烘烤采用三段式烘烤工藝進行烘烤，第一階段為變黃階段，高溫高濕變黃，高溫充分變黃；第二階段為定色階段，低溫低濕定色，緩慢升溫定色；第三階段為干筋階段，重視濕球溫度，降低干筋溫度。

煙葉分級依據(jù)中國煙草行業(yè)標準《GB/T 2635—1992烤煙》對煙葉進行分組、分級。上等煙包括11個等級，中等煙包括19個等級，下等煙包括12個等級。煙葉分級后對不同品種（系）、不同小區(qū)、不同等級的煙葉分別進行稱重，計算單位面積產量（kg/hm2）、單位面積產值（元/hm2）、均價（元/kg）、上等煙比例（%）、中等煙比例（%）。計算見公式（1）～（5）。

1.2.5煙葉化學成分測定測定了煙葉樣品的總糖、還原糖、總植物堿、總氮（N）、鉀（K2O）、氯（Cl）、石油醚提取物、總粒相物含量，并計算了糖堿比值、氮堿比值、鉀氯比值。其中，總糖、還原糖、總植物堿、總氮（N）、鉀（K2O）、氯（Cl）含量的測定均采用連續(xù)流動法，分別依據(jù)煙草行業(yè)標準YC/T 159—2002、YC/T 160—2002、YC/ T 161—2002、YC/T 217—2007、YC/T 162—2011。石油醚提取物的測定以石油醚為提取劑，用索氏提取器進行提取，依據(jù)質量法公式計算石油醚提取物含量[5]。總粒相物含量測定方法是將煙葉切絲并卷制成單料煙支，采用中國煙草行業(yè)標準《YC/T 29—1996卷煙用常規(guī)分析用吸煙機測定總粒相和焦油》規(guī)定的方法進行測定。

1.2.6煙葉感官質量評價依據(jù)煙草行業(yè)標準YC/T 138—1998、GB 5606.4—2005規(guī)定的方法，從香型、勁頭、濃度、香氣質、香氣量、余味、雜氣、刺激性、燃燒性、灰色等方面評價各參試品種（系）的感官質量，其中，香型、勁頭、濃度采用定性判斷，其余指標采用打分評價，各指標分值分別為香氣質15分，香氣量20分，余味25分，雜氣18分，刺激性12分，燃燒性5分，灰色分5，總分100分。

1.2.7 SSR分子標記鑒定分子標記鑒定所用的基因組DNA的提取采用改良CTAB法，引物為本實驗室篩選出的15對煙草SSR核心引物，其中引物PT20213、PT30021、PT30028、PT30159、PT30224、PT30259、PT30380、PT30399、PT30403、PT30424、PT30470、PT40021、PT40024、PT30421的序列參見文獻[6]，PT30368引物序列為TCACCAATTATGCCGATTCA、CACACACTTGTTTGGAATTGAGA。用System-9700型擴增儀進行PCR擴增。擴增體系為10μL，包括PCR Mix 5μL，正反引物各0.5μL，模板DNA 1μL。PCR擴增程序為94℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)，72℃10 min。用2%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳，然后照相、讀取記錄特征譜帶。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用田間試驗統(tǒng)計方法處理數(shù)據(jù)。

2結果與分析

2.1烤煙新品系‘獅柳煙’的主要植物學性狀和農藝性狀表現(xiàn)

從主要植物學性狀和農藝性狀的比較（表1）可以看出，‘獅柳煙’的株型為筒形，葉片為長橢圓形，葉耳較小，葉面較皺，葉尖為急尖，葉緣較平，與對照品種‘K326’和‘云煙87’相比存在明顯的差異?！{柳煙’的平均株高125 cm，顯著高于‘K326’（106 cm）和‘云煙87’（115 cm）；其莖圍9.5 cm，比‘K326’（9.2 cm）和‘云煙87’（8.8 cm）更粗；其節(jié)距5.0 cm，介于‘K326’（4.7 cm）和‘云煙87’（5.1 cm）之間。葉片數(shù)多是‘獅柳煙’的1個顯著特征，其有效葉片數(shù)平均為24片/株，顯著多于‘K326’（21片/株）和‘云煙87’（19片/株），具備了現(xiàn)階段煙葉等級結構調整的足夠有效葉，從而保障了單位面積效益穩(wěn)定?！{柳煙’的葉片較大，腰葉長86 cm，腰葉寬40 cm，都大于對照品種‘K326’和‘云煙87’?！{柳煙’的大田生育期為130天，頂葉采收時間比‘云煙87’晚5天，與‘K326’相同。

2.2烤煙新品系‘獅柳煙’的主要經濟性狀表現(xiàn)

從‘獅柳煙’與對照品種‘K326’和‘云煙87’的主要經濟性狀表現(xiàn)（表2）可以看出，‘獅柳煙’的煙葉產量2016—2018年連續(xù)3年都居第1名，都比對照品種‘K326’和‘云煙87’增產，3年平均單產為2233.4 kg/hm2，顯著高于‘K326’的1740.2 kg/hm2和‘云煙87’的1448.7 kg/hm2，比‘K326’和‘云煙87’的增產幅度分別達到28.35%和54.17%；‘獅柳煙’的煙葉產值也連續(xù)3年位居第1名，3年平均產值為54434.2元/hm2，顯著高于‘K326’的38628.8元/hm2和‘云煙87’的31667.5元/hm2，比‘K326’和‘云煙87’的增收幅度分別達到40.92%和71.89%；‘獅柳煙’的煙葉均價也連續(xù)3年位居第1名，3年平均均價為24.47元/kg，比‘K326’的22.25元/kg和‘云煙87’的21.96元/kg分別增加了2.22、2.51元/kg；‘獅柳煙’的上等煙率連續(xù)3年位居第1名，3年平均為51.11%，分別比對照‘K326’（44.88%）和‘云煙87’（42.14%）提高了6.23和8.97個百分點；‘獅柳煙’的上中等煙率2016—2017年都位于第1名，2018年低于‘K326’位居第2位，3年平均值為94.81%，分別比對照‘K326’（87.84%）和‘云煙87’（84.97%）提高了6.97和9.84個百分點?？梢钥闯觯{柳煙’的經濟性狀表現(xiàn)非常優(yōu)異且穩(wěn)定，顯著優(yōu)于對照品種‘K326’和‘云煙87’。

2.3烤煙新品系‘獅柳煙’的原煙外觀品質表現(xiàn)

從‘獅柳煙’與對照品種‘K326’和‘云煙87’的原煙外觀品質和物理特性比較可以看出（表3），‘獅柳煙’的成熟度較好，與‘K326’和‘云煙87’一致；油分為“稍有”，比對照品種表現(xiàn)稍差；葉片厚度與‘云煙87’相當，比‘K326’稍?。蝗~片結構疏松，與對照品種一致；煙葉顏色為檸檬黃，比‘K326’和‘云煙87’稍淡；單葉質量9.5 g，比‘云煙87’（9.3 g）稍重，比‘K326’（10.0 g）稍輕；含梗率較高34.0%，高于‘K326’（33.7%）和‘云煙87’（33.0%）。

2.4烤煙新品系‘獅柳煙’的化學成分表現(xiàn)

從‘獅柳煙’與對照品種‘K326’和‘云煙87’的化學成分可以看出（表4），‘獅柳煙’的總糖、還原糖、總植物堿、總氮、鉀、氯等常規(guī)化學成分的含量及糖堿比、氮堿比、鉀氯比均處于優(yōu)質煙葉的標準范圍內?！{柳煙’的總糖含量（30.89%）和還原糖含量（22.18%）比‘K326’和‘云煙87’稍低，總植物堿含量（2.14%）和氯含量（0.36%）介于‘K326’和‘云煙87’之間，總氮含量（1.62%）和鉀含量（2.73%）稍高于‘K326’和‘云煙87’，‘獅柳煙’的總糖、還原糖、鉀含量的適宜性比對照更優(yōu)?！{柳煙’的糖堿比、氮堿比、鉀氯比均處于優(yōu)質煙葉的標準范圍，糖堿比（10.36）介于‘K326’和‘云煙87’之間，氮堿比（0.76）和鉀氯比（7.58）比‘K326’和‘云煙87’稍高，化學成分協(xié)調性比對照更優(yōu)?！{柳煙’的石油醚提取物含量為6.02%，高于‘K326’和‘云煙87’，更有利于卷煙香氣的提升?！{柳煙’的總粒相物含量28.3 mg，低于‘K326’和‘云煙87’，抽吸安全性更好。

2.5烤煙新品系‘獅柳煙’的感官評吸表現(xiàn)

從‘獅柳煙’與對照品種‘K326’和‘云煙87’的感官評吸結果（表5）可以看出，‘獅柳煙’的香型為中間香型，與‘云煙87’相同，不同于‘K326’的中偏清香型；‘獅柳煙’的勁頭適中，與‘K326’和‘云煙87’相當；煙味濃度比‘K326’和‘云煙87’稍高；香氣質、香氣量、余味、雜氣、刺激性、灰色的評價得分高于對照‘K326’和‘云煙87’，燃燒性得分與‘K326’和‘云煙87’相同，評吸總分為79.2分，高于‘K326’（76.7分）和‘云煙87’（75.7分），感官評吸質量總體評價優(yōu)于對照品種‘K326’和‘云煙87’。

2.6烤煙新品系‘獅柳煙’的主要栽培與烘烤技術

‘獅柳煙’苗期長勢強，生長整齊，自然條件下高抗氣候斑，抗黑脛病、赤星病，中抗普通花葉病；需肥量比‘K326’和‘云煙87’稍低，一般施純氮97.5 kg/hm2，氮：磷：鉀比例為1：1：5：2.5為宜；適當增施鉀肥和有機肥；栽植規(guī)格110 cm×（60～65） cm，田煙栽13500株/hm2，旱地栽15000株/hm2。大田生育期130天，足葉打頂，留葉數(shù)20～22片。注意堅持成熟采烤（較一般品種推遲2～3天采摘），采用三段式烘烤，變黃期溫度39～40℃，定色期溫度47～48℃，在50～54℃延長烘烤時間，將葉肉基本烤干，以增加香氣量，干筋期在68℃以下。

2.7烤煙新品系‘獅柳煙’的SSR分子標記鑒定

用本實驗室篩選出的15對煙草SSR核心引物對‘獅柳煙’與對照品種‘K326’和‘云煙87’進行PCR擴增，引物PT3024、PT40021得到了穩(wěn)定的特征條帶（圖1），能夠把‘獅柳煙’與對照品種‘K326’和‘云煙87’鑒別區(qū)分。3討論

本研究從貴州省石阡縣本莊鎮(zhèn)獅柳村栽種多年的地方煙草品種中選出優(yōu)良單株，經系統(tǒng)選育育成了烤煙新品系‘獅柳煙’，是煙草選擇育種的又一個成功案例。選擇育種是從現(xiàn)有品種群體中出現(xiàn)的自然變異類型中通過系統(tǒng)選擇培育出優(yōu)良新品種的育種方法，是煙草育種的重要育種途徑之一，其變異來源包括3個方面，其一是作物品種在繁殖推廣和引種過程中，不可避免地會發(fā)生異交，即使是自花授粉作物，其異交率也有1%～4%，而自然異交必然會引起基因重組，從而出現(xiàn)一些新的重組基因型；其二是作物品種在繁殖和種植過程，由于環(huán)境條件的作用，如受營養(yǎng)、溫度、天然輻射、化學物質等補貼因素的影響，會發(fā)生突變；其三是新育成品種往往存在一些性狀或基因位點并未達到真正的純合程度，以至在開始推廣后仍然產生分離現(xiàn)象[7]。自然變異的產生為育種提供了素材，中國從推廣面積較大、推廣時間較長的煙草品種‘紅花大金元’‘K326’等品種中通過選擇育種育成了一批品種。

來自‘大金元’系統(tǒng)的品種有‘紅花大金元’[8]、‘中煙103’[9]、‘中煙104’[10]、‘遵煙6號’[10]、‘南江3號’[11]等。在中國長期較大面積推廣種植的烤煙品種‘紅花大金元’是1962年云南省路南縣路美邑村煙農從‘大金元’變異株中選出的，因花色深紅而得名[8]。‘中煙103’[9]、‘中煙104’[10]是中國農科院煙草研究所從‘紅花大金元’中選擇變異株育成。貴州省遵義市遵義縣從‘紅花大金元’品種中獲得的自然變異株，經多年系統(tǒng)選育，育成了‘遵煙6號’[11]。貴州省煙草公司從開陽縣米坪鄉(xiāng)大壩村下灣組田間種植的‘紅花大金元’群體中選擇自然變異株育成了烤煙新品種‘南江3號’[12]。

來自‘K326’系統(tǒng)的品種有‘粵煙96’等[13]。廣東省煙草南雄科學研究所從‘K326’大田變異株中，利用系統(tǒng)選育技術，育成了烤煙新品種‘粵煙96’[13]。本團隊從‘K326’品種中選擇優(yōu)良變異單株育成了烤煙新品系‘片片黃’[14]。

來自‘G28’系統(tǒng)的品種有‘韭菜坪2號’[15]。貴州畢節(jié)地區(qū)煙草公司在赫章縣原種植的美國引進品種‘G28’的大田生產中，對葉片數(shù)、葉片大小和抗病性變異單株進行選擇，育成了‘韭菜坪2號’[15]。

來自‘NC89’系統(tǒng)的品種有‘豫煙8號’[16]。河南省煙草公司駐馬店市公司在病毒病嚴重侵染的‘NC89’煙田中篩選變異單株，經系統(tǒng)選育，育成了‘豫煙8號’[16]。

來自‘云煙85’、‘云煙87’的品種有‘興煙1號’[17]等。貴州省煙草公司黔西南州公司從當?shù)亍茻?5’煙田選擇多葉突變單株，育成了多葉型烤煙品種‘興煙1號’[17]。本團隊從‘云煙87’中選擇出了突變體新品系[6]。

本研究報道的‘獅柳煙’與上述突變體來源不同，它是貴州省煙草公司銅仁市公司從貴州省石阡縣本莊鎮(zhèn)獅柳村栽種多年的地方煙草品種中選出的優(yōu)良單株，2013—2016年分別于春秋兩季在貴州銅仁和海南陵水兩地加代，進一步單株選擇、套袋自交保純、培育而成。經SSR分子標記鑒定，用引物PT3024、PT40021可以穩(wěn)定地在‘獅柳煙’與當?shù)刂髟酝茝V品種‘K326’和‘云煙87’之間擴增出特異性條帶，表明‘獅柳煙’具有遺傳特異性?！{柳煙’苗期長勢強，生長整齊，自然條件下高抗氣候斑，抗黑脛病、赤星病，中抗普通花葉病。2016—2018年連續(xù)3年試驗中，‘獅柳煙’平均單產達到2233.4 kg/hm2，均價為24.47元/kg，產值為54434.2元/hm2，上等煙率為51.11%，上中等煙率為94.81%，經濟指標優(yōu)于對照品種‘K326’和‘云煙87’?！{柳煙’適應性較強，可在800 m海撥以上、不同土壤及肥力的煙地推廣種植?！{柳煙’易烘烤，煙葉外觀品質較好，化學成分協(xié)調性好，感官評吸品質優(yōu)于對照品種‘K326’和‘云煙87’?！{柳煙’的一個顯著特點是葉片數(shù)多，單株留葉數(shù)3年平均達到24片/株，比‘K326’多3片/株，比‘云煙87’多5片/株，隨著煙葉等級結構調整該品種優(yōu)勢尤為突出，進入上等煙收購葉片數(shù)8～ 10片，中等煙收購葉片8～9片，單位面積效益顯著。在大田生產中種植1000株‘獅柳煙’相當于種1700株‘云煙87’的總產值，是農業(yè)增收的理想品種。下一步將申請參加全國煙草區(qū)域試驗、生產試驗、農業(yè)評審和工業(yè)評價，力爭早日通過全國烤煙品種審定并在生產上推廣應用。

4結論

‘獅柳煙’是從貴州省石阡縣本莊鎮(zhèn)獅柳村栽種多年的地方煙草品種中選出優(yōu)良單株經系統(tǒng)選育而成，與對照品種‘K326’和‘云煙87’具有SSR分子標記遺傳特異性；‘獅柳煙’有效留葉數(shù)較多，平均24片/株，煙葉產量和產值較高，平均單產2233.4 kg/hm2，均價24.47元/kg，平均產值54434.2元/hm2；‘獅柳煙’煙葉質量較優(yōu)，上等煙率為51.11%，上中等煙率為94.81%，外觀品質較好，化學成分協(xié)調性好，感官評吸品質優(yōu)于對照品種‘K326’和‘云煙87’。因此，‘獅柳煙’是一個高產優(yōu)質烤煙新品系。

參考文獻

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