百香果皮總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

景繼月，許夢(mèng)圓，田永濤，田海龍，王文蜀*

(1.民族地區(qū)生態(tài)環(huán)境國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中央民族大學(xué))，北京 100081；2.中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

西番蓮屬(PassifloraLinn.)起源于巴西，果實(shí)大多香氣濃郁、酸甜可口，富含維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[1-3]，受到國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)。我國(guó)于1901年從日本引入紫皮百香果(PassifloraedulisSims)，現(xiàn)在南方等地廣泛種植[4-5]。以百香果為原料的食品日益豐富，將其作為調(diào)味品添加到飲料、甜點(diǎn)以及菜品中可賦予相關(guān)產(chǎn)品更多味覺(jué)感受，深受大眾尤其是年輕人的青睞，至今我國(guó)的相關(guān)專(zhuān)利已超過(guò)300項(xiàng)。百香果皮含有多糖、生物堿、酚類(lèi)等活性物質(zhì)[6-7]，其中的黃酮被報(bào)道具有抗炎、抗菌、降血糖、保護(hù)神經(jīng)、抗焦慮與鎮(zhèn)靜等生理功能[8-11]，并被證實(shí)具有清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和亞硝酸根離子的抗氧化能力[12-13]，顯示了被開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑的潛力。

超聲輔助提取法與其他方法相比有適應(yīng)性廣、溶劑消耗量少等優(yōu)點(diǎn)，但其提取活性物質(zhì)會(huì)受到多種因素影響[14-15]。因此采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，全面考察因素與因素之間的相互關(guān)系，通過(guò)浸膏得率、總黃酮含量和抗氧化能力3個(gè)響應(yīng)值，優(yōu)化百香果皮中總黃酮提取工藝，并評(píng)價(jià)提取物的抗氧化活性，為百香果開(kāi)發(fā)為功能性食品以及調(diào)味品等相關(guān)產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紫皮百香果：廣西壯族自治區(qū)北流市；無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、冰醋酸、醋酸鈉、鹽酸(分析純)、過(guò)硫酸鉀、氯化鐵、硫酸亞鐵：北京化工廠(chǎng)；無(wú)水三氯化鋁：北京偶合科技有限公司；Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-

carboxylic acid)、ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]、BHT(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol)：上海麥克林公司；蘆丁、TPTZ(tripyridyl triazine)：上海源葉生物科技有限公司；DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

BT224S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Espire酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer公司；V750紫外分光光度計(jì) 日本JASCO株式會(huì)社；J-HH-6A精密數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海勝衛(wèi)電子科技有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海洪旋實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MZX-D循環(huán)水式真空泵 北京精銳澤祥實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 百香果皮黃酮提取

將完整的百香果的果汁與果皮分開(kāi)。果皮用蒸餾水洗凈，切成1 cm3大小的方塊，置于通風(fēng)、干燥處陰干，備用。稱(chēng)取4 g干燥的百香果皮置于圓底燒瓶中，在對(duì)應(yīng)液料比、乙醇百分含量和超聲時(shí)間下，充分振搖，放入水浴鍋中進(jìn)行充分冷凝回流，對(duì)應(yīng)提取時(shí)間，至黃酮類(lèi)物質(zhì)基本提取完全，之后用真空泵抽濾，收集濾液，40 ℃真空濃縮直至無(wú)乙醇味。分液漏斗過(guò)濾，吹干，得浸膏，并稱(chēng)取質(zhì)量。按照下列公式計(jì)算浸膏得率：

浸膏得率(%)=浸膏質(zhì)量/干燥百香果皮×100%。

1.3.2 百香果皮總黃酮含量測(cè)定

百香果總黃酮含量測(cè)定采用AlCl3比色法，70%乙醇配制樣品和AlCl3溶液，在10 mL具塞比色管中放入0.8 mL 0.2 mol/L AlCl3溶液與不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，超純水定容，反應(yīng)25 min，將蘆丁換成純水作為空白對(duì)照。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=0.0481x+0.0965，R2=0.9998(n=3)。實(shí)驗(yàn)表明，在0.8～4.8 μg/mL范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光值有良好的線(xiàn)性關(guān)系。將樣品所得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算其總黃酮含量，所得結(jié)果用蘆丁當(dāng)量(rutin equivalent)表示，即為 mg RT/g DW。

1.3.3 百香果皮抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定

采用Kivrak[16]的方法并作適當(dāng)調(diào)整。用甲醇溶解DPPH，并配制成0.1 mmol/L的工作液，在96孔板中加入100 μL工作液與100 μL不同濃度的待測(cè)樣品。陽(yáng)性對(duì)照 BHT 代替待測(cè)樣品，同樣按上述方法進(jìn)行測(cè)試，空白對(duì)照僅甲醇與工作液，平行3次，充分混合后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度值。所得清除DPPH自由基能力計(jì)算公式為：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×

100%。

式中： A0為空白對(duì)照的吸光度值；A1為樣品與DPPH溶液混合后混合液的吸光度值；A2為樣品溶液與甲醇混合后混合液的吸光度值，通過(guò)SPSS計(jì)算半數(shù)清除率(half maximal scavenging concentration)，所得結(jié)果用SC50(mg/mL)表示。

1.3.3.2 清除ABTS自由基能力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法采用Li等[17]的方法并作適當(dāng)調(diào)整，將 0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS溶液與0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液混合，置于黑暗室溫條件下反應(yīng)，混合液用無(wú)水甲醇稀釋?zhuān)敝粱旌弦涸谧贤夥止夤舛扔?jì)下測(cè)得吸光度為0.70±0.02。在96孔板中加入180 μL混合液與20 μL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)液，于734 nm處測(cè)定吸光度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將樣品所得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算其抗氧化能力，所得結(jié)果用Trolox當(dāng)量表示，即為mmol/L TE/g。

1.3.3.3 鐵離子還原能力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)按照Benzie等[18]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。超純水配制20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液，40 mmol/L 鹽酸配制得到10 mmol/L TPTZ溶液，用醋酸鈉、TPTZ溶液和FeCl3·6H2O溶液按照10∶1∶1的比例充分混合后得到FRAP工作液。使用超純水和硫酸亞鐵配制得到100 mmol/L FeSO4·7H2O母液，在96孔板中加入180 μL FRAP工作液與20 μL不同濃度的FeSO4·7H2O 溶液充分混合均勻后，于593 nm處測(cè)定吸光度值，樣品的測(cè)試方法與上述方法一致。以 Fe2+濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將樣品所得吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算其還原能力，所得結(jié)果用Fe2+當(dāng)量表示，即為mmol/L Fe2+/g。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)所查文獻(xiàn)，選用液料比、乙醇百分含量、超聲時(shí)間和提取時(shí)間4個(gè)因素設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，液料比分別設(shè)置為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，乙醇百分含量分別設(shè)置為40%、50%、60%、70%、80%，超聲時(shí)間分別設(shè)置為10，15，20，25，30 min，提取時(shí)間分別設(shè)置為60，90，120，150，180 min，按照1.3.1步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以浸膏得率作為考察指標(biāo)。

1.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

中心組合設(shè)計(jì)(CCD) 實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩兩因素的考察，使點(diǎn)線(xiàn)延伸到面，呈現(xiàn)出三維立體效果，直觀(guān)反映因素與因素之間的相互關(guān)系。根據(jù)CCD原理，以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取液料比(A)、乙醇百分含量(B)、超聲時(shí)間(C)3個(gè)因素為自變量，而且在保證浸膏得率(R1)較高的同時(shí)，增加總黃酮含量(R2)與清除DPPH自由基能力(R3)共3個(gè)響應(yīng)值，建立模型，篩選百香果皮黃酮最佳提取工藝，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與編碼表Table 1 Factors and codes of response surface experiment

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel和Design Expert 8.0.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有處理均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)浸膏得率的影響

圖1 液料比對(duì)百香果皮總黃酮浸膏得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids from P. edulis Sims peel

分別設(shè)置液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，固定乙醇濃度60%，超聲時(shí)間20 min，提取時(shí)間120 min，計(jì)算浸膏得率。由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著液料比增加，浸膏得率也隨之增加。在液料比為50∶1時(shí)，浸膏得率達(dá)到最大值。上述現(xiàn)象的原因可能是在液料比為50∶1時(shí)，提取物已基本溶出，繼續(xù)增加溶劑的使用量會(huì)使較多其他化合物溶出，導(dǎo)致提取液總體黏度增加而抑制原有提取物與溶劑結(jié)合，減少其溶出，因此浸膏得率降低[19]。此外，溶劑用量較大時(shí)還會(huì)造成實(shí)驗(yàn)條件控制成本增加，所以選擇50∶1作為最佳液料比。

2.1.2 乙醇百分含量對(duì)浸膏得率的影響

分別設(shè)置乙醇百分含量為40%、50%、60%、70%、80%，固定液料比40∶1，超聲時(shí)間20 min，提取時(shí)間120 min，計(jì)算浸膏得率，提取結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇百分含量對(duì)百香果皮總黃酮浸膏得率的影響Fig.2 Effect of ethanol content on extraction yield of total flavonoids from P. edulis Sims peel

由圖2 可知，在實(shí)驗(yàn)所選乙醇百分含量范圍內(nèi)，隨著乙醇百分含量增加，浸膏得率總體呈先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)橐掖及俜趾枯^低時(shí)，百香果皮在溶劑中泡發(fā)，有利于黃酮溶出。當(dāng)乙醇百分含量為60%時(shí)，浸膏得率達(dá)到最大值。根據(jù)相似相溶原理，隨著乙醇百分含量繼續(xù)增多，混合提取劑總極性降低，造成極性較大的黃酮難以溶出，最終導(dǎo)致黃酮提取率降低[20]，所以選擇60%作為最佳乙醇百分含量。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響

分別設(shè)置超聲時(shí)間為10，15，20，25，30 min，固定液料比40∶1，乙醇百分含量60%，提取時(shí)間120 min，計(jì)算黃酮浸膏得率，提取結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)百香果皮總黃酮浸膏得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids from P. edulis Sims peel

由圖3可知，在10～25 min內(nèi)，浸膏得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加，這是由于時(shí)間較短時(shí)，提取物還沒(méi)有完全溶出，延長(zhǎng)超聲時(shí)間有助于增強(qiáng)溶劑對(duì)植物基質(zhì)的滲透，從而提高其得率。但當(dāng)超過(guò)一定時(shí)間，可能由于超聲波較強(qiáng)的剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間作用下會(huì)破壞提取物分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其降解轉(zhuǎn)化不再溶出，最終觀(guān)察到浸膏得率降低[21]，因此選擇25 min作為最佳超聲時(shí)間。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響

分別設(shè)置提取時(shí)間為60，90，120，150，180 min，固定液料比40∶1，乙醇百分含量60%，超聲時(shí)間20 min，計(jì)算黃酮浸膏得率，提取結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)百香果總黃酮浸膏得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids from P. edulis Sims peel

由圖4可知,提取時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響較小。在90 min時(shí)，浸膏得率較高，當(dāng)超過(guò)90 min后，浸膏得率降低，可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熱效應(yīng)使部分提取物分解反而不再溶解于溶劑中，提取率下降[22]。綜合考慮能源成本，選擇90 min作為最佳提取時(shí)間。

2.2 百香果皮黃酮提取物響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果與交互作用分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 百香果皮總黃酮響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis of total flavonoids from P. edulis Sims peel

通過(guò)分析20組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，浸膏得率、總黃酮含量和抗氧化能力三者之間無(wú)明顯線(xiàn)性關(guān)系，僅僅考察單一響應(yīng)值是片面的。因此，通過(guò)考察多個(gè)響應(yīng)值，篩選出最優(yōu)提取工藝，可制備出浸膏得率高、總黃酮含量高以及抗氧化能力良好的百香果皮黃酮提取物。

表3 響應(yīng)面模型的二次多項(xiàng)回歸方程和統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 3 Quadratic polynomial regression equations and statistical parameters of response surface model

由表3可知，模型(R1)的p=0.0031<0.01且失擬項(xiàng)的p=0.8016>0.05，說(shuō)明該模型極顯著并且模型失擬度不顯著，由此可見(jiàn)該模型可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)各因素對(duì)百香果皮總黃酮浸膏得率的影響。由F值可判斷出3個(gè)因素中，超聲時(shí)間對(duì)浸膏得率的影響最大，其次是乙醇百分含量和液料比。對(duì)于兩兩因素的交互作用見(jiàn)圖5中a，當(dāng)液料比最小(40∶1)，乙醇百分含量在63%～68%范圍內(nèi)時(shí)，浸膏得率達(dá)到最大值。圖5中b顯示乙醇百分含量在60%～65%范圍內(nèi)，超聲時(shí)間最長(zhǎng)(30 min)時(shí)，浸膏得率達(dá)到最大值。圖5中c顯示在液料比最小(40∶1)、超聲時(shí)間最長(zhǎng)(30 min)時(shí)，浸膏得率達(dá)到最大值。

由表3可知，模型(R2)的p=0.0128<0.05且失擬項(xiàng)的p=0.7584>0.05，說(shuō)明該模型達(dá)到了顯著水平并且模型失擬度不顯著，該模型可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)各因素對(duì)百香果皮黃酮含量的影響。由F值可判斷出3個(gè)因素的影響程度大小，乙醇百分含量對(duì)總黃酮含量的影響最大，其次是超聲時(shí)間和液料比。其中交互項(xiàng)AB在p<0.05水平上顯著，BC、AC項(xiàng)不顯著，表明僅液料比與乙醇百分含量的交互作用顯著。超聲時(shí)間(25 min)恒定，液料比和乙醇百分含量交互作用見(jiàn)圖6中a，在液料比最小(40∶1)，乙醇百分含量最大(70%)時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最大值。

由表3可知，模型(R3)的p=0.0407<0.05且失擬項(xiàng)的p=0.8089>0.05，說(shuō)明該模型達(dá)到了顯著水平并且模型失擬度不顯著，該模型可用來(lái)分析和預(yù)測(cè)各因素對(duì)百香果皮總黃酮清除DPPH自由基能力的影響。由F值可判斷出3個(gè)因素的影響程度大小，乙醇百分含量對(duì)清除DPPH自由基能力的影響最大，其次是超聲時(shí)間和液料比。其中交互項(xiàng)AB在p<0.05水平上顯著，BC、AC項(xiàng)不顯著。由于總黃酮含量與清除DPPH自由基能力存在一定的線(xiàn)性關(guān)系[23]，因而提取條件對(duì)清除DPPH自由基能力的影響與提取條件對(duì)總黃酮含量的影響有相似性。對(duì)于兩兩因素的交互作用見(jiàn)圖7中a，在較高的乙醇百分含量(70%)和較低的液料比時(shí)，SC50值最小即抗氧化能力最強(qiáng)。

圖5 三因素交互作用對(duì)浸膏得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagrams of the interaction of three factors on the extraction yield

圖6 三因素交互作用對(duì)總黃酮含量的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagrams of the interaction of three factors on the content of total flavonoids

圖7 三因素交互作用對(duì)清除DPPH自由基能力的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagrams of the interaction of three factors on the DPPH free radical scavenging ability

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

綜合響應(yīng)值浸膏得率(R1)、總黃酮含量(R2)和清除DPPH自由基能力(R3)，得到百香果皮總黃酮最優(yōu)提取條件為液料比40∶1，乙醇百分含量67%，超聲時(shí)間30 min。在該條件下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，取其平均值，得到總黃酮浸膏得率為12.58%，總黃酮含量為11.56 mg RT/g DW，清除DPPH自由基能力SC50值為0.19 mg/mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值與理論響應(yīng)值(R1 12.61%、R2 11.91 mg RT/g DW、R3 0.07 mg/mL)基本一致，表明回歸模型與實(shí)際情況擬合較好，可以有效反映各因素對(duì)百香果皮總黃酮提取的影響。因此，通過(guò)響應(yīng)面法綜合優(yōu)化得到的最佳工藝條件的回歸模型符合實(shí)際，對(duì)今后黃酮提取工藝參數(shù)選擇具有一定指導(dǎo)意義。

2.3 百香果皮總黃酮抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

采用DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力以及鐵離子還原能力3個(gè)實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)判響應(yīng)面優(yōu)化后所得百香果皮總黃酮體外抗氧化能力。

表4 百香果皮總黃酮體外抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of total flavonoids from P. edulis Sims peel in vitro

由表4可知，百香果皮總黃酮對(duì)脂溶性DPPH自由基具有較好清除作用，半抑制率清除濃度(SC50)為(0.18±0.02) mg/mL?？傸S酮也顯示了對(duì)水溶性ABTS自由基的清除能力((0.17±0.01) mmol/L TE/g)。在鐵離子還原能力實(shí)驗(yàn)中，總黃酮顯示了抗氧化活性((2.35±0.03 ) mmol/L Fe2+/g)。由上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，百香果皮總黃酮抗氧化活性良好，與合成抗氧化劑相比有制備過(guò)程簡(jiǎn)易、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，可開(kāi)發(fā)為食品天然抗氧化劑[24]。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化百香果皮提取總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)為:液料比40∶1，乙醇百分含量67%，超聲時(shí)間30 min。在此條件下總黃酮浸膏得率為12.58%，總黃酮含量為11.56 mg RT/g DW，清除DPPH自由基SC50值為0.19 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)建立的回歸模型有效可行，可用來(lái)預(yù)測(cè)百香果皮總黃酮的3個(gè)響應(yīng)值。進(jìn)一步抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：總黃酮提取物具有較好的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和良好鐵離子還原能力。綜上，響應(yīng)面法多指標(biāo)優(yōu)化提取工藝，可高效制備抗氧化活性良好的百香果皮總黃酮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為百香果皮開(kāi)發(fā)為抗氧化能力良好的食品及調(diào)味品提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于我國(guó)百香果資源經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益的二次增值。