DWI聯(lián)合血清miR-375水平評估宮頸癌患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移的價值

王 昆，吳曉瓊，鄭小令，沈長青

儋州市人民醫(yī)院放射科，海南 儋州 571700

腹腔鏡全子宮切除術作為早期宮頸癌（cervical cancer，CC）首選治療方式，可解除腫瘤占位性效應，延長患者生存期，但部分患者術后可能會出現(xiàn)遠期淋巴結轉移，導致預后不良［1］。目前，穿刺活檢是腫瘤淋巴結轉移診斷“金標準”，該檢查方式雖可明確觀察病灶變化情況，但無法定量分析腫瘤淋巴結轉移風險，且穿刺活檢作為有創(chuàng)性檢查，部分患者接受度低［2］。隨著影像學技術的發(fā)展，磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）因具有圖像對比度高、無輻射等優(yōu)勢得到廣泛應用，其中彌散加權成像（diffusion-weighted imaging，DWI）序列能夠提高常規(guī)MRI評估腫瘤浸潤深度與淋巴結轉移準確度［3］。有研究［4］發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）異常表達與CC的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其中miR-375作為非編碼RNA，可參與腫瘤細胞分化、凋亡過程，且與轉錄因子SPI結合而抑制腫瘤細胞侵襲、轉移?；趍iR-375的作用機制，我們推測miR-375水平可能與CC患者淋巴結轉移有關，且聯(lián)合DWI評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移應有一定價值，有鑒于此，本研究重在分析DWI聯(lián)合血清miR-375水平評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險的價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2016年1月—2018年4月于儋州市人民醫(yī)院接受腹腔鏡全子宮切除術治療且術后3年內發(fā)生遠期淋巴結轉移的47例CC患者資料，納入淋巴結轉移組；另收集同期接受腹腔鏡全子宮切除術治療且術后3年內未發(fā)生遠期淋巴結轉移的47例CC患者資料，納入無淋巴結轉移組。所有患者臨床、影像學檢查及實驗室檢查資料等均完整。納入標準：① CC符合《現(xiàn)代腫瘤學》［5］中相關標準，且經(jīng)手術后病理學檢查確診；② 首次接受腹腔鏡全子宮切除術治療；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）［6］分期為Ⅰb-Ⅱa期；③ 凝血功能及免疫系統(tǒng)正常；④ 有隨訪資料；⑤ 圖像質量清晰、符合研究標準。排除標準：① 合并乳腺癌、胃癌等其他惡性腫瘤；② 合并先天性心臟病、肝腎功能衰竭等重要臟器病變；③ 術前接受放化療等相關治療；④ 合并子宮肌瘤、子宮腺肌癥等其他子宮疾病；⑤ 手術后病理學檢查證實術前淋巴結轉移；⑥ 隨訪期間出現(xiàn)骨轉移、肺轉移等。

1.2 方法

1.2.1 淋巴結轉移評估

統(tǒng)計CC患者術后3年內淋巴結轉移發(fā)生情況，淋巴結轉移參照計算機體層成像（computed tomography，CT）診斷相關標準［7］（CT檢查可見結節(jié)最短徑≥10 mm，結節(jié)邊緣可見分葉毛刺或邊緣清晰，呈邊緣強化，中央壞死呈囊狀改變），或依據(jù)穿刺活檢結果進行判斷；本研究中單獨CT檢查檢出20例，穿刺活檢檢出27例。

1.2.2 DWI檢查

術前采用德國Siemens公司的MAGNETOM Spectra 3.0 T MRI掃描儀對患者進行檢查，線圈選用8通道體相控陣線圈。囑咐患者檢查前8 h禁食（對于有節(jié)育環(huán)的患者需先將其取出），檢查前30 min飲水保持膀胱充盈；患者取仰臥位，對其盆腔進行MRI常規(guī)T1加權成像（T1-weighted imaging，T1WI）、T2加權成像（T2-weighted imaging，T1WI）掃描及DWI掃描。橫軸面T1WI掃描參數(shù)：重復時間（repetition time，TR）為536 ms，回波時間（echo time，TE）為20 ms，層間隔為1 mm，層數(shù)為30層，層厚為4.5 mm，矩陣為384×269，視野為420 mm×420 mm，激勵次數(shù)為1；矢狀面T2WI掃描參數(shù)：TR為6 630 ms，TE為77 ms，間距為1 mm，層數(shù)為30層，層厚為4 mm，矩陣為320×224，視野為350 mm×350 mm，激勵次數(shù)為2；冠狀面T2WI掃描參數(shù)：TR為4 000 ms，TE為50 ms，間距為1 mm，層數(shù)為30層，層厚為4 mm，矩陣為320×182，視野為340 mm×341 mm，激勵次數(shù)為1；DWI掃描參數(shù)：TR為4 600 ms，TE為57ms，間距為1 mm，層數(shù)為121層，層厚為4.5 mm，矩陣為160×95，視野為258 mm×420 mm，激勵次數(shù)為1、6，b值取0 s/mm2、800 s/mm2。采用Siemens Workstation工作站處理圖像，勾畫圖像病變中心感興趣區(qū)，注意勾畫時需避開病灶壞死、出血部位，測定圖像表觀彌散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC），連續(xù)測定3次，最終結果取3次平均值。

1.2.3 血清miR-375及相關實驗室指標檢測

血清miR-375檢測：術前采集患者空腹肘靜脈血5 mL，置于促凝管內，在4 ℃環(huán)境下用低速離心機（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號為TD-5E）以1 500 r/min轉速離心10 min，離心半徑為10 cm，然后采用高速離心機（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號為Micro17R）以13 800 r/min轉速離心15 min，離心半徑為10 cm，采集血清，于-80 ℃冰箱內貯存、待檢；取200 μL血清標本，用miRCURY試劑盒提取標本總RNA，然后進行反轉錄反應，反應體系共20 μL，包括miRNA RT酶混合物 2 μL、0.1%牛血清白蛋白2 μL、去RNA酶水6 μL、2倍miRNA反應緩沖液混合物10 μL，依次在37 ℃環(huán)境下逆轉60 min，在85 ℃環(huán)境下逆轉5 s，用反轉錄試劑盒提取樣本cDNA；取樣本采用熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分析儀（山東博科科學儀器有限公司，型號為Lepgen-96）測定miR-375水平，PCR擴增反應條件：95 ℃環(huán)境下反應30 s，60 ℃環(huán)境下反應5 s，64 ℃環(huán)境下反應34 s，設定45個循環(huán)，用2-△△CT法分析miR-375水平。

術前采集患者空腹肘靜脈血5 mL，置于肝素抗凝管內，用低速離心機以4 000 r/min轉速離心10 min，離心半徑為10 cm，用化學發(fā)光法測定癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）125水平，檢測試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司，檢驗流程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 相關基線資料采集

設計基線資料填寫表，閱讀并記錄患者相關基線資料，內容包括年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、FIGO分期（Ⅰ期、Ⅱa期）、腫瘤直徑（影像學檢查）、病理學類型（鱗癌、腺癌、腺鱗癌）、基底浸潤深度（≥1/2、＜1/2）等。

1.2 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；等級資料采用秩和檢驗；全部計量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；偏態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；經(jīng)logistic回歸分析，探討各主要變量與CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移的關系；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算曲線下面積（area under curve，AUC），以判定DWI聯(lián)合血清miR-375水平評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險價值，AUC＞0.9表示評估性能較高，AUC為0.71～0.90表示有一定評估性能，AUC為0.50～0.70表示評估性能較差；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組DWI參數(shù)比較

淋巴結轉移組ADC為0.99（0.84，1.11）×10-3mm2/s，無淋巴結轉移組ADC值為1.34（1.12，1.64）×10-3mm2/s，組間ADC值比較差異有統(tǒng)計學意義（U=5.658，P＜0.001）。

2.2 兩組基線資料、血清miR-375水平比較

淋巴結轉移組血清CEA、CA125水平高于無淋巴結轉移組，miR-375水平低于無淋巴結轉移組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；組間其他基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 兩組基線資料、血清miR-375水平比較 n（%）

2.3 各主要變量與CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移的關系分析

納入差異有統(tǒng)計學意義的變量（CEA、CA125、miR-375）作為自變量（均為連續(xù)變量），將CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移情況作為因變量（1=淋巴結轉移，0=無淋巴結轉移），經(jīng)logistic回歸分析結果顯示，miR-375水平升高可能是CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移保護因子（OR＜1，P＜0.05，表2）。

表2 各主要變量與CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移的關系分析結果

2.4 DWI聯(lián)合血清miR-375水平評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險的價值分析

將ADC值、miR-375作為檢驗變量，將CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移情況作為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線（圖1）發(fā)現(xiàn)，ADC、miR-375單一及聯(lián)合檢測評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險的AUC分別為0.839、0.857、0.928，均有一定預測價值，當二者最佳診斷界值分別取1.065×10-3mm2/s、0.505時，預測價值最佳，且聯(lián)合檢測評估價值更高。相關參數(shù)見表3。

圖1 ADC聯(lián)合血清miR-375水平評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險價值的ROC曲線圖

表3 DWI聯(lián)合血清miR-375水平評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險價值分析結果

3 討 論

隨著宮頸細胞學篩查的應用，CC發(fā)病率及死亡率已顯著降低，但近年來流行病學調查顯示，CC發(fā)病呈年輕化趨勢［8］。腹腔鏡全子宮切除術是目前治療CC最常用的外科術式，不僅可切除腫瘤病灶，還具有創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少等優(yōu)勢，利于患者康復，但部分患者術后可能會出現(xiàn)淋巴結轉移，導致預后不良［9］。

MRI是診斷CC常用的影像學方式，可多參數(shù)、多方位觀察腫瘤發(fā)生情況，其中DWI是最常用的功能成像技術，該技術利用組織內水分子彌散原理，通過觀察正常組織與病灶中水分子彌散運動差異，判斷病變情況［10］。據(jù)報道，正常組織細胞外間隙較大，利于水分子彌散運動，而腫瘤病灶多有細胞形態(tài)、細胞膜滲透性改變情況，細胞間隙相對較小，繼而可能會限制水分子彌散［11］。ADC是DWI常用定量參數(shù)，該值主要反映水分子彌散強度，值越大即水分子彌散強度越大［12］。本研究結果顯示，淋巴結轉移組ADC值低于無淋巴結轉移組，說明有淋巴結轉移的CC患者ADC值較低，這與張晰等［13］研究結果一致。分析原因在于，伴有淋巴結轉移的CC患者，腫瘤細胞侵襲、轉移至淋巴結，會導致淋巴結內細胞間隙變小，從而限制水分子彌散，即ADC值低［14］。

CEA、CA125是臨床評估CC常用的血清學指標，其中CEA是一種酸性蛋白，多存在于腫瘤細胞表面，其主要經(jīng)細胞膜分泌至細胞外，水平升高提示機體可能存在腫瘤細胞［15］。CA125是由腫瘤上皮細胞分泌的糖蛋白，其水平升高不僅可提示腫瘤發(fā)生情況，還可促使腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)，促進腫瘤細胞侵襲、轉移［16］。本研究結果顯示，淋巴結轉移組血清CEA、CA125水平高于無淋巴結轉移組，初步說明CEA、CA125可能與CC患者淋巴結轉移有關，但回歸分析結果顯示CEA、CA125水平與CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移無關，可能是因為受個體差異、非腫瘤慢性疾病等影響。因此，臨床仍需尋求其他相關指標，以準確地評估CC患者淋巴結轉移風險。

研究［17］發(fā)現(xiàn)，miRNA作為基因表達調控分子，在CC發(fā)展過程中具有重要作用。miR-375是miRNA家族的一員，參與細胞增殖、凋亡、分化過程，據(jù)報道m(xù)iR-375可抑制YAP基因，增強細胞因子誘導殺傷細胞活性，殺傷腫瘤細胞，且可減弱SiHa細胞增殖能力，阻滯細胞周期在G1期，從而抑制腫瘤細胞侵襲［18］。同時，miR-375可結合SPI轉錄因子mRNA的3'UTR，影響SPI翻譯，減少SPI表達，而SPI可介導多種下游基因促進腫瘤細胞侵襲、轉移［19］。鄧岳紅等［20］研究顯示，CC患者血清miR-375水平顯著低于宮頸上皮內瘤變患者及健康人群，且miR-375對CC有一定診斷效能?；趍iR-375的作用機制，推測其表達可能與CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移有關。本研究初步比較淋巴結轉移、無淋巴結轉移CC患者血清miR-375水平及相關基線資料，回歸分析結果顯示，miR-375水平升高可能是CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移的保護因子，證實了我們的猜測。分析可能原因在于，miR-375水平降低，會減弱對YAP基因、SPI轉錄因子翻譯抑制作用，繼而可能會使其利用多種機制促使腫瘤細胞轉移，增加遠期淋巴結轉移風險［21］。

根據(jù)DWI診斷CC應用價值及miR-375與CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移的關系，推測二者聯(lián)合檢測評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險有一定應用價值。為驗證假設，研究最后繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，ADC、miR-375單獨檢測評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險均有較好的效果，但聯(lián)合檢測評估價值更高，在當二者最佳診斷界值分別取1.065×10-3mm2/s、0.505時，可獲得最佳預測價值?；诖搜芯拷Y果，對于腹腔鏡全子宮切除術前DWI檢查提示ADC低、血清miR-375水平降低的CC患者，術后可根據(jù)患者實際情況采取化療、放療輔助干預，以預防遠期淋巴結轉移，改善患者預后。

但本研究并未分析血清miR-375水平與CEA、CA125水平的相關性，且未評估CEA、CA125預測CC患者淋巴結轉移風險的價值，同時每例患者連續(xù)檢查3次，未評估患者間一致性，研究存在一定局限性，未來仍需展開前瞻性研究加以驗證。

綜上所述，DWI檢查ADC值聯(lián)合血清miR-375水平評估CC患者腹腔鏡全子宮切除術后遠期淋巴結轉移風險有一定應用價值，考慮未來可進行術前DWI聯(lián)合血清miR-375水平檢查，輔助評估CC患者淋巴結轉移風險。