超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇?xì)埩袅康姆椒▋?yōu)化

鐘名琴 陳彤 丁燕玲 黃婷 何玉榆 譚磊

摘? 要：建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇?xì)埩袅康姆治龇椒?。樣本?jīng)乙腈提取、無水硫酸鈉除水后離心，將上層提取液用氮?dú)獯抵两?，乙腈溶解后直接?jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇在1.00 ng/mL～50.0 ng/mL內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均為0.999 5;α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的方法檢出限分別為9.22×10-2 μg/kg、6.28×10-2 μg/kg;平均回收率分別為81.5%～105.0%和86.7%～97.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.3%～6.9%和1.8%～5.6%。結(jié)果顯示該方法靈敏度好，準(zhǔn)確度高，操作步驟簡單，檢測時(shí)間大大縮減至2 h，且有效減少了其他方法中用易揮發(fā)性無水乙醚提取時(shí)出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象及對(duì)操作人員的傷害，適用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的檢測。

關(guān)鍵詞：α-玉米赤霉醇;β-玉米赤霉醇;牛奶;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

作者簡介：鐘名琴（1992— ），女，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)業(yè)投入品監(jiān)測工作

*通信作者：譚磊，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事獸藥殘留檢測與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作;E-mail： 157197202@qq.com

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，牛奶的銷量也不斷增加，能為人類提供蛋白質(zhì)、維生素和鈣等營養(yǎng)物質(zhì)。玉米赤霉醇是人工合成的非類固醇同化性激素，曾被官方批準(zhǔn)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[1]，用來提高畜禽的飼料轉(zhuǎn)化率[2]，促進(jìn)它們的生長[3]。然而，農(nóng)產(chǎn)品在生長期間，飼料和農(nóng)產(chǎn)品在加工、貯藏、運(yùn)輸過程中，均易造成玉米赤霉醇類藥物污染。當(dāng)給奶牛飼喂受到污染的飼料時(shí)，飼料中的玉米赤霉醇等可通過血-乳屏障進(jìn)入到牛奶中，導(dǎo)致食用牛奶含有玉米赤霉醇類藥物，并通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，影響和破壞人畜的生長發(fā)育及生殖系統(tǒng)等。這不僅會(huì)給畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)對(duì)食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因此已成為各地政府關(guān)注的問題。20世紀(jì)80年代左右，毒理學(xué)研究表明，這類藥物會(huì)引發(fā)癌癥。為了防止這些激素隨畜產(chǎn)品進(jìn)入人體，各國陸續(xù)頒布法令，禁止在畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中使用。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號(hào)公告明確規(guī)定，在食品生產(chǎn)動(dòng)物的飼養(yǎng)中禁止使用玉米赤霉醇，所產(chǎn)出的所有可食用動(dòng)物產(chǎn)品不得檢出[4]。

為有效監(jiān)督牛奶質(zhì)量安全，建立一種快速、可靠、準(zhǔn)確、靈敏的玉米赤霉醇?xì)埩袅康姆治龇椒ň哂兄匾饬x。目前，玉米赤霉醇類藥物的測定方法有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）[5]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunoassay，ELISA）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromagraphy-mass spectrometry，LC-MS/MS）等[9-11]，雖然相關(guān)文獻(xiàn)已報(bào)道可用LC-MS/MS測定牛奶中的玉米赤霉醇，但是大多數(shù)檢測方法存在操作復(fù)雜、提取效果差、回收率低的缺點(diǎn)。

本方法優(yōu)化并建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來檢測牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的殘留量。該方法簡便可靠、靈敏度好、準(zhǔn)確度高，無需經(jīng)過凈化可直接上機(jī)測定，有效解決了傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，GB/T 23218-2008中前處理過程繁瑣[12]，易揮發(fā)性無水乙醚作為提取試劑具有提取分離效果差、對(duì)操作人員身體健康造成較大危害的缺陷，從而為食品安全和人們身體健康提供保障。

1? 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀、配有電噴霧（ESI）離子源的AB Sciex Triple QuadTM 5500 質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）、N-EVAP-24型全自動(dòng)氮吹儀、IKA旋渦混合器、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3-30KS離心機(jī)、Milli-Q Integral 3 型超純水儀、奧特賽斯AS 系列超聲波清洗機(jī)、CEM PHOENIX微波馬弗爐。

1.1.2 藥品與試劑

乙腈（色譜純）、無水硫酸鈉（分析純，使用前需540 ℃烘干8 h）等。

α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇：純度高于90.0%，均為德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

1.2 樣本制備

取代表性樣本約500 g，混勻，裝入潔凈容器，密封，標(biāo)記。在抽樣及制備的操作過程中，應(yīng)防止樣本收到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。并將試樣于0 ℃～4 ℃保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈溶解并稀釋成濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃以下冷凍避光保存6個(gè)月。再分別移取適量上述各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣本前處理

準(zhǔn)確稱取牛奶樣本2.0 g±0.02 g于? ?50 mL離心管中，加入10 mL乙腈后立即渦旋搖勻，再加入4 g無水硫酸鈉，渦旋混勻4 min，超聲提取10 min，4 ℃ 9 000 r/min離心8 min，吸取上清液，氮吹近干，用1.00 mL乙腈復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后，可直接上機(jī)測定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）;流動(dòng)相A為純水;流動(dòng)相B為乙腈（色譜純）;柱溫40.0 ℃;進(jìn)樣體積5.00 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源;掃描方式：負(fù)離子掃描;檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple-reaction monitoring，MRM）;電噴霧電壓： -4.5 kV;離子源溫度：500 ℃;氣簾氣壓力：35.0 psi;碰撞氣壓力：9 psi;霧化器壓力：55.0 psi;輔助加熱器壓力：55.0 psi。

保留時(shí)間、定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量見表2。

空白基質(zhì)分別添加10.0 μg/kg α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的色譜圖見圖1。

2? 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取5個(gè)牛奶空白基質(zhì)樣本，按“1.4 樣本前處理”的方法處理，獲得空白樣本提取液。將空白樣本基質(zhì)配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度依次為：1.00 ng/mL、? ? ? ? 2.00 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL）。按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。可發(fā)現(xiàn)基質(zhì)試驗(yàn)峰面積與相應(yīng)回收濃度的線性關(guān)系好，其中α-玉米赤霉醇的相關(guān)系數(shù)為r=0.999 5，β-玉米赤霉醇的相關(guān)系數(shù)為r=0.999 5，具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白牛奶樣本為基質(zhì)，做七個(gè)平行添加試驗(yàn)，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的陽性添加濃度均為1.00 μg/kg，按照1.4進(jìn)行前處理，進(jìn)行上機(jī)測定。根據(jù)各樣本檢測值計(jì)算出平均值X及標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，按公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X（k為置信因子，一般取3;C為理論加標(biāo)水平，單位為μg/kg）計(jì)算，測得α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的方法檢出限分別為9.22×10-2 μg/kg、6.28×10-2 μg/kg，見表3。

2.3 方法回收率和精密度驗(yàn)證

用空白牛奶基質(zhì)樣本分別對(duì)α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇進(jìn)行3個(gè)不同濃度水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平均取6個(gè)平行樣，陽性添加濃度分別為1.00 μg/kg、2.00μg/kg、10.0 μg/kg。按“1.4 樣本前處理”的方法進(jìn)行處理，處理好的樣本供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。牛奶樣本中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果詳見表4。

由表4可知，該方法的回收率較好，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的回收率分別為81.5%～105.0%、86.7%～97.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7.0%，說明該方法重復(fù)性好、定性、定量準(zhǔn)確，并且峰形受基質(zhì)的干擾比較小。

3? 結(jié)論

本方法旨在建立一種牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜簡便測定方法，為相關(guān)監(jiān)管部門監(jiān)管快速、準(zhǔn)確測定牛奶中該類藥物提供方法參考和技術(shù)支持。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以在很大限度上減少樣本前處理時(shí)間，方法靈敏度及準(zhǔn)確度高，提取分離度好。與傳統(tǒng)的方法相比，該方法采用乙腈直接提取的方式極大限度提高了檢測效率，可適用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇?xì)埩袅康亩ㄐ?、定量檢測。

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