響應(yīng)面優(yōu)化白芨多糖提取工藝及流變性研究

王自凡，盧永仲，張振

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州理工學(xué)院 食品與藥品制造工程學(xué)院， 貴陽 550003；3.貴州省分析測試研究院，貴陽 550002)

多糖是由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等單糖按一定比例組成的天然高分子化合物[1]，來源廣泛且安全性高，不僅具有抗氧化[2]、降血糖[3]、抗炎[4]、抗癌[5]等生物活性，而且具有增稠性[6]、乳化穩(wěn)定性[7-8]、成膜性[9]等特性而作為增稠劑、乳化劑、成膜劑等被廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥等行業(yè)。

白芨是一種傳統(tǒng)可食用中藥材，多糖是白芨塊莖中最主要的活性物質(zhì)，主要由葡萄糖和甘露聚糖組成，安全性高、黏性大。水提醇沉是白芨多糖最傳統(tǒng)的提取方法之一[10]，具有操作簡單、成本低、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。聶勝祥[11]利用白芨做保健醋，該白芨醋酸甜適宜，且具有清熱補(bǔ)血等功能。徐昌松等[12]用白芨制作豆腐不僅滋味鮮美，還具有止咳、預(yù)防潰瘍的作用，除此之外，白芨多糖液還可以用作乳化劑[13]、水果保鮮劑[14]等食品添加劑使用。在食品加工生產(chǎn)中，濃度、加熱溫度和剪切速率等流變學(xué)特性對于多糖類的提取工藝、感官評價、產(chǎn)品研發(fā)、貨架期評估等都具有重要意義[15-16]。

本研究對白芨多糖水提醇沉工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以白芨多糖提取率指標(biāo)為響應(yīng)面值，對在提取過程中影響提取率的主要因素料液比、提取溫度、提取時間進(jìn)行優(yōu)化，并對試驗結(jié)果進(jìn)行了驗證，分析了放置時間、加熱溫度、剪切速率和耐鹽性對白芨多糖溶液黏度的影響，為白芨多糖在食品工業(yè)中的提取和生產(chǎn)研發(fā)提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料

白芨：3年生，購于貴州省遵義市湄潭縣白芨基地。

1.2 試劑

石油醚、無水乙醇(均為分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；NaCl(分析純)：茂名市雄大化工有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

DZ-2BCII真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；JE502電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；DHG-9240B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上?，槴\實驗設(shè)備有限公司；XK-50實驗室超純水器 錦州市新科水處理設(shè)備廠；2N-1000A微型高速粉碎機(jī) 中南制藥機(jī)械廠；L4-5K臺式低速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；NDJ-9S旋轉(zhuǎn)黏度計 上海力辰儀器科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 白芨提取工藝流程

新鮮紫花白芨的假鱗莖沖洗干凈，去須根，蒸制25 min左右，至無白心，切成薄片，于60 ℃干燥至恒重，粉碎。取適量白芨粉，加入石油醚以1∶30(g/mL，下同)的比例，40 ℃回流1 h；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，料液比1∶50，70 ℃回流2 h，重復(fù)2次得脫脂[17]、脫色的白芨粉。

采用水提醇沉方法[18]，用一定料液比，加熱水浴提取3次，收集濾液，離心固液分離、濃縮、95%乙醇醇沉，4 ℃靜置過夜，收集白色絮狀物干燥后可得白芨粗多糖。

1.4.2 單因素試驗

以白芨粗多糖提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗研究料液比、提取溫度、提取時間對多糖提取率的影響，試驗水平分別選取料液比為1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)；提取溫度為40，50，60，70，80 ℃；提取時間為1，1.5，2，2.5，3 h，對多糖提取條件進(jìn)行初步優(yōu)化，確定單因素試驗參數(shù)范圍。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

為了達(dá)到白芨多糖的最佳提取工藝，本試驗根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理,在單因素試驗的基礎(chǔ)上以料液比、提取溫度、提取時間作為影響因子，以多糖提取率為響應(yīng)值，對白芨多糖的提取進(jìn)行三因素三水平的優(yōu)化設(shè)計，響應(yīng)面分析因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface design

1.4.4 白芨多糖黏度影響因素測定

1.4.4.1 放置時間和溫度對白芨多糖溶液黏度的影響

以蒸餾水為溶劑，配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的白芨多糖溶液，分別置于4 ℃和25 ℃環(huán)境下，每隔12 h測定在同一剪切速率(60 r/min)下溶液的黏度值變化。

1.4.4.2 不同剪切速度對白芨多糖溶液黏度的影響

配制質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40 mg/mL的白芨多糖溶液，在不同剪切速率(6，12，30，60 r/min)下測定多糖溶液的黏度值變化。

1.4.4.3 加熱溫度對白芨多糖溶液黏度的影響

配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的白芨多糖溶液，分別加熱至30，40，50，60，70，80，90 ℃，測定在同一剪切速率(60 r/min)下白芨多糖溶液的黏度值變化。

1.4.4.4 鹽離子濃度對白芨多糖溶液黏度的影響

配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的白芨多糖溶液，加入NaCl，使得溶液Na+濃度分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%,測定在同一轉(zhuǎn)速(60 r/min)下溶液的黏度值變化。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗重復(fù)3次，采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和計算，并用Design-Expert 8.0.6和OriginPro 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比考察結(jié)果

取5份白芨粉各5 g，提取溫度為70 ℃，提取時間為1 h，料液比分別為1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，每組提取3次，分別計算白芨粗多糖得率，分析料液比對白芨多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharide

由圖1可知，隨著料液比的增加，多糖的提取率逐漸上升，料液比為1∶60時提取率最高。白芨多糖提取液為黏稠狀，料液比為1∶40以下時，多糖液和白芨渣不容易固液分離，隨著溶液逐漸增多，細(xì)胞充分釋放多糖，但當(dāng)料液比超過1∶60時，多糖溶液濃度降低，猜測是濃縮過程導(dǎo)致多糖損失過多，發(fā)生降解，表現(xiàn)為提取率下降，而且料液比高，多糖濃縮耗時較長，也增加了生產(chǎn)成本。因此，控制白芨多糖提取料液比為1∶60左右為宜。

2.1.2 提取時間考察結(jié)果

本試驗取5份白芨粉各5 g，料液比為1∶60，提取溫度為60 ℃，提取時間分別為1，1.5，2，2.5，3 h，考察不同提取時間對白芨多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharide

由圖2可知，隨著時間的增加，多糖提取率逐漸增加，達(dá)到最大提取率的時間在1.5 h左右，由曲線的陡峭程度可以看出時間對多糖提取率的影響不是很大，在實際生產(chǎn)中，縮短提取時間可以降低提取成本，且隨著時間延長，多糖長時間處于加熱狀態(tài)，發(fā)生降解，含量下降，所以控制提取時間為1.5 h左右。

2.1.3 提取溫度考察結(jié)果

本試驗以取5份白芨粉各5 g，料液比為1∶60，提取時間為1 h，提取溫度分別為40，50，60，70，80 ℃，分別計算白芨粗多糖得率，考察提取溫度對白芨多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharide

由圖3可知，溫度對白芨多糖提取率的影響較大，隨著溫度上升，多糖提取率隨之增大，達(dá)到最大提取率的溫度為70 ℃，之后隨著提取溫度的升高，白芨多糖提取率反而下降，這可能是溫度過高，多糖降解導(dǎo)致醇沉多糖得率減少。因此，控制提取溫度為70 ℃。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以白芨多糖提取率為指標(biāo)，依據(jù)Box-Behnken法進(jìn)行試驗設(shè)計，確定白芨多糖最佳提取工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 白芨多糖提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The response surface experimental design and results of extraction process of polysaccharide from Bletilla striata

續(xù) 表

對表2中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，以白芨多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為自變量，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，由回歸分析結(jié)果可得3個因素對白芨多糖提取率的影響擬合回歸方程為：Y=40.84-0.14A-0.54B-1.00C+0.35AB-0.33AC-0.075BC-2.55A2-1.75B2-2.22C2。

白芨多糖提取模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3 白芨多糖提取回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model of extraction of polysaccharide from Bletilla striata

由表3可知，模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9742，模型的P<0.0001，表明回歸模型極其顯著，模型有意義；失擬項的P=0.7724>0.05，說明失擬項檢驗不顯著，模型的擬合度良好；校正決定系數(shù)RAdj2=0.9410，說明方程的可信度很高，能準(zhǔn)確描述試驗結(jié)果；模型一次項C(提取溫度)極顯著，B(提取時間)顯著，A(料液比)不顯著，說明3個因素對多糖得率的影響程度為C>B>A；二次項中，A2、B2、C2的影響都極顯著(P<0.01)。

對回歸模型獲得的響應(yīng)曲面圖見圖4～圖6。

圖4 料液比和提取時間對提取率影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of the effects of solid-liquid ratio and extraction time on the extraction yield

圖5 料液比和提取溫度對提取率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of the effects of solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction yield

圖6 提取時間和提取溫度對提取率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of the effects of extraction time and extraction temperature on the extraction yield

由圖4～圖6可知，3個響應(yīng)因素之間的交互作用都對白芨多糖的得率存在影響，由曲面的陡峭程度可以看出提取溫度對多糖提取率的影響最大，而料液比對多糖提取率的影響最小，結(jié)合軟件計算回歸模型可以預(yù)測出白芨多糖提取的最佳工藝：料液比為1∶59.77，提取時間為1.42 h，提取溫度為67.79 ℃，該條件下白芨多糖提取率為40.99%。

2.3 最佳工藝條件試驗驗證

根據(jù)模型得到的最佳工藝結(jié)合試驗的可行性和精準(zhǔn)度，將工藝條件調(diào)整為料液比1∶60、提取時間1.5 h、提取溫度70 ℃，在此條件下進(jìn)行試驗，每組試驗重復(fù)3次，以驗證模型的準(zhǔn)確性和預(yù)測結(jié)果。最終得到白芨多糖平均提取率為(40.82±0.28)%，與模型預(yù)測值相吻合，說明該試驗具有可靠性和準(zhǔn)確性，對今后白芨多糖提取工藝參數(shù)的選擇具有一定指導(dǎo)意義。

2.4 白芨多糖黏度影響因素測定

2.4.1 放置時間結(jié)果分析

該工藝操作簡單，可以獲得白色透明且具有一定黏度的多糖溶液，可作為添加劑應(yīng)用于日化、食品等領(lǐng)域，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，儲存條件是決定白芨多糖溶液質(zhì)量的關(guān)鍵因素。本試驗考察25 ℃和4 ℃環(huán)境下放置12，24，36，48，60，72 h多糖溶液的黏度值變化，結(jié)果見圖7。

圖7 放置時間對白芨多糖液黏度的影響Fig.7 Effect of storage time on the viscosity of Bletilla striata polysaccharide solution

由圖7可知，隨著放置時間的增加，多糖溶液黏度逐漸下降，這是多糖溶液中的內(nèi)源性酶和微生物的共同作用導(dǎo)致，而25 ℃環(huán)境下多糖溶液下降速率高于4 ℃環(huán)境，這是因為在冷藏環(huán)境下，內(nèi)源性酶和微生物活性較低，因此，在實際使用過程中，為了延長白芨多糖溶液的有效使用時間，需添加少量防腐劑且低溫下保存。

2.4.2 剪切速度結(jié)果分析

白芨多糖在水溶液中牢牢抓住水分子，形成具有黏性的多糖膠液，在生產(chǎn)加工過程中，機(jī)器攪拌剪切速率會影響多糖溶液的性質(zhì)[19]。本試驗考察在25 ℃下，5，10，20，30，40 mg/mL濃度下的白芨多糖溶液分別在6，12，30，60 r/min剪切速率下的黏度變化，結(jié)果見圖8。

圖8 剪切速率對白芨多糖溶液黏度的影響Fig.8 Effect of shear rate on the viscosity of Bletilla striata polysaccharide solution

由圖8可知，不同濃度下，同一剪切速率，多糖膠液濃度越大，黏度值越大；在相同濃度下，剪切速率越高，溶液黏度值越低，即多糖膠液的黏度隨著剪切速度的增加而減小，即剪切稀釋現(xiàn)象，因此，白芨多糖膠液具有假塑性，呈現(xiàn)出“非牛頓流體”特征。高濃度(20～40 mg/mL)下，溶液中的甘露聚糖大分子之間的靜電阻力、氫鍵等作用較強(qiáng)，分子鏈纏繞增強(qiáng)，多糖溶液黏度值增加，剪切速度越大，定向作用越強(qiáng)，分子運(yùn)動方向傾向于流動方向，減弱分子間纏繞，因此，溶液的黏度隨著剪切速率的增加而下降，該結(jié)果與菠蘿蜜多糖流變性研究結(jié)果一致。

2.4.3 加熱溫度結(jié)果分析

溫度對白芨多糖溶液黏度的影響見圖9。

圖9 加熱溫度對白芨多糖溶液黏度的影響Fig.9 Effect of heating temperature on the viscosity of Bletilla striata polysaccharide solution

由圖9可知，白芨多糖溶液的黏度隨著溶液溫度的升高而降低，隨著溶液溫度升高，分子間運(yùn)動和擴(kuò)散加劇，分子纏繞趨向松脫，在一定剪切力下，多糖溶液溫度和黏度之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高黏度越小，不過隨著溫度升高，多糖鏈會不同程度降解變短，也會表現(xiàn)為黏度值下降。

2.4.4 耐鹽性結(jié)果分析

白芨多糖液耐鹽性研究見圖10。

圖10 白芨多糖溶液耐鹽性研究Fig.10 Study on the salt tolerance of Bletilla striata polysaccharide solution

由圖10可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，多糖溶液的黏度出現(xiàn)較為緩慢的降低，這可能是Na+與白芨多糖溶液中分子上的羥基反應(yīng)，不利于分子間形成氫鍵，引起黏度下降[20]，也可能是白芨多糖本身屬于中性非離子型多糖，受離子影響程度較小?？傊琋aCl對白芨多糖溶液的影響不大，具有較好的耐鹽性，可用于高鹽食品。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以白芨多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果表明，料液比、提取溫度、提取時間對白芨多糖提取率均有影響，且影響顯著順序為：提取溫度>提取時間>料液比，同時，得出最優(yōu)提取工藝條件：料液比為1∶59.77，提取時間為1.42 h，提取溫度為67.79 ℃，在此條件下白芨多糖提取率為40.99%。水提醇沉得到白芨多糖液為“非牛頓流體”，呈假塑性，具有較好的黏度；白芨多糖溶液的黏度與濃度呈正相關(guān)，隨著剪切速率的增加呈現(xiàn)剪切稀釋現(xiàn)象；隨著溫度的升高，白芨多糖溶液的黏度下降；室溫(25 ℃)和冷藏(4 ℃)下，隨著放置時間延長，黏度均下降，4 ℃下黏度下降速度慢；白芨多糖溶液的黏度隨著加熱時間的增加而降低；Na+的加入使多糖溶液的表觀黏度緩慢減??；研究表明，優(yōu)化后水提醇沉白芨多糖的提取率穩(wěn)定，最優(yōu)條件下白芨多糖溶液具有良好的黏性和耐鹽穩(wěn)定性，可廣泛應(yīng)用于高鹽食品。