重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌的耐藥特征

馬思宇，徐天祎，馬立艷(.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京00050；.首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系，北京00069)

耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem resistant Enterobacterales, CRE)的檢出率正在逐年上升，且傳播力強(qiáng)，已成為近十年來全球重大公共衛(wèi)生問題之一。2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球抗生素耐藥細(xì)菌優(yōu)先性列表》中，CRE位于優(yōu)先1級-危急[1]。2021年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率高達(dá)23.1%[2]。中國CRE監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)表明，CRE的死亡率為33.5%，血流感染30 d病死率為46.2%，所致侵襲性感染的治療用藥選擇非常有限[3]。

重癥監(jiān)護(hù)病房患者由于病情危重、免疫功能抑制、侵入性操作多等，發(fā)生CRE感染的機(jī)會大大增加，醫(yī)院感染控制和抗菌藥物管理也更加困難。本研究收集2019—2020年北京友誼醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房臨床分離CRE菌株，對其耐藥特征進(jìn)行檢測和分析，旨在為臨床抗感染治療選藥和醫(yī)院感染控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2019年1月1日至2020年10月31日北京友誼醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房分離CRE菌株，標(biāo)本來源于血液、腹腔引流液、膽汁、尿液和痰液，剔除同一患者相同部位重復(fù)菌株。所有菌株經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑和儀器 E-test條(鄭州安圖生物公司)，藥敏紙片(英國Oxiod公司)，黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)，陽離子調(diào)節(jié)肉湯(cation adjusted Mueller-Hinton broth, CAMHB)(英國Oxiod公司)，基因組DNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑(上海生工生物公司)。ABI 7500 PCR儀、3730 XL測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3藥物敏感性試驗(yàn) 采用E-test條進(jìn)行頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、阿米卡星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星藥物敏感性試驗(yàn)；采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行頭孢他啶/阿維巴坦藥敏試驗(yàn)，按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI) M100-S31藥物敏感折點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果判讀[4]。按需氧菌的抗菌藥物稀釋法敏感性試驗(yàn)(CLSI M07-A11, 2018)進(jìn)行黏菌素微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)，每個試驗(yàn)孔中藥物終濃度范圍為0.062 5～64 mg/L，參照EUCAST 10.0版藥物敏感折點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果判讀，黏菌素最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)≤2 mg/L敏感，>2 mg/L耐藥[5]。CRE定義為腸桿菌目細(xì)菌對美羅培南、亞胺培南、厄他培南中介或耐藥，或產(chǎn)碳青霉烯酶。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853，肺炎克雷伯菌ATCC 700603、BAA 1705和BAA 1706。

1.4耐藥基因檢測 按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取待測菌株DNA作為模板。采用PCR方法檢測待測菌株中的碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48)[6]。由上海生工生物公司合成引物。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用多重PCR方法檢測待測菌株中質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因(mcr-1、2、3、4和5)，引物序列參照文獻(xiàn)[7]。多重PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，包括PCR Master Mix 25 μL，5對上、下游引物各2.2 μL，ddH2O 1 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 60 s，25個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，將所有PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對。將測序證實(shí)為靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的菌株作為PCR反應(yīng)的陽性質(zhì)控菌株。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1 耐藥基因檢測所用引物和擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.5多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST) PCR擴(kuò)增(http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html)86株肺炎克雷伯菌7個管家基因(rpoB、infB、phoE、mhd、pgi、gapA、tonB)，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物公司測序，結(jié)果提交http://www.mlst.net進(jìn)行分析，確定臨床分離株的序列分型。

1.6數(shù)據(jù)分析 采用WHONET 5.6軟件(http://www.whonet.org/software.html)進(jìn)行藥敏結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1重癥監(jiān)護(hù)病房CRE菌株分布和藥敏試驗(yàn)結(jié)果 共檢出98株CRE，分別來自痰液(32/98，32.7%)、血液(24/98，24.5%)、膽汁(16/98，16.3%)、尿液(15/98，15.3%)和腹腔引流液(11/98，11.2%)。其中，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CR-KPN)在所有CRE菌株中占優(yōu)勢(86/98，87.8%)，其次是耐碳青霉烯類大腸埃希菌(CR-ECO，6/98，6.1%)和耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌(CR-ECL，6/98，6.1%)。98株CRE菌株對頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為100.0%，對左氧氟沙星、氨曲南和阿米卡星的耐藥率分別為89.6%、87.5%和36.4%，對頭孢他啶/阿維巴坦和黏菌素的耐藥率分別為4.1%和7.1%。CR-KPN菌株對各種藥物的MIC分布見表2。

表2 CR-KPN菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果及MLST分型結(jié)果 98株CRE菌株中，碳青霉烯酶的檢出率為84.7%(83/98)。僅攜帶blaKPC-2的菌株檢出率最高，為75.5%(74/98)，以CR-KPN為主。只攜帶blaNDM-1的菌株次之，為6.1%(6/98)，以CR-ECO 和CR-ECL 為主。3株CR-KPN同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1，未檢測到blaOXA-48、blaVIM-1和blaIMP-4型碳青霉烯酶。CR-KPN的MLST分型顯示，ST11為主要克隆株，占83.7%(72/86)，其次為ST37型，占5.8%(5/86)，此外還檢出2株ST258和1株ST147，另有6株未知型別。

2.3多重PCR檢測mcr基因的攜帶情況 98株CRE中mcr-1的檢出率為3.1%(3/98)，包括2株CR-KPN和1株CR-ECO。攜帶mcr-1耐藥基因的2株CR-KPN中僅有1株黏菌素藥敏結(jié)果為耐藥(MIC為4 mg/L)，攜帶mcr-1耐藥基因的1株CR-ECO黏菌素藥敏結(jié)果為敏感。7株CRE菌株黏菌素藥敏試驗(yàn)為耐藥，但僅在1株CR-KPN中檢出mcr-1耐藥基因。91株CRE菌株黏菌素藥敏結(jié)果為敏感，MIC分別為1 mg/L和2 mg/L，其中1株CR-ECO和1株CR-KPN檢出mcr-1耐藥基因。見表3。部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳見圖1。

表3 多重PCR和肉湯微量稀釋法檢測黏菌素耐藥情況

注：M，100～3 000 bp Ladder；1，陽性質(zhì)控；2和3，部分待測菌株；4，陰性質(zhì)控。

3 討論

本研究中，重癥監(jiān)護(hù)病房分離的CRE菌株主要來自痰液和血液，可能與重癥患者應(yīng)用抗菌藥物、制動臥床體位、機(jī)械通氣、接受創(chuàng)傷性手術(shù)或者侵入性操作治療有關(guān)。張安汝等[8]研究證實(shí),患者發(fā)生CRE感染前30 d內(nèi)有氣管插管、三/四代頭孢菌素、碳青霉烯類和喹諾酮類藥物使用史是CRE感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是感染CRE后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，對重癥監(jiān)護(hù)病房患者更應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物使用管理，建議進(jìn)行耐藥菌的主動篩查，以減少CRE感染的發(fā)生，提高患者生存率。

我院重癥監(jiān)護(hù)病房分離的CRE菌株呈多重耐藥，部分菌株僅保留了對頭孢他啶/阿維巴坦和黏菌素的敏感性。但是，隨著頭孢他啶/阿維巴坦和黏菌素在臨床中的應(yīng)用，相應(yīng)的耐藥菌株也相繼出現(xiàn)。本研究中，CR-KPN菌株以產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶KPC-2型為主，而CR-ECO和CR-ECL菌株以產(chǎn)B類金屬酶NDM-1為主，CRE中未檢測到碳青霉烯酶基因的菌株可能與外排泵基因(acrAB,tolC)表達(dá)增多、膜孔蛋白基因(ompK35,ompK36)功能缺失或突變有關(guān)[9]。

頭孢他啶/阿維巴坦2015年在美國上市，是美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的第一個用于治療CRE感染的抗菌藥物。頭孢他啶/阿維巴坦是一個三代頭孢菌素(頭孢他啶)和一個新型β內(nèi)酰胺酶抑制劑組成的復(fù)合制劑，后者可以抑制A、C和D類β-內(nèi)酰胺酶，在臨床使用中可以提高CR-KPN感染患者14 d臨床治愈率和30 d死亡率[10-11]。因此，在重癥監(jiān)護(hù)病房分離到CRE菌株時，進(jìn)行碳青霉烯酶酶型或基因型檢測非常重要，直接影響抗菌藥物的選擇和臨床治療效果。

黏菌素直接作用于革蘭陰性細(xì)菌外膜的脂多糖而發(fā)揮抗菌活性，在我國主要用于畜牧業(yè)，2017年進(jìn)入臨床使用，但使用率較低。本研究在98株CRE菌株中共檢出7株黏菌素耐藥菌株，黏菌素耐藥率為7.1%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黏菌素耐藥流行病學(xué)數(shù)據(jù)在國內(nèi)不同地區(qū)、不同國家之間均存在一定差異[12-13]。因此，需要針對特定人群尤其是重癥監(jiān)護(hù)病房患者進(jìn)行定向監(jiān)測。2015年，Liu等[14]學(xué)者首次在家畜中發(fā)現(xiàn)腸桿菌目細(xì)菌質(zhì)粒攜帶的黏菌素耐藥基因mcr-1，該基因由質(zhì)粒介導(dǎo)，可在不同種屬間水平播散，給臨床治療和感染防控帶來極大困難。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，mcr-1在黏菌素耐藥肺炎克雷伯菌中的檢出率為23.5%，本研究中7株CRE對黏菌素耐藥但mcr檢測陰性，提示黏菌素耐藥可能存在質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr基因外其他的耐藥機(jī)制，如pmrA/pmrB系統(tǒng)上調(diào)表達(dá)、新的mcr基因出現(xiàn)、外排泵活化或異質(zhì)性耐藥等[16-18]，從而導(dǎo)致脂多糖發(fā)生修飾，黏菌素耐藥發(fā)生。

本研究中，CR-KPN菌株最常見的基因型別為ST11型，既往研究證實(shí)該克隆株傳播性強(qiáng)，是臨床重癥感染的主要病原菌[19]。因此，在重癥監(jiān)護(hù)病房更應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生，做好環(huán)境清潔和消毒，加強(qiáng)患者監(jiān)測和環(huán)境監(jiān)測，遵守患者隔離和接觸預(yù)防原則，從而防止CRE菌株在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)的傳播。此外，知曉本病區(qū)CRE的流行情況、耐藥特征后，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)指南和規(guī)范更為合理地使用抗菌藥物，并做好抗菌藥物的保護(hù)工作。

綜上，重癥監(jiān)護(hù)病房分離的CRE菌株對大多數(shù)臨床常用抗菌藥物顯示多重耐藥，雖然頭孢他啶/阿維巴坦和黏菌素保持了較好的抗菌活性，但已經(jīng)出現(xiàn)對這2種藥物耐藥的菌株。為了避免出現(xiàn)治療效果不佳和感控難度加大，需要根據(jù)每株菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合患者機(jī)體狀況和重要臟器功能，謹(jǐn)慎選擇用藥，同時加強(qiáng)感染控制措施，避免耐藥菌株進(jìn)一步傳播。