LncRNA EIF3J-AS1通過靶向調(diào)控miR-597-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、周期分布和凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

張麗媛，郭舒靜，伊雪，石鶯

胃癌是我國(guó)居民中常見惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2019年中國(guó)胃癌新增病例達(dá)61.28萬(wàn)例，死亡病例42.15萬(wàn)例[1]。雖然以手術(shù)為基礎(chǔ)的綜合治療策略取得了很大進(jìn)展，但胃癌早期診斷率較低，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，現(xiàn)有治療策略的有效性仍不令人滿意[2-4]。近年研究揭示了長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)異常表達(dá)和缺失在人類癌癥進(jìn)展中的重要作用，LncRNA可與miRNA特異性結(jié)合，抑制其生物學(xué)功能，上調(diào)靶基因表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞基本生物學(xué)行為，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[5-9]。研究指出，LncRNA真核細(xì)胞翻譯起始因子3J反義RNA1(EIF3J-AS1)在肝癌中表達(dá)上調(diào)，通過檢測(cè)LncRNA EIF3J-AS1等6中LncRNA表達(dá)對(duì)肝癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期具有預(yù)測(cè)價(jià)值[10]。結(jié)直腸癌中LncRNA EIF3J-AS1高表達(dá)提示預(yù)后較差，沉默LncRNA EIF3J-AS1可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[11]。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-597-5p是LncRNA EIF3J-AS1的潛在靶點(diǎn)。已有研究指出miR-597-5p可與circ101555直接結(jié)合，沉默circ101555通過上調(diào)miR-597-5p表達(dá)顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和DNA修復(fù)能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。然而，目前LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p在胃癌中的表達(dá)情況，LncRNA EIF3J-AS1是否靶向miR-597-5p調(diào)控胃癌進(jìn)展未見報(bào)道。本研究從細(xì)胞增殖、周期分布、細(xì)胞凋亡角度分析LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p在胃癌進(jìn)展中的作用，探討LncRNA EIF3J-AS1對(duì)miR-597-5p的靶向調(diào)控作用，旨在為胃癌的早期診斷、分子靶向治療提供潛在靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

收集2019年1月至2019年12月在我院行手術(shù)治療的37例胃癌患者[男21例，女16例，年齡30～75歲，平均年齡(51.25±4.21)歲]的癌組織和癌旁組織標(biāo)本。組織離體后，迅速置于液氮中冷凍，后保存在-80 ℃冰箱。入組患者術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有患者知情同意。

人胃癌組織用液氮在研缽內(nèi)研磨組織，直至粉末狀，1 mL Trizol試劑加入可裂解細(xì)胞；胃癌細(xì)胞系(SNU-1、AGS、HS-746T)、人胃黏膜細(xì)胞GES1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；si-LncRNA EIF3J-AS1、si-NC、miR-NC、miR-597-5p mimics、pcDNA、pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1、anti-miR-597-5p、anti-miR-NC、重組熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海漢恒生物公司；SYBR Premix EX Taq試劑盒、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；miScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；CCK-8試劑盒、Cleaved-caspase-3兔多克隆抗體(ab2302)、β-actin兔多克隆抗體(ab8227)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Annexin-V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；CytoFLEX S流式細(xì)胞儀為貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè)LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p表達(dá)

TRIzol法分析組織樣本、胃癌細(xì)胞系、GES1細(xì)胞的總RNA。隨后，分別用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成LncRNA、miRNA的cDNA。再用miScript SYBR Green PCR試劑盒、SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行RT-qPCR以檢測(cè)LncRNA EIF3J-AS1、miR-597-5p表達(dá)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)的變化。EI3J-AS1上游引物5′-GCC ACA ATG ATA CAG GTT-3′，下游引物5′-GCC AGT GAC CTG TCC ACC C-3′；β-actin上游引物5′-CGT GAC ATT AAG GAG AAG CTG-3′，下游引物5′-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC-3′；miR597-5p上游引物5′-UGU GUC ACU CGA UGA CCA CUG U3′，下游引物5′-AGU GGU CAU CGA GUG ACA CAU U-3′；U6上游引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT-3′，下游引物5′-ACG CTT CAC GAA TTT GCG TGT C-3′。

1.2.2 轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組

用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋40 nM的寡核苷酸或2 μg質(zhì)粒，室溫孵育5 min(A液)。同時(shí)，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋5 μL的lipofectamine 2000，室溫孵育5 min(B液)。將A液與B液混合，室溫孵育20 min(C液)。將2×104個(gè)對(duì)數(shù)期SNU-1細(xì)胞接種24孔板，將C液加入60%融合細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)用RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)的抑制或促進(jìn)效果。未轉(zhuǎn)染的SNU-1細(xì)胞記為對(duì)照組；轉(zhuǎn)染si-LncRNA EIF3J-AS1、si-NC、miR-NC、miR-597-5p mimics、pcDNA、pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1、si-LncRNA EIF3J-AS1與anti-miR-NC、si-LncRNA EIF3J-AS1與anti-miR-597-5p的細(xì)胞，分別記為si-LncRNA EIF3J-AS1組、si-NC組、miR-NC組、miR-597-5p組、pcDNA組、pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1組、si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-NC組、si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-597-5p組。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡

凋亡檢測(cè)：PBS洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞2次，加入500 μL的1×結(jié)合緩沖液(含5 μL Annexin-V-FITC和5 μL碘化丙啶)在室溫下避光孵育15 min。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

周期檢測(cè)：PBS洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞2次，向細(xì)胞懸液中加入預(yù)冷70%酒精4 ℃固定過夜。離心除去乙醇，PBS清洗1次，在離心管中留500 μL的PBS，吹散細(xì)胞團(tuán)，加入RNase A工作液，室溫避光孵育30 min。離心，用PBS清洗1次，再次離心，加入碘化丙啶，室溫避光孵育30 min?；靹颍^300目網(wǎng)篩，置于流式管中，4 ℃冰箱保存，待測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)并導(dǎo)出結(jié)果。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按照每孔100 μL(3×103個(gè))接種96孔板，孵育48 h后，加入十分之一體積的CCK-8試劑在37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)光密度(OD)值來反映細(xì)胞活力。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取總蛋白，設(shè)定電壓100 V、時(shí)間90 min進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照電流300 mA、時(shí)間30 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將膜置于5%脫脂牛奶中封閉2 h，再與一抗在4 ℃下孵育12 h。一抗如下：Cleaved-caspase-3抗體1∶1 500、內(nèi)參β-actin抗體。然后酶標(biāo)二抗稀釋2 000倍，室溫孵育膜1.5 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影、定影。Image J軟件分析Cleaved-caspase-3相對(duì)于β-actin條帶灰度值以反映其蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

合成包含miR-597-5p結(jié)合區(qū)域的野生型EIF3J-AS1片段，同時(shí)合成不含上述結(jié)合區(qū)域的突變型EIF3J-AS1片段，將其分別插入pmirGLO熒光素酶載體。將獲得熒光素酶報(bào)告基因載體WT-EIF3J-AS1和MUT-EIF3J-AS1分別與miR-597-5p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染SNU-1細(xì)胞48 h后，測(cè)定細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LncRNA EIF3J-AS1和miR-597-5p在胃癌組織、細(xì)胞中表達(dá)情況

胃癌組織中LncRNA EIF3J-AS1表達(dá)水平與癌旁組織比較顯著升高(2.23±0.25vs1.00±0.15，t=25.662，P<0.05)，miR-597-5p表達(dá)水平與癌旁組織比較顯著降低(0.45±0.06vs1.00±0.12，t=24.936，P<0.05)。胃癌細(xì)胞系SNU-1、AGS、HS-746T中LncRNA EIF3J-AS1表達(dá)水平與人胃黏膜細(xì)胞GES1比較顯著升高(2.43±0.21，2.05±0.17，1.82±0.14vs1.00±0.10，F(xiàn)=128.339，P<0.05)，miR-597-5p表達(dá)水平與GES1細(xì)胞比較顯著降低(0.40±0.04，0.48±0.03，0.53±0.04vs1.00±0.08，F(xiàn)=250.600，P<0.05)，選擇表達(dá)差異較大的SNU-1細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。

2.2 沉默LncRNA EIF3J-AS1對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡的影響

si-LncRNA EIF3J-AS1組細(xì)胞LncRNA EIF3J-AS1表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染si-LncRNA EIF3J-AS1能夠抑制LncRNA EIF3J-AS1表達(dá)。與NC組比較，si-LncRNA EIF3J-AS1組細(xì)胞Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力、S期細(xì)胞比例顯著降低P<0.05)。見圖1、表1。

表1 沉默LncRNA EIF3J-AS1對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、周期分布、凋亡以及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖1 沉默LncRNA EIF3J-AS1對(duì)SNU-1細(xì)胞周期分布、凋亡以及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；C：Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平

2.2 過表達(dá)miR-597-5p對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、周期分布和凋亡的影響

miR-597-5p組SNU-1細(xì)胞miR-597-5p表達(dá)水平顯著高于miR-NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染miR-597-5p mimics可促進(jìn)miR-597-5p表達(dá)。與miR-NC組比較，miR-597-5p組SNU-1細(xì)胞Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力、S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 過表達(dá)miR-597-5p對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、周期分布和凋亡的影響

圖2 過表達(dá)miR-597-5p對(duì)SNU-1細(xì)胞周期分布、凋亡以及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；C：Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平

2.4 LncRNA EIF3J-AS1靶向調(diào)控miR-597-5p表達(dá)

LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)到miR-597-5p與LncRNA EIF3J-AS1存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。過表達(dá)miR-597-5p可降低轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-EIF3J-AS1的相對(duì)熒光素酶活性(P<0.05)，見表3。轉(zhuǎn)染si-LncRNA EIF3J-AS1沉默LncRNA EIF3J-AS1表達(dá)后SNU-1細(xì)胞miR-597-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染pcDNA-LncRNA EIF3J-AS1上調(diào)LncRNA EIF3J-AS1表達(dá)后SNU-1細(xì)胞miR-597-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表4。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 RT-qPCR檢測(cè)miR-597-5p的表達(dá)

圖3 miR-597-5p和LncRNA EIF3J-AS1結(jié)合示意圖

2.5 抑制miR-597-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA EIF3J-AS1對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、周期分布和凋亡的影響

與si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-NC組比較，si-LncRNA EIF3J-AS1+anti-miR-597-5p組SNU-1細(xì)胞miR-597-5p表達(dá)水平、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)、G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率顯著降低P<0.05)，細(xì)胞活力、S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。見圖4、表5。

表5 抑制miR-597-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA EIF3J-AS1對(duì)SNU-1增殖、周期分布、凋亡的影響

圖4 抑制miR-597-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA EIF3J-AS1對(duì)SNU-1周期分布、凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；C：Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平

3 討論

LncRNA不僅參與細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移，還與腫瘤大小、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后相關(guān)，是胃癌治療有吸引力的分子靶點(diǎn)[13-17]。Wei等[18]人指出LncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)通過下調(diào)miR-1277-5p表達(dá)、上調(diào)V型膠原蛋白α1表達(dá)促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，LncRNA HOTAIR高表達(dá)預(yù)示胃癌患者預(yù)后不良。Hu等[19]發(fā)現(xiàn)LINC00641表達(dá)上調(diào)與奧沙利鉑耐藥有關(guān)，下調(diào)LINC00641通過改變胃癌細(xì)胞自噬參與調(diào)節(jié)奧沙利鉑耐藥。Chen等[20]報(bào)道LINC01234表達(dá)增加與胃癌轉(zhuǎn)移、更短生存時(shí)間相關(guān)，沉默LINC00641可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)阻滯，并抑制裸鼠異種移植瘤形成。本研究檢測(cè)到LncRNA EIF3J-AS1在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默LncRNA EIF3J-AS1可抑制胃癌細(xì)胞活力，阻滯細(xì)胞周期，激活Cleaved-caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。LncRNA EIF3J-AS1在肝癌中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、血管浸潤(rùn)和腫瘤分期等預(yù)后特征相關(guān)，敲低LncRNA EIF3J-AS1可抑制缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[21]。沉默LncRNA EIF3J-AS1通過上調(diào)miR-1343-3p表達(dá)顯著抑制膠質(zhì)瘤的惡性表型[22]，這與本研究中沉默LncRNA EIF3J-AS1的抗癌作用相似。LncRNA EIF3J-AS1還通過抑制miR-373-3p/ 蛋白激酶B1(AKT1)軸參與調(diào)控食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移進(jìn)程，在食管癌中發(fā)揮致癌作用，并可能作為食管癌患者預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)[23]。以上研究表明LncRNA EIF3J-AS1在胃癌扮演致癌基因角色，沉默LncRNA EIF3J-AS1通過抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來阻礙胃癌進(jìn)展。

據(jù)報(bào)道m(xù)iR-597-5p是胰腺癌的抑癌因子，miR-597-5p通過靶向下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ELK1顯著抑制胰腺癌細(xì)胞活力和克隆能力，增加細(xì)胞凋亡水平[24]。在結(jié)腸癌中miR-597-5p能夠影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的表達(dá)以及體外遷移和侵襲能力，抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移[25]。在肝癌中miR-597-5p表達(dá)下調(diào)，miR-597-5p可通過靶向調(diào)控TEAD1 抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[26]。 本研究檢測(cè)到胃癌組織、細(xì)胞中miR-597-5p表達(dá)均顯著降低，過表達(dá)miR-597-5p可激活Cleaved-caspase-3，降低胃癌細(xì)胞活力，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-597-5p為L(zhǎng)ncRNA EIF3J-AS1的直接靶點(diǎn)。RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)，在胃癌細(xì)胞中miR-597-5p表達(dá)受到LncRNA EIF3J-AS1的負(fù)性調(diào)控。過表達(dá)miR-597-5p和沉默LncRNA EIF3J-AS1在胃癌中的抗腫瘤作用相似，這提示沉默LncRNA EIF3J-AS1的功能是由miR-597-5p表達(dá)增加介導(dǎo)的。為證實(shí)上述猜想，本研究將si-LncRNA EIF3J-AS1、anti-miR-597-5p共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示抑制miR-597-5p表達(dá)可拮抗沉默LncRNA EIF3J-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞活力、周期分布和凋亡的影響，這表明LncRNA EIF3J-AS1靶向miR-597-5p參與胃癌進(jìn)展。然而，目前的研究仍存在不足之處。例如，LncRNA EIF3J-AS1/miR-597-5p軸的下游靶點(diǎn)和信號(hào)通路尚待闡明。此外，還需要通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和更多的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

總之，胃癌中LncRNA EIF3J-AS1表達(dá)升高，miR-597-5p表達(dá)降低。沉默LncRNA EIF3J-AS1通過上調(diào)miR-597-5p表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)將有助于深入了解胃進(jìn)展的分子機(jī)制，為臨床胃癌治療提供新的分子靶點(diǎn)。