響應(yīng)面法優(yōu)化黃花菜黃酮提取工藝及抗氧化活性的研究

米智，劉荔貞，李慧

(1.山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，山西 大同 037009)

黃花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)，又稱金針菜、一日百合、忘憂草等，百合科萱草屬多年生宿根草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用蔬菜之一[1]。又被稱為“四大素山珍”之一，色澤金黃，香味濃郁，味道甘美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量的碳水化合物、維生素、氨基酸、多酚類、類胡蘿卜素、無(wú)機(jī)礦物質(zhì)、香精油、黃酮類等多種成分[2-3]?！侗静菥V目》記載黃花菜有利胸膈、安五臟、清身明目、治小便赤澀、解煩熱、除酒瘟、令人好歡無(wú)憂等藥效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃花菜具有抗氧化、抗菌消炎、抗抑郁[4]、鎮(zhèn)靜催眠、平肝養(yǎng)血、消腫利尿、鎮(zhèn)痛、保肝、通乳等保健功能[5-7]。

據(jù)《中藥大辭典》記載，黃花菜含有苷1.8%、黃酮類0.75%、生物堿0.7%、β-胡蘿卜素0.36%[8]。黃花菜中黃酮類化合物是其重要有效成分之一，具有增強(qiáng)免疫力、活血化瘀、保肝抗炎[9]、抗菌抗病毒[10]、抑制腫瘤[11]、延緩衰老[12]、抗氧化[13]、清除自由基等多種保健功能[14-17]，由于其毒副作用較小、功能多等特點(diǎn)，其相關(guān)研究和開(kāi)發(fā)，尤其是黃花菜及其總黃酮在制備抗抑郁藥物領(lǐng)域，日益受到重視。

目前，黃花菜中總黃酮的提取工藝仍以傳統(tǒng)的乙醇法、超聲波法、微波萃取法等方法為主，本文采取的索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設(shè)備操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室；黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇無(wú)毒且沸點(diǎn)低，適于索氏提取法進(jìn)行黃花菜中黃酮的提取，且使用乙醇為提取劑具有回收利用方便，提取率較高，有利于降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)[18]。

本文以當(dāng)年干黃花菜為研究對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析的方法，優(yōu)化索氏提取法提取黃花菜黃酮的最佳工藝條件，并采用清除DPPH、ABTS自由基的方法測(cè)定其抗氧化活性，以期為黃花菜中黃酮的提取及黃花菜的高值化綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干黃花：購(gòu)于山西省大同市云州區(qū)萬(wàn)畝有機(jī)黃花種植基地；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、維生素C(VC)：均為分析純，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)；C2H5OH；Al(NO3)3；NaNO2；NaOH等。

1.2 儀器與設(shè)備

索氏提取器、精密電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、數(shù)顯控溫電熱套、萬(wàn)能粉碎機(jī)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加少許無(wú)水乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，參照米智等的方法制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 黃花菜處理及黃酮提取工藝流程

選擇色澤鮮艷、長(zhǎng)度均勻適中、無(wú)發(fā)霉、無(wú)損傷、無(wú)病蟲害的干黃花菜，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在45～50 ℃下干燥2 h后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成黃花粉末，并過(guò)60目篩，收集黃花菜粉末于干燥的容器中待用。

黃酮提取工藝流程：黃花菜→清選→烘干→粉碎→過(guò)篩→稱重→分裝→浸提→定容→測(cè)定→計(jì)算。

1.3.3 黃花菜黃酮的測(cè)定方法

精確量取1 mL浸提液作為待測(cè)液，方法同1.3.1，做3組平行實(shí)驗(yàn)求平均值，代入線性回歸方程，得到黃花菜黃酮的含量。黃花菜黃酮提取量的計(jì)算公式為：

式中：C為黃花菜黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；W為實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 黃花菜黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2 g黃花菜粉末，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、料液比為1∶20(g/mL)的條件下，設(shè)置提取時(shí)間分別為1，1.5，2，2.5，3 h，提取黃花菜中總黃酮，測(cè)定提取液吸光值并計(jì)算黃酮提取量；在料液比為1∶20(g/mL)、提取時(shí)間為2 h的條件下，設(shè)置乙醇濃度分別為80%、85%、90%、95%、100%，提取黃花菜中總黃酮，測(cè)定提取液吸光值并計(jì)算黃酮提取量；在乙醇濃度為90%、提取時(shí)間為2 h的條件下，設(shè)置料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)，提取黃花菜中總黃酮，測(cè)定提取液吸光值并計(jì)算黃酮提取量。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)黃花菜黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從提取時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)和料液比(C)3個(gè)因素中，分別選取3個(gè)對(duì)黃花菜黃酮提取量影響較大的水平，以黃酮提取量為考察目標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，并建立回歸方程預(yù)測(cè)模型確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.6 黃花菜黃酮提取工藝的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了更好地驗(yàn)證索氏提取法提取黃花菜黃酮的可靠性和合理性，在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.7 黃花菜黃酮抗氧化性測(cè)定

1.3.7.1 黃花菜黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，在最優(yōu)條件下提取黃花菜黃酮濃縮液，用無(wú)水乙醇配制成0，0.025，0.05，0.075，0.1，0.2 mg/mL的樣品溶液，分別精確量取以上溶液0.6 mL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液2.4 mL，混勻，在黑暗室溫下反應(yīng)40 min后，在517 nm處測(cè)定吸光值[19]。用Vc作為本實(shí)驗(yàn)的參照物，以半數(shù)清除率IC50值作為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照以下公式計(jì)算清除率：

式中：A對(duì)照為0.6 mL無(wú)水乙醇+2.4 mL DPPH溶液；A樣品為0.6 mL黃花菜黃酮待測(cè)液+2.4 mL DPPH溶液；A空白為0.6 mL黃花菜黃酮待測(cè)液+2.4 mL無(wú)水乙醇。

1.3.7.2 黃花菜黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力測(cè)定

精確量取7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混勻，室溫且避光條件下反應(yīng)12～16 h，形成ABTS自由基離子(ABTS+·)儲(chǔ)備液。測(cè)試前，將ABTS+·儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇稀釋至在734 nm波長(zhǎng)下的吸光值為0.700±0.020，作為ABTS+·工作液于30 ℃保存待用。取黃花菜黃酮濃縮液，用無(wú)水乙醇配制成0，0.025，0.05，0.075，0.1，0.2 mg/mL的樣品溶液，分別精確量取以上溶液1 mL，加入ABTS+·工作液6 mL，混勻，在黑暗30 ℃下反應(yīng)30 min后，在734 nm處測(cè)定吸光值[20]。以VC作為本實(shí)驗(yàn)的參照物，以半數(shù)清除率IC50值作為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照以下公式計(jì)算清除率：

式中：A對(duì)照為1 mL去離子水+6 mL ABTS工作液；A樣品為1 mL黃花菜黃酮待測(cè)液+6 mL ABTS工作液；A空白為1 mL黃花菜黃酮待測(cè)液+6 mL去離子水。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以不同濃度蘆丁(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，OD510吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為：y=9.216x-0.102，R2=0.991。

2.2 黃花菜黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)黃花菜黃酮提取量的影響

圖1 提取時(shí)間對(duì)黃花菜黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃花菜黃酮提取量逐漸升高，并在2.5 h時(shí)黃酮含量達(dá)到了最高值，約為0.53%，當(dāng)提取時(shí)間再延長(zhǎng)，黃酮提取量略有下降。在做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取提取時(shí)間為2，2.5，3 h作為3個(gè)水平。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)黃花菜黃酮提取量的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)黃花菜黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由圖2可知，黃花菜黃酮提取量隨著乙醇濃度的提高而增加，并在90%和95%時(shí)達(dá)到最大值，均約為0.55%，當(dāng)用無(wú)水乙醇提取時(shí)，黃花菜黃酮量反而有所降低?；诠?jié)約成本考慮，做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取乙醇濃度為85%、90%和95% 3個(gè)水平。

2.2.3 料液比對(duì)黃花菜黃酮提取量的影響

圖3 料液比對(duì)黃花菜黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni

由圖3可知，黃花菜黃酮提取量隨著料液比的增大而增加，并在1∶20時(shí)達(dá)到了最大值，約為0.55%，當(dāng)料液比再增大時(shí)，黃花菜黃酮提取量反而降低。料液比為1∶15和1∶25時(shí)黃花菜黃酮的提取量相當(dāng)，故在做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取料液比為1∶15、1∶20和1∶25 3個(gè)水平。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應(yīng)面分析因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface experiment

建立黃花菜黃酮提取工藝參數(shù)的回歸模型，獲得本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)(黃花菜黃酮提取量)的響應(yīng)值(Y，%)對(duì)自變量A(提取時(shí)間)、B(乙醇濃度)和C(料液比)的二次多項(xiàng)式回歸方程：黃花菜黃酮提取量(Y，%)=-9.41375+1.0725A+0.17425B+0.056C+2.0E-3AB-0.011AC+3.0E-4BC-0.2A2-1.0E-3B2-1.5E-3C2。

以黃花菜黃酮提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈極顯著(P=0.0001<0.01)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且由P值可知,模型中變量A、B、C、AC、A2、B2和C2對(duì)黃酮提取量的影響極顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及A和C的交互作用對(duì)響應(yīng)值均有很大的影響；失擬項(xiàng)的P=0.2451>0.05，不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合度較好，模型選擇合理，模型的殘差可能來(lái)源于實(shí)驗(yàn)過(guò)程的隨機(jī)誤差。模型的校正決定系數(shù)RAdj2=0.9369，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)中有93.69%的變異分布在方程的因子中，其總變異有6.31%不能由該模型來(lái)解釋，R2值為0.9724，說(shuō)明黃花菜黃酮的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預(yù)測(cè)索氏提取黃花菜黃酮的實(shí)際情況。噪音信號(hào)比(Adeq Precision)為13.065>4，說(shuō)明本模型能真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果；實(shí)驗(yàn)的精確度(C.V.)為2.39%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作可靠[21]。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)響應(yīng)值的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛?B)>料液比(C)>提取時(shí)間(A)，且這3個(gè)因素均對(duì)黃花菜黃酮提取量影響極顯著(P<0.01)。

通過(guò)三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比的增大或延長(zhǎng)，黃花菜黃酮的提取量也隨之增大，但當(dāng)提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比增大或延長(zhǎng)到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢(shì)，提取時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)模型的影響極顯著，其余均不顯著，由圖4中b可知，其橢圓程度和疏密程度與表3回歸模型中的方差分析一致。

圖4 提取時(shí)間和料液比對(duì)黃花菜黃酮提取量的 響應(yīng)面圖(a)和等高線圖(b)Fig.4 Response surface diagram (a) and contour diagram (b) of extraction time and solid-liquid ratio on flavonoid extraction amount from Hemerocallis citrina Baroni

2.4 最佳提取條件的確定

由響應(yīng)面軟件分析可得出索氏提取黃花菜黃酮的最佳工藝為：提取時(shí)間2.64 h、乙醇濃度92.5%、料液比1∶18.23(g/mL)，最高提取量為0.57%?？紤]實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性，修正提取工藝條件為提取時(shí)間2.5 h、乙醇濃度90%和料液比1∶20(g/mL)。

2.5 優(yōu)化條件的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出黃花菜黃酮提取的最佳工藝，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)測(cè)定黃花菜黃酮提取量見(jiàn)表4。3組平行樣數(shù)據(jù)的RSD為2.11%，滿足要求，得出該提取工藝下黃花菜黃酮提取量較為穩(wěn)定。

表4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)測(cè)定黃花菜黃酮提取量Table 4 Verification experiment for determining the extraction amount of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni %

2.6 黃花菜黃酮抗氧化性測(cè)定

2.6.1 黃花菜黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

圖5 黃花菜黃酮和VC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni and VC on DPPH free radicals

由圖5可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，VC和黃花菜黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增大，與濃度成一定的量效關(guān)系。在0.1 mg/mL處，黃花菜黃酮清除率為82.86%，VC的清除率為95.56%。黃花菜黃酮和VC對(duì)DPPH清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.021 mg/mL，說(shuō)明黃花菜黃酮具有一定清除DPPH自由基的能力。

2.6.2 黃花菜黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力測(cè)定

圖6 黃花菜黃酮和VC對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of flavonoids from Hemerocallis citrina Baroni and VC on ABTS free radicals

由圖6可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，黃花菜黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力逐漸加強(qiáng)，且與VC的變化趨勢(shì)較一致。在0.1 mg/mL時(shí)，黃花菜黃酮清除率達(dá)到81.92%，VC清除率為94.77%。黃花菜黃酮和VC對(duì)ABTS自由基清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.031 mg/mL，說(shuō)明黃花菜黃酮具有一定清除ABTS自由基的能力。

3 結(jié)論

本文采用索氏提取法，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化黃花菜黃酮的提取工藝，在提取時(shí)間為2.5 h，乙醇濃度為90%，料液比為1∶20(g/mL)時(shí)，黃花菜黃酮提取量最大，約為0.55%。由方差分析可知，3個(gè)因素及提取時(shí)間和料液比的交互項(xiàng)對(duì)黃花菜黃酮提取量的影響均極顯著(P<0.01)。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可得，該工藝下黃花菜黃酮提取量最高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較小，約為2.11%。通過(guò)抗氧化性測(cè)定可得，黃花菜黃酮和VC對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.021 mg/mL；對(duì)ABTS自由基清除率的IC50值分別為0.056 mg/mL和0.031 mg/mL，盡管黃花菜黃酮對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率稍弱于VC，但是對(duì)其均有一定的清除能力。為今后研究黃花菜黃酮等成分的提取及綜合利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。