外周血Leptin、Th17/Treg水平評(píng)估潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)度的臨床價(jià)值

趙成都,胡元元

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性腸道疾病，也是炎性腸病的主要臨床表型之一，多見(jiàn)于20～49歲青壯年人群，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作或持續(xù)性腹瀉、腹痛、里急后重感及黏液膿血便等，部分患者可出現(xiàn)體重減輕、發(fā)熱等全身性癥狀[1]。UC與慢性炎癥有關(guān)[2]，假如慢性炎癥反復(fù)發(fā)作，則可能增加結(jié)直腸的危險(xiǎn)，對(duì)患者的生活質(zhì)量和生命安全構(gòu)成威脅[3]。UC發(fā)病有明顯的區(qū)域差異[4]，多發(fā)生在經(jīng)濟(jì)高度發(fā)達(dá)的國(guó)家。近年來(lái)隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展與人們生活方式的改變，其在我國(guó)的患病率呈不斷上升趨勢(shì)。目前，UC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多數(shù)研究認(rèn)為其可能由腸道菌群失調(diào)、腸免疫紊亂、基因易感及環(huán)境等因素共同作用導(dǎo)致，其中免疫反應(yīng)尤為重要[5-6]。慢性炎癥可能是由于對(duì)腸道微生物群或食物抗原的異常免疫反應(yīng)引起，免疫狀態(tài)在腸道通透性和屏障功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(helper T cells 17 /regulatory T cells，Th17/Treg)是由CD4+T淋巴細(xì)胞在不同抗原刺激下分化的不同細(xì)胞類型。正常情況下，Th17/Treg處于動(dòng)態(tài)平衡，共同維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)。據(jù)報(bào)道，Th17/Treg平衡失調(diào)在炎癥反應(yīng)與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。瘦素(leptin，LP)是一種由脂肪組織分泌的激素樣細(xì)胞因子，可調(diào)控食物攝取與能量消耗之間的平衡。研究表明，LP能夠直接作用于淋巴細(xì)胞進(jìn)而影響其功能，構(gòu)成機(jī)體免疫應(yīng)答及防御機(jī)制的重要組成部分[8]。目前關(guān)于UC患者的外周血LP及Th17/Treg的水平的報(bào)道較少，故本研究旨在探討外周血LP、Th17/Treg水平評(píng)估UC活動(dòng)度的臨床價(jià)值，以為臨床UC的治療提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究通過(guò)鐘祥市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：ZXRMYYLL201910DL021)，經(jīng)所有患者及患者家屬同意并簽訂知情同意書(shū)。選取2019年8月至2020年5月到本院就診的UC患者92例，其中男性45例，女性47例，年齡40～75歲。采用改良Mayo評(píng)分系統(tǒng)對(duì)UC患者進(jìn)行分期分組，其中輕度活動(dòng)(3～5分)組28例，中度活動(dòng)(6～10分)組42例，重度活動(dòng)(11～12分)組22例。UC緩解期(≤2分)19例。UC患者入組標(biāo)準(zhǔn)：①UC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)》(2018版)[9]，所有患者均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；②胸部X線及尿常規(guī)、糞便常規(guī)檢查無(wú)感染；③近一個(gè)月內(nèi)未使用抗生素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并乙型肝炎病毒、艾滋病毒、丙型肝炎病毒及腸道致病菌等真菌病毒感染者；②心腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及合并嚴(yán)重腦肺疾病者；③妊娠期及哺乳期患者。另取同時(shí)期到本院檢查的健康體檢者38例作為正常對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 LP檢測(cè) 所有患者均于入院后次日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，采用肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min后分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)(武漢默沙克生物科技有限公司)檢測(cè)LP水平，采用酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)讀數(shù)。

12.2 Th17細(xì)胞檢測(cè) 所有患者均于空腹?fàn)顟B(tài)下采集250 μL全血(經(jīng)肝素鈉抗凝)，加入250 μL含質(zhì)量濃度為150 g/L胎牛血清的RPMIR 1640培養(yǎng)基(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)及1 μL流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼DxFLEX臨床流式細(xì)胞儀)刺激阻斷劑(美國(guó)Pepro Tech公司)重懸細(xì)胞，置于條件為37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取經(jīng)刺激后的100 μL全血表面標(biāo)記抗人 CD8a-FITC(美國(guó)Pepro Tech公司)、CD3-APC 抗體(美國(guó)Pepro Tech公司)4 ℃避光孵育 25 min，分別加入 MEDIUM A液和 B 液，室溫孵育 15 min，PBS 清洗 2 次，表面標(biāo)記抗人 IL-17A-PE 抗體(美國(guó)Pepro Tech公司) 4 ℃避光孵育25 min，PBS清洗后重懸待測(cè)。

1.2.3 Treg細(xì)胞檢測(cè) 所有患者均于空腹?fàn)顟B(tài)下采集100 μL全血(經(jīng)肝素鈉抗凝)標(biāo)記抗人 CD4-FITC(美國(guó)Pepro Tech公司)、CD25-APC抗體(美國(guó)Pepro Tech公司)4 ℃避光孵育 25 min，加入紅細(xì)胞裂解液(默克Sigma-Aldric公司)室溫 10 min，PBS 清洗2次，固定破膜液(默克Sigma-Aldric公司)4 ℃避光60 min，PBS 清洗2次，標(biāo)記抗人 Foxp3-PE 抗體(美國(guó)Pepro Tech公司)4 ℃避光孵育 25 min，PBS 清洗2次。采用 FACS Calibur 進(jìn)行檢測(cè)及 Flowjo 7.6 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 五組的臨床特征比較

如表1所示，正常對(duì)照組、UC緩解組、輕度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組及重度活動(dòng)組在年齡、性別、吸煙人數(shù)比例、體重指數(shù)及病程等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 五組臨床資料的比較

2.2 五組的外周血LP、Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞比例比較

如表2所示，與正常對(duì)照組對(duì)比，UC緩解期、輕度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組及重度活動(dòng)組LP、Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg均明顯增高(P<0.05)，且隨病情嚴(yán)重程度的增加不斷增高，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，與正常對(duì)照組對(duì)比，UC緩解組、輕度對(duì)照組、中度活動(dòng)組及重度對(duì)照組的Treg細(xì)胞比例水平均明顯降低(P<0.05)，且隨病情嚴(yán)重程度的增加不斷下降，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 五組的外周血LP、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例比較

2.3 LP、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg與Mayo評(píng)分的相關(guān)性分析

采用Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示(表3)LP、Th17細(xì)胞及Th17/Treg與Mayo評(píng)分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Treg細(xì)胞與Mayo評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；LP與Th17細(xì)胞及Th17/Treg呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與Treg細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表3 LP、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg與Mayo評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

UC是目前胃腸病治療中較棘手的難題之一，其病變可發(fā)生在結(jié)直腸的任何一個(gè)或多個(gè)部位，臨床上以直腸處和乙狀結(jié)腸處多見(jiàn)，且可累及升結(jié)腸甚至整個(gè)結(jié)腸。當(dāng)UC患者病變擴(kuò)散到整個(gè)結(jié)腸時(shí)，可導(dǎo)致末端回腸處(多限于距離盲回瓣10 cm以內(nèi)的末端回腸)發(fā)生病變[10]。在我國(guó)UC患者以慢性持續(xù)型及慢性復(fù)發(fā)性為主，當(dāng)病變局限于直腸時(shí)，患者預(yù)后良好，病變范圍累積多段結(jié)腸甚至全結(jié)腸時(shí)，患者則預(yù)后差。UC患者病癥較嚴(yán)重的可并發(fā)結(jié)腸穿孔或大出血，且病程超過(guò)十年者，具有較高的癌變率[11]。盡管UC疾病常見(jiàn)且危害患者健康，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

LP是一種由脂肪組織分泌的一種蛋白質(zhì)類激素，主要由白色脂肪產(chǎn)生，是肥胖基因編碼的蛋白產(chǎn)物[12]。LP屬于I型細(xì)胞因子超家族成員，通過(guò)下丘腦上的瘦素受體(Ob-R)的作用，調(diào)節(jié)下丘腦代謝調(diào)節(jié)中樞，從而具有控制食欲、增加能量消耗、抑制脂肪合成以及減少能量攝取等作用[13]。在人類中，胃上皮細(xì)胞和結(jié)腸樣本中發(fā)炎的粘膜組織中可觀察到LP表達(dá)，但在正常結(jié)腸上皮中未發(fā)現(xiàn)LP標(biāo)記[14]。 研究發(fā)現(xiàn)， T淋巴細(xì)胞內(nèi)分布LP受體，LP與之結(jié)合能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化、增殖及輔助性T細(xì)胞分化，進(jìn)而引發(fā)Th17/Treg的激活[15]。在腸道炎癥中，LP的作用亦常被認(rèn)為是由于其對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)[14]。研究表明LP拮抗劑增強(qiáng)了粘膜Treg的數(shù)量，并減少了小鼠結(jié)腸炎模型中黏膜炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)UC患者發(fā)病時(shí)，LP可刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，產(chǎn)生白介素-1、白介素-6等促炎癥因子[17]，進(jìn)一步增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及誘導(dǎo)上皮細(xì)胞損傷，從而加重腸粘膜的炎癥損傷。LP參與腸道的急性和慢性疾病，但其在腸道炎癥中的作用有待明確。在本研究中，與正常對(duì)照組對(duì)比，UC緩解組、輕度對(duì)照組、中度活動(dòng)組及重度對(duì)照組外周血LP水平均明顯增高，且與UC病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，LP可被用于鑒定和評(píng)估UC的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，外周血LP、Th17水平與UC疾病活動(dòng)度明顯呈正相關(guān)，Treg水平與UC疾病活動(dòng)度明顯呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)上述指標(biāo)水平可有效評(píng)估UC患者疾病嚴(yán)重程度。本研究強(qiáng)調(diào)了LP及Th17/Treg在UC發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為指導(dǎo)患者臨床診斷和治療提供重要價(jià)值。但本研究臨床病例數(shù)量有限，結(jié)果會(huì)有一定程度上的偏差，有待深入研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LP水平和Th17呈同步增加與下降趨勢(shì)，但二者之間的因果關(guān)系在此處未得到證實(shí)，需進(jìn)一步研究探討UC中LC與Th17/Treg的關(guān)系。