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    中子背散射譜儀在蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

    2022-07-12 04:59:44顧旭東郭宏宇儲祥薔
    現(xiàn)代物理知識 2022年1期
    關(guān)鍵詞:背散射譜儀中子

    顧旭東 郭宏宇 儲祥薔

    (1.中國工程物理研究院研究生院 100193;2.中國科學(xué)院高能物理研究所 100049;3.散裂中子源科學(xué)中心 523803)

    蛋白質(zhì)是美妙生命世界的基礎(chǔ),承擔(dān)了生物體內(nèi)絕大多數(shù)的工作,其表現(xiàn)出的多樣性與專一性彰顯了大自然的深?yuàn)W與智慧。然而,要真正理解生命的奧秘,就要揭開蛋白質(zhì)這一復(fù)雜生物大分子的神秘面紗。蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域雖然存在重大的機(jī)遇,但也面臨巨大的挑戰(zhàn)①。蛋白質(zhì)是由約20種氨基酸組成的肽鏈經(jīng)過折疊、組裝構(gòu)成的具有多級結(jié)構(gòu)的生物大分子??臻g結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的功能具有決定性作用,但是僅依靠蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)并不能完全理解蛋白質(zhì)的工作機(jī)理。這是因?yàn)榘ㄕw柔性、結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)、局部受限運(yùn)動(dòng)在內(nèi)的蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)行為也會對蛋白質(zhì)的功能起到重大的影響。因此,從靜態(tài)結(jié)構(gòu)-動(dòng)力學(xué)行為-生物學(xué)功能相互關(guān)聯(lián)的角度去研究蛋白質(zhì),可以加深對蛋白質(zhì)分子機(jī)理的認(rèn)識,并已成為研究者之間的共識②③。在蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的研究中,中子散射憑借許多獨(dú)特的優(yōu)勢占據(jù)了不可替代的地位。

    中子在蛋白質(zhì)研究中最大的優(yōu)勢在于中子對氫元素的高度敏感性。氫原子是蛋白質(zhì)中數(shù)目最多的原子,參與形成的氫鍵深刻地影響著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)方式。然而氫原子只有一個(gè)電子,很難被X 光、電子等實(shí)驗(yàn)手段檢測到。不同的是,中子直接被原子核散射,對氫原子有非常好的響應(yīng)。氫原子對中子的非相干散射截面比生物體系中常見的其他原子高一個(gè)數(shù)量級④。非相干散射信號本質(zhì)上反映了原子的自相關(guān)性,因而非常適合動(dòng)力學(xué)的研究。此外,中子具有分辨同位素的能力且對氫和氘的散射截面差異巨大。用氘原子取代蛋白質(zhì)或溶劑中的氫原子給實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了一個(gè)新的自由度,并且蛋白質(zhì)的部分氘代技術(shù)已使得研究特定位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)成為可能。中子因其高穿透力、電中性、低能量的特點(diǎn),相較于X光和冷凍電鏡,更易在不破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的前提下完成對其結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)的原位探測。

    蛋白質(zhì)在不同時(shí)間空間尺度上的變化過程可用不同的中子散射技術(shù)進(jìn)行研究,如圖1 所示。發(fā)生在納秒到微秒時(shí)間尺度和原子到分子空間尺度的結(jié)構(gòu)域動(dòng)力學(xué)過程,可以通過中子自旋回波技術(shù)研究;發(fā)生在皮秒到納秒時(shí)間尺度上的分子內(nèi)部的弛豫運(yùn)動(dòng),可以用準(zhǔn)彈性中子散射技術(shù)研究;發(fā)生在飛秒到皮秒時(shí)間尺度的原子振動(dòng)帶來的聲子激發(fā),可以用非彈性中子散射技術(shù)觀測。這些不同空間尺度上的動(dòng)態(tài)過程共同實(shí)施促成了蛋白質(zhì)的功能,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)選擇合適的實(shí)驗(yàn)技術(shù)來研究不同時(shí)間尺度的動(dòng)態(tài)過程。

    圖1 用以研究蛋白質(zhì)不同時(shí)間空間尺度結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)信息的中子散射技術(shù)⑤

    準(zhǔn)彈性中子散射技術(shù)廣泛使用背散射譜儀研究蛋白質(zhì)體系的動(dòng)力學(xué)問題。中子背散射譜儀(NBS)具有高能量分辨率以及與蛋白質(zhì)局部弛豫運(yùn)動(dòng)相當(dāng)?shù)挠^測時(shí)間窗口(ps-ns)。蛋白質(zhì)在這一時(shí)間尺度上的弛豫運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為與分子活性高度相關(guān)⑥。國際上已有的中子背散射譜儀包括:澳大利亞核科學(xué)和技術(shù)組織(ANSTO)的EMU(圖2),法國勞厄-朗之萬研究所(ILL)的IN13 和IN16B,德國尤利希中子科學(xué)中心(JCNS)的SPHERES,美國國家標(biāo)準(zhǔn)局中子研究中心(NCNR)的高通量背散射譜儀(HFBS),美國橡樹嶺國家實(shí)驗(yàn)室(ORNL)的BASIS,英國散裂中子源(ISIS)的IRIS,日本加速器研究中心(J-PARC)的DNA 等。背散射譜儀的數(shù)量在全球范圍內(nèi)仍顯得稀少,這使得其實(shí)驗(yàn)機(jī)時(shí)成為一種寶貴的研究資源。幸運(yùn)的是位于東莞的中國散裂中子源(CSNS)正在籌建中國第一臺中子背散射譜儀,這將大幅推動(dòng)國內(nèi)中子科學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。

    圖2 EMU譜儀現(xiàn)場照片⑦

    一、背散射譜儀的原理

    中子準(zhǔn)彈性散射通過記錄中子被樣品散射前后的波矢變化(圖3)和能量轉(zhuǎn)移來獲得樣品的空間和運(yùn)動(dòng)信息。一般通過不同位置的3He探測器記錄散射前后中子出射方向相對入射方向的變化來獲得波矢轉(zhuǎn)移Q,而能量轉(zhuǎn)移通過記錄入射和出射的中子波長來獲得。

    圖3 波矢轉(zhuǎn)移示意圖

    在脈沖中子源上大多使用飛行時(shí)間技術(shù)確定中子波長,在反應(yīng)堆源上大多使用布拉格衍射(如下式)確定中子波長

    背散射譜儀高分辨率的實(shí)現(xiàn)利用了布拉格衍射束的波長擴(kuò)散Δλ隨散射角2θ增大至180°而減小的事實(shí),正如下式的布拉格定律的誤差傳遞公式所顯示的那樣⑧。

    公式中d表示晶面間距。在背散射情況下,θ接近90°,散射角帶來的誤差接近于0,因而能量分辨率最高。包括HFBS,Emu 在內(nèi)的大多數(shù)背散射譜儀使用了曲面Si(111)晶體作為入射中子的單色器和出射中子的能量分析器,這樣可以實(shí)現(xiàn)小于1μeV的能量分辨率⑨。如果使用平面Si(111)晶體,可進(jìn)一步提高分辨率,但會犧牲通量并且導(dǎo)致分辨率譜線偏離高斯分布。在ILL的IN16B上也提供了GaAs作為進(jìn)一步提高分辨率的選項(xiàng)⑩。

    圖4以NCNR的HFBS譜儀為例展示了背散射譜儀的原理。經(jīng)過多普勒單色器的能量為E=E0+ΔE的入射中子被樣品散射后,垂直入射到分布于球形空間的單晶分析陣列,根據(jù)布拉格定律只有能量為的中子被分析晶體反射,其余能量的中子穿過分析器被后方的吸收材料吸收。被分析器反射后的中子被樣品附近的探測器收集到。由此可以測得中子能量轉(zhuǎn)移為ΔE,散射矢量Q可以由入射波長和散射角度算出。由背散射譜儀的工作原理可知,背散射譜儀在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)只能探測一個(gè)能量轉(zhuǎn)移的信號。為了得到能量轉(zhuǎn)移譜,需要隨時(shí)間改變?nèi)肷渲凶拥哪芰浚诜磻?yīng)堆源上這項(xiàng)工作由多普勒單色器完成。多普勒單色器使用與分析器相同的單晶,在靜止條件下,分析器反射的中子能量為E0,此時(shí)得到的是彈性散射信號。通過改變晶體溫度以改變晶面間距d或是將多普勒單色器沿束流方向做周期性機(jī)械運(yùn)動(dòng),可以調(diào)制反射中子的能量為E=E0+ΔE。背散射譜儀探測能量覆蓋的范圍±ΔEmax取決于多普勒單色器可以提供的移動(dòng)速度或溫度范圍⑦。

    圖4 背散射譜儀HFBS原理示意圖?

    在散裂中子源上,由于束流本身帶有能量展寬的脈沖信號,可用長導(dǎo)管分離不同速度的中子并通過飛行時(shí)間計(jì)算出能量。由于調(diào)制入射中子能量方式的差異,通常飛行時(shí)間中子背散射譜儀(TOF-NBS)會有更大的測量能量范圍?。圖5 展示了英國散裂中子源上的TOF-NBS譜儀IRIS的布局示意圖。

    圖5 英國散裂中子源上的TOF-NBS譜儀IRIS的布局示意圖?

    二、數(shù)據(jù)分析原理

    (1)能域分析:

    中子背散射譜儀得到的信號是中子計(jì)數(shù)關(guān)于能量轉(zhuǎn)移ΔE和散射矢量Q的函數(shù),通過空樣品皿矯正、探測器效率矯正、對Q和ΔE按需求重新分組(rebin)、歸一化等步驟,可以獲得動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子S(Q,ω),其中ω與能量轉(zhuǎn)移ΔE的關(guān)系為ΔE=?ω。動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子包含了樣品的空間約束和動(dòng)力學(xué)在內(nèi)的信息?。背散射譜儀的能量分辨率在μeV 量級,能量轉(zhuǎn)移的范圍可從μeV到meV,對應(yīng)的時(shí)間尺度為皮秒到納秒,這個(gè)尺度主要觀測的是蛋白質(zhì)的局部弛豫運(yùn)動(dòng),例如蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈的擴(kuò)散和旋轉(zhuǎn),這些運(yùn)動(dòng)信息是蛋白質(zhì)的固有特征,與蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)息息相關(guān)。

    為了深入分析動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子中的信息,通常的處理方法是將S(Q,ω)拆分成兩部分的貢獻(xiàn):

    其中A(Q)被稱為彈性非相干結(jié)構(gòu)因子(EISF),提供了實(shí)驗(yàn)觀測的時(shí)間窗口內(nèi)原子所受空間約束的信息。這些原子不與中子發(fā)生能量交換或其運(yùn)動(dòng)不在時(shí)間觀測窗口內(nèi),因此反映在動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子中的貢獻(xiàn)是一個(gè)代表彈性散射的δ函數(shù)。由于背散射能譜觀測到的主要是氫的非相干信號,因此描述EISF 的模型通??紤]了一個(gè)原子在特定約束條件下的運(yùn)動(dòng),比如在無法穿透的球殼中的自由擴(kuò)散,拋物線勢,在圓上的特定位點(diǎn)的跳躍等。L(Γ,ω)包含了時(shí)間窗口內(nèi)所有運(yùn)動(dòng)原子的信息,通??梢杂靡粋€(gè)或多個(gè)洛倫茲函數(shù)來描述。洛倫茲函數(shù)的半高半寬(HWHM)Γ(Q)稱為有效弛豫常數(shù)。在原子做最簡單的菲克擴(kuò)散的情況下,有?!豎2。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中的原子處在一個(gè)復(fù)雜的能量景觀下,Γ的形式也會發(fā)生顯著的變化,為此有許多模型被提出,包括跳躍擴(kuò)散模型?,在高斯勢阱中的擴(kuò)散模型?,拉伸指數(shù)衰減模型KWW函數(shù)?等。

    (2)時(shí)域分析:

    將動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子S(Q,ω)作ω →t的傅里葉變換到時(shí)域(圖6),可以獲得中間散射函數(shù)(Intermediate scattering function,ISF)F(Q,t),ISF 是一種密度-密度關(guān)聯(lián)函數(shù),它的物理含義表示了氫原子在t時(shí)刻的位置與它自身在0時(shí)刻的位置的關(guān)聯(lián)性。這一函數(shù)為研究者揭示蛋白質(zhì)分子弛豫動(dòng)力學(xué)提供了重要工具。值得一提的是,中間散射函數(shù)可以通過分子動(dòng)力學(xué)模擬直接獲得,這使得背散射譜儀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以方便地與模擬結(jié)果聯(lián)系起來。

    圖6 飛行時(shí)間中子背散射(TOF-NBS)譜儀BASIS上測得的能域數(shù)據(jù)(a)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子S(Q,ω)可以通過傅里葉變換轉(zhuǎn)換成時(shí)域中的中間散射函數(shù)ISF(b)?

    在時(shí)域分析中也有一系列模型被提出。由于蛋白質(zhì)和玻璃形成液體在許多方面有著共同的動(dòng)力學(xué)行為,因此可以借用描述液體的模態(tài)耦合理論?(Mode-Coupling Theory,MCT)來描述蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)行為,這種方法已經(jīng)在多項(xiàng)研究中被證明有效?-?。按照MCT理論,ISF可以用以下漸進(jìn)式擬合:

    其中τβ和τα分別是β和α弛豫的特征時(shí)間,分別對應(yīng)了蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)過程中的局域運(yùn)動(dòng)和結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng),中子背散射譜儀的時(shí)間觀測尺度(ps-ns)通常比α弛豫的時(shí)間尺度(μs-ms)短得多,因此α弛豫項(xiàng)近似為1。從MCT 模型中得到的弛豫時(shí)間是描述蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù),可以幫助我們理解蛋白質(zhì)的作用機(jī)理。

    (3)均方位移(MSD):

    在不依賴模型的分析方法中,利用背散射譜儀的彈性掃描模式對全體原子均方位移(MSD)進(jìn)行測量也可以提供關(guān)于內(nèi)部結(jié)構(gòu)所受空間約束的信息。均方位移記錄了蛋白質(zhì)中原子在一段時(shí)間的運(yùn)動(dòng)后偏離初始位置的程度,由于中子準(zhǔn)彈性散射觀測蛋白質(zhì)主要得到的是氫的非相干信號,因此實(shí)驗(yàn)所得的MSD代表了所有氫原子運(yùn)動(dòng)距離平方的平均。MSD 可以從德拜沃倫因子(Debye-Waller factor)計(jì)算得出,德拜沃倫因子的表達(dá)式為

    實(shí)驗(yàn)中德拜沃倫因子可以通過計(jì)算彈性散射強(qiáng)度Iel(Q,T,ω=0)和它在低溫極限下的值Iel(Q,T=0,ω=0)的比獲得。

    作ln(SH(Q,ω=0))vs.Q2圖,對小Q部分線性擬合所得的斜率即MSD,只取小Q部分?jǐn)M合是因?yàn)榈掳菸謧愐蜃拥耐茖?dǎo)中含有高斯近似,高斯近似只在小Q范圍內(nèi)成立?。

    MSD在生物學(xué)中又稱為B因子,可以表征蛋白質(zhì)的不同部分的相對振動(dòng)?。盡管MSD 得到的信息是平均的,無法得到底層的動(dòng)力學(xué)信息,但可以借此表征蛋白質(zhì)整體的“柔軟程度”?。MSD提供了一種模型無關(guān)的監(jiān)測變化的手段,允許我們實(shí)時(shí),快速地測量升溫和降溫過程中的動(dòng)力學(xué)信息。這一點(diǎn)彌補(bǔ)了準(zhǔn)彈性散射達(dá)到統(tǒng)計(jì)質(zhì)量的數(shù)據(jù)所需的時(shí)間過長的缺陷,為我們提供了一種有力的研究手段。

    三、應(yīng)用舉例

    隨著中子背散射譜儀在蛋白質(zhì)研究中的強(qiáng)大功能被越來越多的研究者認(rèn)識到,近年來依托背散射譜儀的研究工作在該領(lǐng)域產(chǎn)生了一大批有價(jià)值的研究成果。以下對幾個(gè)具有前景和參考價(jià)值的工作做些簡要介紹。

    儲祥薔研究組研究了一種來自深海嗜熱菌的寡聚蛋白?。在NCNR的高通量背散射譜儀(HFBS)和飛行時(shí)間譜儀(DCS)上,他們利用準(zhǔn)彈性中子散射技術(shù)研究了目標(biāo)蛋白在100 ps~2 ns時(shí)間尺度上的弛豫動(dòng)力學(xué)。結(jié)果揭示:該嗜熱蛋白相比于作為對照物的嗜溫蛋白溶菌酶在高壓條件下具有更好的結(jié)構(gòu)靈活性和快得多的弛豫運(yùn)動(dòng)。這一結(jié)果歸因于嗜熱蛋白的高度對稱和封閉的寡聚結(jié)構(gòu),導(dǎo)致高壓條件下嗜熱蛋白的能量景觀的扭曲效應(yīng)與嗜溫蛋白顯著不同(圖7)。這項(xiàng)工作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),相關(guān)研究發(fā)表在2015年的PNAS上。

    圖7 嗜熱蛋白(IPPase)和嗜溫蛋白(HEWL)變性相圖及能量景觀示意圖?

    法國的Giorgio Schiro 研究小組利用中子準(zhǔn)彈性散射研究了結(jié)合水的平移擴(kuò)散與本質(zhì)無序蛋白功能實(shí)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性?。結(jié)合水和蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)多次被發(fā)現(xiàn),理解表面結(jié)合水的生物效應(yīng)對深入刻畫蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)過程具有重大意義④。這項(xiàng)工作利用中子散射實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢,研究蛋白質(zhì)和結(jié)合水聯(lián)系中的重要因素氫鍵,實(shí)驗(yàn)是在德國JSNC 的背散射譜儀SPHERES上完成的。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合水的平動(dòng)成分在240K附近的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度處明顯增加,提出了蛋白質(zhì)表面結(jié)合水的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)功能所需的大振幅運(yùn)動(dòng)的觀點(diǎn)。

    2019 年日本的Fujiwara 等在日本加速器研究中心(J-PARC)的材料與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)施(MLF)的飛行時(shí)間背散射譜儀DNA 上?結(jié)合準(zhǔn)彈性中子散射和小角X 光散射(SAXS)研究了一種可以合成淀粉狀纖維的無定型蛋白αSyn。αSyn 合成的淀粉狀纖維被認(rèn)為與帕金森病和其他細(xì)胞核病有關(guān),因此對αSyn 機(jī)制的研究對于闡明這些疾病的發(fā)病機(jī)制有重大的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,αSyn纖維的形成不僅需要局域運(yùn)動(dòng),而且還需要N、C 端的鏈運(yùn)動(dòng),使中心NAC結(jié)構(gòu)域暴露。這一研究給開發(fā)治療帕金森病的新型藥物帶來了靈感,不同于此前以NAC區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)的思路,可以選擇蛋白質(zhì)N端和C端作為藥物靶點(diǎn),通過抑制鏈端運(yùn)動(dòng)來阻止淀粉狀纖維的合成。

    四、總結(jié)與展望

    近年來,中子背散射譜儀的設(shè)計(jì)、配套軟件以及分析理論都得到進(jìn)一步的發(fā)展,使得準(zhǔn)彈性中子散射實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以惠及更多科研工作者。中子背散射對氫原子敏感、其觀測尺度與蛋白質(zhì)局部弛豫相匹配、又具有無損原位觀測的能力,這些特點(diǎn)使得中子背散射技術(shù)在蛋白質(zhì)研究上具有其他實(shí)驗(yàn)手段不具備的突出優(yōu)勢。中國的第一臺中子背散射譜儀作為散裂中子源二期工程的一部分已列入國家十四五規(guī)劃,有望在2025 年建成??梢灶A(yù)見CSNS的中子背散射譜儀將驅(qū)動(dòng)我國相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)入快車道。利用中子背散射譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)相關(guān)的研究,預(yù)期在以下幾個(gè)方向?qū)⑷〉弥匾M(jìn)展:(1)中子準(zhǔn)彈性散射技術(shù)和氘代技術(shù)結(jié)合研究蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)過程,例如藥物分子的定向投放酶?,與底物的特異性結(jié)合等;(2)蛋白質(zhì)表面結(jié)合水動(dòng)態(tài)過程與功能的關(guān)聯(lián)性研究;(3)中子背散射譜儀與自旋回波、飛行時(shí)間譜儀結(jié)合研究蛋白質(zhì)全時(shí)間尺度的動(dòng)態(tài)過程,有助于闡述蛋白質(zhì)的工作機(jī)理。

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