氯化兩面針堿通過PI3K/Akt/Bcl-2/caspase-3/PARP通路誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1688和H446凋亡

于 菲，羅 卓，黎 驪，莫小香，沈小菊，莫孝成，譚惟丹，何敬川，鄧志華，陽 潔

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞與免疫實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021;3.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022)

小細(xì)胞肺癌作為惡性程度最高的肺部腫瘤，臨床上分為局限期和廣泛期，多數(shù)患者就診時(shí)已是廣泛期，難以進(jìn)行手術(shù)治療、只能放化療[1]。順鉑作為臨床主要用藥(cisplatin，DDP)，與依托泊苷的聯(lián)合治療是SCLC一線治療的首選方案。但是，絕大多數(shù)患者易快速耐藥而復(fù)發(fā)[2]。目前針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的特異性靶向藥對(duì)SCLC的治療反應(yīng)欠佳，治療進(jìn)展極為緩慢，因此，亟需發(fā)現(xiàn)新的SCLC治療靶點(diǎn)和藥物[3]。

兩面針(Zanthoxylumnitidum)是我國常用抗腫瘤壯藥，又名入地金牛、雙面刺、雙背針、山椒、下山虎等，為蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根，主產(chǎn)于廣西、福建、湖南、廣東、云南等地。據(jù)2020年版《中國藥典》記載其具有“行氣止痛，活血散瘀，通絡(luò)祛風(fēng)等功效”，歸肝、胃經(jīng)[4]。氯化兩面針堿是從兩面針的干燥根莖中提取的一種苯駢菲啶類生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1所示[5]。研究表明氯化兩面針堿對(duì)乳腺癌、肝癌及鼻咽癌等多種惡性腫瘤具有抗腫瘤活性[6]，但目前對(duì)小細(xì)胞肺癌的研究甚少。因此，本研究以小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1688和H446為研究對(duì)象，將順鉑作為陽性對(duì)照藥，采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測氯化兩面針堿對(duì)SCLC細(xì)胞活力和凋亡的影響；通過倒置顯微鏡和HE染色觀察氯化兩面針堿處理后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；通過蛋白免疫印跡法(Western blot)進(jìn)一步探究氯化兩面針堿處理SCLC細(xì)胞后相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，從而闡明氯化兩面針堿誘導(dǎo)SCLC發(fā)生凋亡的分子機(jī)制。

Fig 1 Chemical structure of nitidine chloride

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株SCLC 細(xì)胞株NCI-H1688、NCI-H446、NCI-H209來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海)，NCI-H196來源于美國細(xì)胞培養(yǎng)收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)基為 RPMI1640，含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗。

1.2 藥物與試劑氯化兩面針堿，純度HPLC ≥ 98%，北京索萊寶公司，用二甲基亞砜(DMSO)配成1 g·L-1的貯存液；順鉑，齊魯制藥，用生理鹽水配成 1 g·L-1的貯存液；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，北京索萊寶公司；胰酶粉末，北京索萊寶公司；青-鏈霉素雙抗，北京索萊寶公司；AnnexinV-PE/ 7-AAD凋亡試劑盒，聯(lián)科生物；伊紅，北京索萊寶公司；蘇木精，北京中杉新橋生物技術(shù)公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒，5×Loading buffer，雙色預(yù)染蛋白Marker(10 ku～250 ku)，上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；caspase-3、cleaved-caspase-3、p-Akt美國CST公司；Bax、Bcl-2、PARP(武漢Proteintech公司)；p-PI3K 北京博奧森公司。

1.3 主要儀器CO2培養(yǎng)箱，美國 Thermo 公司公司(3110)；細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司(YJ-1360)；熒光倒置相差顯微鏡，日本 NIKON 公司(TS100-F)；多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰公司(SynergyH1)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司；雙色紅外成像系統(tǒng)(掃膜儀)，美國Licor公司(ODYSSEY)；低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司(5810R)。

1.4 方法

1.4.1MTT 法檢測氯化兩面針堿對(duì)SCLC細(xì)胞活性的影響 將H1688、H446、H196及H209細(xì)胞培養(yǎng)于25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用PBS洗2遍細(xì)胞，然后用0.25%胰酶進(jìn)行消化，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別制成單細(xì)胞懸液，將H1688、H446、H196及H209細(xì)胞分別以每孔3 000、5 000、3 000、3 000、20 000個(gè)/孔的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔細(xì)胞懸液100 μL，每個(gè)分組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。待24 h細(xì)胞貼壁后分別以0、0.5、1、2、4、8、16 μmol·L-1的氯化兩面針堿作用48 h以及0、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1的順鉑作為陽性對(duì)照藥物組作用48 h后，每孔加入20 μL 0.5 mg·L-1的MTT，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h后，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，放置于搖床快速震蕩10 min后，在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(OD)。計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)×100%。取平均值繪制藥物劑量效應(yīng)曲線，通過SPSS計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。本實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照組(Control)為0.1% DMSO。

1.4.2倒置顯微鏡及HE染色法觀察給藥前后H1688和H446細(xì)胞細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)變化 將H1688和H446細(xì)胞用PBS清洗2遍，胰酶消化，計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞接種到24孔板中，每孔細(xì)胞懸液500 μL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待24 h細(xì)胞貼壁后，給予對(duì)應(yīng)濃度氯化兩面針堿或順鉑孵育，實(shí)驗(yàn)分組情況同方法“2.4”部分表1。藥物處理48 h后，于倒置顯微鏡下觀察藥物處理后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照；棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌2次，每次1 min。蘇木精染色5 min，自來水洗滌。伊紅染色5 min，自來水洗滌，與倒置顯微鏡下觀察藥物處理后細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)改變并拍照。

1.4.3流式細(xì)胞術(shù)檢測氯化兩面針堿對(duì)H1688 和H446細(xì)胞凋亡的影響 按 AnnexinV-PE/ 7-AAD cell apoptosis 試劑盒說明書操作，主要步驟為：取對(duì)數(shù)生長期的H1688和H446 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后采用氯化兩面針堿低濃度組、氯化兩面針堿高濃度組、順鉑組及DMSO對(duì)照組分別處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組情況同方法“2.4”部分Tab 1。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化，用離心管收集各組細(xì)胞，800 r·min-1離心5 min，棄去上清，用預(yù)冷PBS重懸離心洗滌，800 r·min-1離心5min，棄去上清，留細(xì)胞沉淀，加入400 μL 1×Binding buffer 工作液，吹打混勻后轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液至流式管，每管加入5 μL AnnexinV-PE 和 5 μL 7-AAD混勻后，室溫避光孵育15 min，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析。

1.4.4MTT法檢測凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)氯化兩面針堿或順鉑對(duì) SCLC 細(xì)胞株H1688、H446細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期的H1688和H446細(xì)胞，分別以每孔3 000、5 000個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁24 h后，吸走培養(yǎng)液上清后，依次向每孔加入含有藥物RPMI1640完全培養(yǎng)基溶液100 μL，實(shí)驗(yàn)分組和加藥濃度如Tab 1和Tab 2，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，往每孔加入20 μL 0.5 mg·L-1的MTT，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h后，小心吸去培養(yǎng)液，應(yīng)盡量避免吸到紫色結(jié)晶沉淀，每孔加入150 μL DMSO，放置于搖床快速震蕩10 min后，在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(OD)。計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)×100%。

Tab 1 Experimental grouping and concentration-nitidine chloride or cisplatin

Tab 2 Experimental grouping and concentration-nitidine chloride/cisplatin + Z-VAD-FMK

1.4.5Western blot法檢測SCLC細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、PARP、cleaved PARP、caspase-3、cleaved-caspase-3、p-Akt蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞處理及給藥方法同方法“2.3部分”，實(shí)驗(yàn)分組情況同方法“2.4”部分Tab 1。細(xì)胞用藥物處理48 h后，收集舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，胰酶消化，收集細(xì)胞，800 r·min-1，離心5 min。根據(jù)細(xì)胞數(shù)加入適量的1×RIPA buffer裂解(含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min后，用細(xì)胞刮收集蛋白，12 000×g離心30 min后吸取上清，用 BCA 法檢測蛋白濃度后，按比例加入5×Loading buffer，100 ℃水浴孵育5 min使蛋白變性。根據(jù)待檢測蛋白的分子量大小，制備12.5%的聚丙烯酰胺凝膠，取30 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)膜。在5%脫脂奶粉中常溫封閉1 h，加入一抗溶液在4 ℃下孵育過夜，d 2回收一抗，用PBST緩沖液洗滌3次后，加入抗兔或鼠IgG二抗溶液，在室溫下孵育1 h，PBST緩沖液洗滌3次。將PVDF膜置于Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)中，按照儀器說明進(jìn)行掃描，結(jié)果以ImageJ軟件進(jìn)行測量分析。

2 結(jié)果

2.1 氯化兩面針堿可呈濃度依賴性地抑制人 SCLC 細(xì)胞株 H1688、H446、H196、H209的活力結(jié)果如Fig 2所示，隨著氯化兩面針堿濃度(0、0.5、1、2、4、8、16 μmol·L-1)的升高，H1688、H446、H196和H209的細(xì)胞活力逐漸降低，表明氯化兩面針堿可呈濃度依賴性地抑制SCLC細(xì)胞活力。如Tab 3所示，氯化兩面針堿或順鉑作用于H1688細(xì)胞48 h的IC50分別為(1.52±0.08)、(16.93±1.51) μmol·L-1，H446細(xì)胞分別為(1.99±0.21)、(16.72±1.70) μmol·L-1，H196細(xì)胞分別為(4.65±0.57)、(16.22±1.73) μmol·L-1以及H209細(xì)胞分別為(3.26±0.09)、(35.02±1.85) μmol·L-1。以上結(jié)果表明，相比順鉑(16.2～35.0 μmol·L-1)氯化兩面針堿以更小的劑量(1.5～4.6 μmol·L-1)抑制SCLC 細(xì)胞活力。其中氯化兩面針堿對(duì)H1688和H446細(xì)胞的體外抑制效果更好，因此，我們選擇H1688和H446細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。用SPSS軟件計(jì)算得到氯化兩面針堿處理H1688細(xì)胞48 h的IC20和IC60分別為0.5和1 μmol·L-1，對(duì)H446細(xì)胞48 h的IC20和IC60分別為0.75和1.5 μmol·L-1。因此我們選擇0.5和1 μmol·L-1作為H688細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件，選擇0.75和1.5 μmol·L-1作為H446細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件，陽性對(duì)照藥物順鉑組我們統(tǒng)一選擇15 μmol·L-1作為兩株細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件進(jìn)行研究。

Fig 2 Effect of nitidine chloride on activity of human SCLC cell lines H1688, H446, H196,

Tab 3 Comparison of 48 h IC50 of human SCLC cell lines H1688, H446, H196 and H209 treated with nitidine chloride or cisplatin ，n=3)

2.2 氯化兩面針堿呈劑量依賴性誘導(dǎo) H1688和H446 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)特征結(jié)果如Fig 3所示，0.1%DMSO處理的陰性對(duì)照組(Control)H1688細(xì)胞呈菱形，H446細(xì)胞呈卵圓形、三角形，細(xì)胞大小均勻一致，細(xì)胞膜完整，分裂狀態(tài)正常。與陰性對(duì)照組(Control)相比，用15 μmol·L-1DDP處理的H1688和H446細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮，部分細(xì)胞呈長梭形，胞膜上有小泡狀形成，呈現(xiàn)出凋亡形態(tài)特征。與陽性對(duì)照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，凋亡細(xì)胞增多。以上結(jié)果表明，氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)特征。

Fig 3 Density and morphological changes of cells in each group observed by inverted fluorescence microscope

結(jié)果如Fig 4所示，0.1%DMSO處理的陰性對(duì)照組(Control)細(xì)胞胞質(zhì)呈紅紫色，胞核呈深紫色，細(xì)胞形態(tài)完整，胞質(zhì)較豐富且無明顯變化；與陰性對(duì)照組(Control)相比，用15 μmol·L-1DDP處理的H1688和H446細(xì)胞胞質(zhì)密度下降，細(xì)胞質(zhì)減少，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核邊集。與陽性對(duì)照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，H1688細(xì)胞和H446細(xì)胞出現(xiàn)胞漿流失，細(xì)胞核固縮、邊集化現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，氯化兩面針堿可能誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Fig 4 The morphological changes of cells observed by HE staining in each group after treatment with nitidine chloride

2.3 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地升高H1688 和H446細(xì)胞凋亡率結(jié)果如Fig 5所示，與0.1%DMSO處理的陰性對(duì)照組(Control)比較，用陽性對(duì)照藥物順鉑處理H1688和H446細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率升高。與陽性對(duì)照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，氯化兩面針堿處理的H1688和H446細(xì)胞凋亡率顯著升高。以上結(jié)果表明，氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Fig 5 The apoptotic rate of H1688 and H446 cells increased by nitidine chloride in a dose-dependent ，n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs Control

2.4 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地激活H1688 和H446細(xì)胞caspase-3和PARP蛋白表達(dá)結(jié)果如Fig 6所示，與0.1%DMSO處理的陰性對(duì)照組(Control)比較，用陽性對(duì)照藥物順鉑處理H1688和H446細(xì)胞后，H1688和H446細(xì)胞cleaved-caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)均明顯升高。與陽性對(duì)照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，氯化兩面針堿1 μmol·L-1處理的H1688細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，氯化兩面針堿0.5、1μmol·L-1處理的H1688細(xì)胞cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯升高；氯化兩面針堿0.75、1.5 μmol·L-1處理的 H446細(xì)胞cleaved-caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)明顯升高。以上結(jié)果表明，氯化兩面針堿可激活H1688和H446細(xì)胞caspase-3和PARP蛋白表達(dá)。

Fig 6 Caspase-3 and PARP protein expression in H1688 and H446 cells activated by nitidine chloride in a dose-dependent ，n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs Control

2.5 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地升高H1688和H446細(xì)胞Bax表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)Bcl-2家族作為caspase-3的上游調(diào)節(jié)信號(hào)，可作為凋亡信號(hào)的開關(guān)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。其中，Bax/Bcl-2比值通?？勺鳛榧?xì)胞抗凋亡能力的評(píng)判指標(biāo)[7]。結(jié)果如Fig 7所示，與0.1%DMSO處理的陰性對(duì)照組(Control)對(duì)照組比較，用15 μmol·L-1DDP處理H1688和H446細(xì)胞后，兩株細(xì)胞的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值明顯升高。與陽性對(duì)照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，H1688和H446細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值明顯升高。以上結(jié)果表明，氯化兩面針堿可升高H1688和H446細(xì)胞Bax表達(dá)、降低Bcl-2蛋白表達(dá)。

Fig 7 Ratio of Bax/Bcl-2 protein expression in H1688 and H446 cells increased by nitidine chloride in a dose-dependent manner *P<0.05，**P<0.01 vs Control

2.6 凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)氯化兩面針堿或順鉑誘導(dǎo)H1688和H446細(xì)胞凋亡的影響凋亡抑制劑Z-VAD-FMK能以不可逆的形式與活化的半胱氨酸蛋白酶caspases結(jié)合，從而阻斷細(xì)胞凋亡。結(jié)果如Fig 8所示，與單用氯化兩面針堿或順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)比較，當(dāng)?shù)蛲鲆种苿㈱-VAD-FMK分別與氯化兩面針堿或順鉑聯(lián)用時(shí)，可部分拮抗氯化兩面針堿或順鉑對(duì)H1688和H446細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。以上結(jié)果表明，氯化兩面針堿對(duì)H1688和H446細(xì)胞凋亡的抑制作用可被凋亡抑制劑Z-VAD-FMK部分拮抗；結(jié)合“3.4”部分的結(jié)果，我們推測氯化兩面針堿可誘導(dǎo)人SCLC細(xì)胞發(fā)生caspases酶依賴的細(xì)胞凋亡。

Fig 8 Effect of apoptosis inhibitor Z-VAD-FMK on apoptosis of H1688 and H446 cells induced by nitidine chloride or A：Nitidine chloride 0.5 μmol·L-1; B:Nitidine chloride 1 μmol·L-1; C:DDP 15 μmol·L-1; D:Z-VAD-FMK 10 μmol·L-1; E:Nitidine chloride 0.75 μmol·L-1; F:Nitidine chloride 1.5 μmol·L-1. *P<0.05，**P<0.01 vs the Single drug group

2.7 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地抑制H1688 和H446細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)Akt作為PI3K/Akt信號(hào)通路中的主要功能靶點(diǎn)激酶，可作為Bcl-2蛋白的上游信號(hào)分子，并通過磷酸化Bcl-2進(jìn)而激活其下游的caspase-3[8]。如Fig 9所示，與0.1%DMSO處理的陰性對(duì)照組(Control)比較，用DDP 15 μmol·L-1處理后H1688和H446細(xì)胞p-PI3K和p-Akt水平降低。與陽性對(duì)照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，H1688和H446細(xì)胞p-PI3K和p-Akt水平顯著降低。以上結(jié)果表明，氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地抑制H1688和H446細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)。

Fig 9 Expression of p-PI3K and p-Akt protein in H1688 and H446 cells inhibited by nitidine chloride in a dose-dependent *P<0.05，**P<0.01 vs Control

3 討論

SCLC因其具有早期轉(zhuǎn)移傾向、快速分裂、免疫逃逸、躲避凋亡等特點(diǎn)，導(dǎo)致臨床極差的預(yù)后[9]。順鉑作為SCLC的一線化療藥，由于順鉑毒性大、不良反應(yīng)較多，限制了其臨床應(yīng)用和療效[10]。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是腫瘤藥理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究中通過將順鉑作為陽性對(duì)照藥與氯化兩面針堿進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿能以更小的劑量(5 μmol·L-1)誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示其可作為一種更高效的具有抗SCLC潛力的藥物。

包括民族藥在內(nèi)的中草藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥和創(chuàng)新藥物研發(fā)的寶貴資源，許多中藥及其有效成分具有良好的抗腫瘤活性。氯化兩面針堿作為一種中藥單體已被證明具有較強(qiáng)的抗非小細(xì)胞肺癌活性，其作用機(jī)制主要是通過下調(diào)Hippo通路相關(guān)蛋白MOB-1、LATS-1、YAP的表達(dá)從而產(chǎn)生抗NSCLC作用[11]。而氯化兩面針堿能否通過誘導(dǎo)凋亡來發(fā)揮抗SCLC作用，目前仍不清楚。本文旨在研究氯化兩面針堿作用于小細(xì)胞肺癌的機(jī)制。

我們通過HE染色和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，與順鉑相似，氯化兩面針堿可誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞數(shù)量明顯減少并升高凋亡率。caspase-3作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，其被激活后，在大量自由基和氧化劑存在的情況下會(huì)激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly ADP-ribose polymerase 1，PARP-1)，引起ATP的過度消耗，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。Bcl-2家族作為凋亡信號(hào)通路的開關(guān)，可激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究中我們通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),氯化兩面針堿可升高Bax并抑制Bcl-2，使cleaved-caspase-3及PARP的表達(dá)增加，提示氯化兩面針堿對(duì)H1688和H446細(xì)胞的促凋亡作用可能與調(diào)控Bcl-2家族蛋白表達(dá)，激活caspase-3及PARP有關(guān)。

PI3K/Akt通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，目前針對(duì)這一信號(hào)通路已有臨床研究正在開展，如目前正在開展臨床Ⅰ期實(shí)驗(yàn)的PI3K抑制劑BKM120，與順鉑和依托泊苷聯(lián)用可延緩耐藥的發(fā)生；正在開展臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)的Akt抑制劑MK-2206，可應(yīng)用于小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌和胸腺等惡性腫瘤[13]。近年來研究表明，具有抗腫瘤活性的中藥活性成分或單體可通過調(diào)控PI3K/Akt通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)萼甲素可通過抑制PI3K和Akt的磷酸化來誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可抑制PI3K和Akt的磷酸化，因此,我們推測氯化兩面針堿誘導(dǎo)SCLC發(fā)生的凋亡可能與抑制PI3K和Akt的磷酸化，升高Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2進(jìn)而激活caspase-3及PARP有關(guān)。

值得注意的是，抗凋亡抑制劑Z-VAD-FMK并不能完全拮抗氯化兩面針堿或順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。研究表明，順鉑除了可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡外，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[15]、焦亡[16]、程序性壞死[17]等死亡方式來發(fā)揮抗癌作用。中藥包括中藥活性單體具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的抗癌特性，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡、脹亡等多種死亡方式來發(fā)揮抗癌作用[18]。近年來，鐵死亡、焦亡、壞死、自噬性死亡等多種非凋亡性死亡的發(fā)現(xiàn)為闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和抗癌藥物的研究提供了新思路和新的治療靶點(diǎn)。目前,關(guān)于氯化兩面針堿引起細(xì)胞發(fā)生除凋亡外的其他死亡方式鮮有報(bào)道。因此，我們推測氯化兩面針堿除了誘導(dǎo)凋亡，還可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生其他死亡來發(fā)揮抗SCLC作用。

綜上所述，氯化兩面針堿可誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K和Akt 的磷酸化，升高Bax、抑制Bcl-2的表達(dá)進(jìn)而激活caspase-3及PARP有關(guān)。我們還將進(jìn)一步研究氯化兩面針堿是否還通過誘導(dǎo)其他死亡方式發(fā)揮抗腫瘤作用及其具體機(jī)制，從而為廣西特色抗腫瘤民族藥的開發(fā)和利用提供新的依據(jù)和思路。